黃燕，鄒天駿，羅雪菲，鐘振國，蘭太進(jìn)

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530200；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)科學(xué)實驗中心，廣西 南寧 530200

中藥在腫瘤的治療和預(yù)防中發(fā)揮著重要作用，具有多靶點和低毒性的特點[1-2]。余甘子Phyllanthus emblicaL.是大戟科Euphorbiaceae 葉下珠屬Phyllanthus落葉小喬木或灌木，在我國分布廣泛，資源豐富。全世界約有17 個國家的傳統(tǒng)藥物體系中使用了余甘子，我國約有16 個民族使用該藥[3]，其被2015 年版《中華人民共和國藥典》收載，以果實入藥[4]。在民間，余甘子常用于治療膽道疾病、支氣管炎、糖尿病等，也以根和葉入藥[5]。研究表明，余甘子葉具有廣泛的藥理活性[6]。目前認(rèn)為黃酮類是余甘子葉的主要活性成分，并已鑒定出多種黃酮類化合物[7]。余甘子葉總黃酮（total flavonoids fromPhyllanthus emblicaleaves，TFPL）可抑制多種腫瘤的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡[8-9]，但其調(diào)控機制和活性成分尚不甚清楚。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，系統(tǒng)探究TFPL抗結(jié)直腸癌的分子機制及效應(yīng)物質(zhì)，為后續(xù)研究提供參考。

1 儀器、試藥與細(xì)胞

Impact Ⅱ型超高分辨四級桿飛行時間質(zhì)譜儀，美國Bruker Daltonic；Waters 2695-2489 高效液相色譜儀，美國Waters；SynergyTMH1 型多功能微孔檢測儀，美國BioTek Instruments；3131 型二氧化碳培養(yǎng)箱，賽默飛世爾科技（中國）；STR16 型臺式冷凍離心機，美國Thermo；BSA224S 型分析天平，北京賽多利斯；Omni-G 型獨立超純水系統(tǒng)，廈門銳思捷；SCQ-6201型超聲波清洗儀，上海聲彥；UV-2550 型紫外可見分光光度計，日本島津；RE-5203 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮；YRDC-0515 型低溫恒溫槽，上海亞榮；DHG-9203A 型電熱恒溫干燥箱，上海齊欣；HWS-24型水浴鍋，上海一恒。

余甘子葉采自廣西邕寧縣，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)劉壽養(yǎng)教授鑒定為大戟科葉下珠屬植物余甘子Phyllanthus emblicaL.的干燥葉。1640 不完全培養(yǎng)基，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號KG 038784；胎牛血清，浙江天杭科技股份有限公司，批號18 070503；MTS，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號20 190304；無水乙醇，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號20 161212；甲醇（分析純），成都科隆化學(xué)品有限公司，批號2018 030801；甲醇（色譜純），賽默飛世爾科技（中國）有限公司，批號 178512；DMSO，美國SIGMA-ALDRICH 公司，批號SHBG3288V；水為超純水，其他試劑均為分析純。

人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞COLO 320DM、DLD-1 均購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，正常結(jié)直腸細(xì)胞NCM460 購自上海酶研生物科技有限公司。

2 方法

2.1 余甘子葉總黃酮制備

2.1.1 粗提取

取余甘子葉適量，粉碎成粗粉，加95%乙醇浸泡48 h 后進(jìn)行滲漉，收集滲漉液；藥渣干燥，加50%乙醇浸泡48 h，加同濃度乙醇進(jìn)行滲漉，收集滲漉液。合并2 次滲漉液，減壓濃縮，回收乙醇，得到濃縮液[10]。

2.1.2 純化

將D101 大孔吸附樹脂用95%乙醇浸泡24 h，使其充分膨脹，用蒸餾水洗至無漂浮物，濕法裝柱，沉淀24 h，濃縮液經(jīng)溫水溶解后上柱，吸附2 h，用蒸餾水洗脫，至洗脫液澄清透明，再依次用30%、50%、70%乙醇進(jìn)行洗脫，洗脫液顏色變淺后，換梯度洗脫，洗脫液與鹽酸-鎂粉呈陽性反應(yīng)后開始收集洗脫液。將收集的各梯度洗脫液混合，減壓濃縮。用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯層。減壓濃縮，干燥處理成粉末，即得TFPL[10]。

2.2 細(xì)胞增殖實驗

2.2.1 細(xì)胞種板

取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化，得到單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)后調(diào)整至所需細(xì)胞量，置50 mL 離心管，加入培養(yǎng)基，定容至所需細(xì)胞懸液體積。吸取細(xì)胞懸液加入96 孔板，每孔100 μL，靜置30 min 后移至細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育。

2.2.2 藥液配制

稱取TFPL 適量，加入DMSO，超聲溶解，制成0.05 g/mL 貯備液。吸取一定量貯備液，加入培養(yǎng)基，配成一定濃度藥物母液，350 W、25 kHz 超聲1 h。取母液，0.22 μm 針孔濾頭過濾2 次。等度稀釋法配制各濃度藥液。

吸取一定量DMSO，加入培養(yǎng)基，制成不同濃度（0.1%、0.2%、0.5%）DMSO 對照藥液，0.22 μm 針孔濾頭過濾1 次。

2.2.3 分組與給藥

分為7 個藥物濃度組（22.5、45、62.5、90、125、180、250 μg/mL）及空白對照組、DMSO 對照組。每組4 個復(fù)孔，每個給藥組另設(shè)2 個調(diào)零孔。種板第3日，吸出96 孔板中細(xì)胞培養(yǎng)液，加入100 μL 相應(yīng)藥液，于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育。

2.2.4 指標(biāo)檢測

給藥24、48、72 h，每孔加入10 μL MTS，孵育2 h，于波長490 nm 處檢測各孔光密度（OD），計算相對細(xì)胞活力（OD實驗組÷OD對照組×100%）。采用Excel2013 計算IC50。

2.3 余甘子葉總黃酮成分分析

采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）。

色譜條件：采用Agilent C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為0.5%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～10 min，5%～10%B；10～10.01 min，10%～12%B；10.01～20 min，12%～13% B；20～30 min，13%B；30～60 min，13%～21%B），柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，檢測波長254 nm，進(jìn)樣量5 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子模式，毛細(xì)管電壓3 500 V，霧化氣壓力2 bar，干燥氣流速8.0 L/min，干燥氣溫度200 ℃；掃描模式為全掃描和auto ms/ms 掃描，掃描范圍（m/z）50～1 300。

結(jié)合一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜碎片離子信息，依據(jù)文獻(xiàn)檢索結(jié)果，通過與Scifinder、Massbank、Chemspider數(shù)據(jù)庫進(jìn)行峰匹配檢索，初步鑒定得到TFPL 化合物成分信息。

2.4 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.4.1 余甘子葉總黃酮成分-靶點關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取TFPL 化學(xué)成分的Smile 數(shù)據(jù)，輸入ChemMapper 數(shù)據(jù)庫（http://lilab-ecust.cn/chemmapper），獲得各成分相關(guān)靶點，通過Cytoscape3.7.1 軟件構(gòu)建TFPL 成分-靶點關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

2.4.2 結(jié)直腸癌相關(guān)靶點收集

以“Colorectal Cancer”為關(guān)鍵詞檢索OMIM 數(shù)據(jù)庫（http://www.omim.org/），得到結(jié)直腸癌相關(guān)靶點，通過Cytoscape3.7.1 軟件構(gòu)建結(jié)直腸癌靶點網(wǎng)絡(luò)。

2.4.3 共有靶點篩選

比對TFPL 相關(guān)靶點與結(jié)直腸癌相關(guān)靶點，二者共有靶點即為TFPL 抗結(jié)直腸癌的潛在靶點。

2.5 分子對接

采用Sybyl X 2.0 軟件評價關(guān)鍵靶點受體與化合物配體之間的結(jié)合能力。首先在PubChem 數(shù)據(jù)庫中搜索得到化合物sdf 格式的結(jié)構(gòu)，使用Open Babel GUI 軟件將其轉(zhuǎn)化為mol2 格式，導(dǎo)入Sybyl X 2.0 軟件，進(jìn)行能量優(yōu)化并保存為mol2 格式文件。然后通過Protein Data Bank 數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）搜索蛋白晶體結(jié)構(gòu)并下載PDB 格式文件，導(dǎo)入Sybyl X 2.0 軟件，對目標(biāo)蛋白進(jìn)行去除水分子、加氫原子等結(jié)構(gòu)優(yōu)化，并找到靶點蛋白的對接活性位點。最后將化合物配體與蛋白質(zhì)受體相互作用，對接完成后通過所得的Total Score 評價配體與受體的結(jié)合作用，評分＞6.0 認(rèn)為化合物與靶點具有較好的結(jié)合能力，以此篩選TFPL 抗結(jié)直腸癌的可能有效成分，使用PyMOL1.5.0.3 軟件繪制對接結(jié)果示意圖。

3 結(jié)果

3.1 余甘子葉總黃酮對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響

TFPL 對COLO 320DM、DLD-1 細(xì)胞均具有較好的抑制增殖作用。TFPL 分別作用24、48、72 h，對COLO 320DM 細(xì)胞的IC50值分別為60.46、36.23、23.87 μg/mL，對DLD-1 細(xì)胞的IC50值分別為157.28、95.97、49.72 μg/mL。對正常結(jié)直腸細(xì)胞NCM460 則無明顯抑制作用，IC50＞250 μg/mL。見圖1。

圖1 TFPL 對COLO 320DM、DLD-1、NCM460 細(xì)胞增殖的影響

3.2 余甘子葉總黃酮化學(xué)成分

初步鑒定得到TFPL 化學(xué)成分12 個（見表1），DAD 掃描圖和一級質(zhì)譜總離子流圖見圖2。

圖2 TFPL 樣品LC-MS/MS 圖

表1 TFPL 化學(xué)成分LC-MS/MS 鑒定結(jié)果

3.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果

通過ChemMapper 數(shù)據(jù)庫收集到TFPL 中10 個成分對應(yīng)的100 個靶點，Corilagin 和Chebulinic acid無相關(guān)靶點數(shù)據(jù)，結(jié)果見表2。去重后得到51 個靶點，成分-靶點網(wǎng)絡(luò)見圖3。通過OMIM 數(shù)據(jù)庫收集到結(jié)直腸癌相關(guān)靶點192 個，見圖4。通過比對篩選出TFPL 成分和結(jié)直腸癌疾病共有靶點EGFR，提示TFPL 抗結(jié)直腸癌作用的潛在靶點為EGFR。

表2 TFPL 成分及相關(guān)靶點

圖3 TFPL 成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

圖4 結(jié)直腸癌相關(guān)靶點網(wǎng)絡(luò)

3.4 分子對接結(jié)果

EGFR 與Quercetin、Kaempferol 能夠較好地結(jié)合（見圖5、表3），這2 個化學(xué)成分可能是TFPL 抗結(jié)直腸癌的潛在活性成分。

表3 EGFR 與潛在活性成分對接得分

圖5 EGFR 與Quercetin、Kaempferol 分子對接示意圖

4 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)建立在高通量組學(xué)數(shù)據(jù)分析、計算機虛擬計算及網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫檢索基礎(chǔ)上，從藥物-靶點-疾病相互作用的整體性和系統(tǒng)性出發(fā)，采用復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)模型表達(dá)和分析研究對象的藥理學(xué)性質(zhì)。相關(guān)數(shù)據(jù)庫的建立和完善是網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)得以迅速發(fā)展的基礎(chǔ)，一系列用于網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析的算法、軟件為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)模型直觀表達(dá)和數(shù)據(jù)分析提供了有力保障。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)概念與中藥及其有效組分多層次、多靶點的機制契合度較高，適宜研究中藥多成分-多靶點的作用關(guān)系，有利于揭示中藥及其有效組分的復(fù)雜作用機制[11]。

本研究通過LC-MS/MS 鑒定獲得了TFPL 的12個化合物。利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，篩選得出EGFR 可能是參與TFPL 抗結(jié)直腸癌作用的核心靶點。EGFR是一種跨膜蛋白，其過表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[12]。通過阻斷EGFR 在受體胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)合位點，或抑制細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶活性，均可阻斷EGFR信號傳導(dǎo)，從而阻止腫瘤的生長[13]。分子對接結(jié)果顯示，TFPL 中的2 個成分Quercetin、Kaempferol 可與EGFR 很好結(jié)合，進(jìn)一步表明EGFR 可能是TFPL 抗結(jié)直腸癌的作用靶點。Quercetin 作為一種潛在的抗腫瘤藥物已引起廣泛關(guān)注，其機制包括抗氧化和抑制激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等，其中包括EGFR[14]。Kaempferol 具有廣泛的生物學(xué)特性，與EGFR 具有較強的結(jié)合能力[15]，對包括結(jié)腸癌在內(nèi)的多種癌細(xì)胞具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期的作用[16]。

綜上所述，TFPL 可能通過其活性成分Quercetin、Kaempferol 作用靶點EGFR，達(dá)到抗結(jié)直腸癌作用，本研究可為余甘子葉的進(jìn)一步臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究提供參考。