哈艷平，劉曉曉，邵鐘銘，鄒 園，伍彩霞，郭峻莉,3，申志華，揭 偉,,3

骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSC)是屬于多潛能分化干細胞，在再生醫(yī)學研究領域被廣泛應用[1-2]。盡管BMSC體外培養(yǎng)過程中可被誘導多向分化，但體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)其定向分化效果不佳。BMSC移植參與組織損傷獲益的機制可能與其旁分泌有關(guān)[3]。BMSC所處的骨髓微環(huán)境為低氧狀態(tài)。低氧可以有效的刺激移植的BMSC表現(xiàn)出適應性反應，參與靶組織的定向轉(zhuǎn)運和歸巢，從而提高組織損傷的干細胞治療效果[4]。低氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)通過與低氧反應元件結(jié)合而調(diào)節(jié)下游靶基因的表達，是介導低氧反應的核心因子，在心肌損傷保護中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5]。本課題組前期也證實低氧刺激可以通過上調(diào)ROCK信號促進BMSC的增殖和旁分泌[6]。心肌素(Myocardin)是心肌細胞和平滑肌細胞分化過程中的特異性轉(zhuǎn)錄共激活因子[7]，也是維持心臟結(jié)構(gòu)完整性，心肌細胞存活和心臟功能所必需的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[8-9]。有研究顯示低氧可以通過RhoA/Rho和ERK信號而誘導未成熟心肌細胞中Myocardin表達增加[10]，但低氧刺激在干細胞生物學中的機制仍不明確。本實驗旨在以c-Kit+BMSC為對象，分析低氧誘導BMSC向心肌細胞分化過程中對Myocardin表達的影響、作用及調(diào)節(jié)機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑 Sprague Dawley大鼠間充質(zhì)干細胞專用培養(yǎng)基(廣州賽業(yè)公司)；胎牛血清(Gibco公司)；Myocardin啟動子過表達質(zhì)粒(-1 243 bp～+217 bp)及陰性對照啟動子質(zhì)粒、突變型HIF-1α過表達慢病毒顆粒及陰性對照過表達病毒顆粒(廣州復能公司)；LIF因子(Prospec公司)；Myocardin shRNA慢病毒(靶序列，GATGCATTTGCCTTT GAAGAT)及陰性對照病毒顆粒[11](上海吉凱公司)；Myocardin抗體(Sigma公司)；cTnT抗體(Cell signaling公司)；Trizol(Ambion公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)；Real-time PCR試劑盒(GeneStar公司)；PCR引物(上海生工公司)；Lipofectamine 3000(ThermoFisher公司)；Secrete-PairTM雙熒光素酶活性檢測試劑盒(廣州復能公司)。

1.1.2實驗動物 雄性SPF級Sprague Dawley大鼠5只，鼠齡6周，由廣東醫(yī)科大學動物實驗中心提供，動物合格證號：SYXK(粵)2013-0002。大鼠飼養(yǎng)于25 ℃、濕度50%、12 h明暗交替光照環(huán)境中。實驗過程對動物的處置符合動物倫理學規(guī)定。

1.2 方法

1.2.1Sprague Dawley大鼠c-Kit+BMSC的分選、鑒定及培養(yǎng) 參考本課題組前期方法進行[12]。應用密度梯度離心法從Sprague Dawley大鼠股骨全骨髓細胞中獲得單個核細胞，采用免疫磁珠分選法獲得c-Kit+細胞亞群，流式細胞術(shù)鑒定c-Kit+細胞的純度。獲得的細胞用大鼠BMSC專用培養(yǎng)基培養(yǎng)(含15%胎牛血清、100 U/mL LIF、100 U/mL青霉素、0.1 μg/mL鏈霉素)重懸，置于37 ℃、飽和濕度、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第3代細胞用于成脂和成骨分化的功能驗證，取第4～5代細胞用于相關(guān)實驗。

1.2.2慢病毒感染c-Kit+BMSC 實驗分為4組：過表達陰性對照慢病毒組(NC-lent)、突變型HIF-1α過表達慢病毒組(HIF-1α-ov-lent)、陰性對照干擾慢病毒組(NC-shRNA-lent)和Myocardin干擾慢病毒組(Myocardin-shRNA-lent)。c-Kit+BMSC以1×105個/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h貼壁后，細胞匯合度達70%時，0.5 mL polybrene(5.0 μg/mL)病毒工作液稀釋各組病毒，以感染復數(shù)為100感染細胞，2 h后每孔加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液2 mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后換液，每3天換液1次。感染第3天熒光顯微鏡下觀察增強型綠色熒光蛋白的表達以判斷感染效率，至預定時間點收獲細胞用于相關(guān)實驗。

1.2.3低氧處理c-Kit+BMSC c-Kit+BMSC以1×105個/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h貼壁后將細胞置于三通低氧培養(yǎng)箱中(2%O2、5%CO2、93% N2)連續(xù)培養(yǎng)，每3天換液1次，至預定時間點收獲細胞分析目的基因表達。以細胞置于常氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)作為對照(20%O2，5%CO2)。

1.2.4定量RT-PCR 用Trizol提取細胞總RNA，取1.0 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，所得cDNA稀釋5倍后進行定量PCR檢測。PCR反應體系20.0 μL，含2×RealStar Green Fast Mixture with ROX 10.0 μL，引物(上游、下游)0.4 μL，cDNA 2.0 μL和DEPC水7.2 μL。PCR程序：95 ℃預變性2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，合計40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參照，分析HIF-1α、Myocardin、心肌分化標記Nkx2.5和cTnT的表達，結(jié)果以2-ΔΔCt表示。PCR使用的引物見表1。

1.2.5免疫熒光染色 細胞爬片經(jīng)固定、PBS洗滌后滴加0.5%胎牛血清白蛋白，室溫封閉30 min，滴加抗Myocardin和cTnT一抗(均按1 ∶100稀釋)，4 ℃孵育過夜，PBS沖洗3次，滴加TRITC-或FITC-標記熒光二抗(1 ∶100稀釋，武漢三鷹公司)，37 ℃避光孵育40 min，PBS沖洗3次，DAPI復染細胞核，37 ℃避光10 min，PBS洗滌后用抗熒光淬滅封片劑封固，激光共聚焦顯微鏡(Leica，TCS SP5Ⅱ)下觀察并拍照。

1.2.6雙熒光素酶報告基因法檢測HIF-1α對Myocardin啟動子活性的影響 實驗分為3組：空白質(zhì)粒對照組(空白啟動子質(zhì)粒PG04組)、HIF-1α過表達慢病毒和陰性對照啟動子質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組(HIF-1α+NC-Promoter)、HIF-1α過表達慢病毒和Myocardin啟動子過表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組(HIF-1α+Myocardin-Promoter)。將293T細胞(本實驗室保存)接種于24孔板中，過夜孵育后按感染復數(shù)20感染HIF-1α過表達慢病毒顆粒，3天后再以Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染啟動子質(zhì)粒(每孔2.5 μg)，分別于轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后24、48 h收集細胞培養(yǎng)液上清，采用Secrete-Pair雙熒光素酶活性檢測試劑盒分析Gluc與SEAP熒光素酶活性數(shù)據(jù)，以Gluc/SEAP比值代表Myocardin啟動子活性。每組重復3孔。

1.3 統(tǒng)計學分析采用GraphPad 8.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(Mean±SD)表示。組間比較采用非配對t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 過表達HIF-1α誘導Myocardin和心肌細胞譜系分化基因表達慢病毒顆粒以感染復數(shù)為100感染c-Kit+BMSC，3天后在熒光顯微鏡下觀察到90%以上的細胞有GFP熒光信號(圖1A)。感染7天后收獲細胞，定量RT-PCR結(jié)果顯示，與NC-lent組相比，HIF-1α-ov-lent組HIF-1α和Myocardin的mRNA水平均明顯升高，同時心肌細胞譜系分化基因Nkx2.5和cTnT的mRNA表達也顯著升高(P均<0.001，圖1B)。

圖1 過表達外源性HIF-1α誘導Myocardin和心肌譜系分化基因表達：A.c-Kit+ BMSC感染外源性HIF-1α過表達慢病毒效果，標尺=100 μm；B.c-Kit+BMSC感染外源性HIF-1α過表達慢病毒7天后定量RT-PCR檢測HIF-1α、Myocardin和心肌譜系分化基因Nkx2.5和cTnT mRNA的表達，***P<0.001

2.2 物理性低氧刺激誘導HIF-1α和Myocardin表達物理低氧處理c-Kit+BMSC 0、1、7、14天后，采用定量RT-PCR檢測HIF-1α和Myocardin mRNA，發(fā)現(xiàn)與常氧組相比，低氧組HIF-1α和Myocardin表達1天、7天均顯著升高(P均<0.05)，14天時雖然較常氧組水平升高但差異無統(tǒng)計學意義(圖2A)。進一步應用免疫熒光檢查7天組細胞中Myocardin蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)BMSC中Myocardin明顯表達并主要定位于胞核(圖2B)。

圖2 物理性低氧誘導HIF-1α和Myocardin表達：A.定量RT-PCR檢測HIF-1α和Myocardin mRNA的表達；與對應常氧組相比，*P<0.05，**P<0.01；B.免疫熒光染色檢測低氧刺激7天后c-Kit+ BMSC中Myocardin蛋白的表達

2.3 體外低氧刺激有效誘導c-Kit+BMSC心肌細胞樣分化c-Kit+BMSC經(jīng)物理性低氧和常氧刺激后，以0天為對照，發(fā)現(xiàn)低氧組心肌細胞譜系分化標志基因Nkx2.5、cTnT在7天時均較常氧組顯著升高(P均<0.01)。免疫熒光結(jié)果也證實低氧7天后c-Kit+BMSC明顯表達cTnT蛋白，陽性信號定位于胞質(zhì)(圖3)。

圖3 物理性低氧刺激誘導c-Kit+ BMSC心肌細胞分化基因表達：定量RT-PCR檢測心肌細胞分化相關(guān)基因Nkx2.5和cTnT mRNA的表達；與對應常氧組相比，**P<0.01；B.免疫熒光染色檢測低氧刺激7天后c-Kit+ BMSC中cTnT蛋白的表達

2.4 干擾Myocardin后減弱低氧誘導的心肌細胞樣分化c-Kit+BMSC以感染復數(shù)為100感染Myocardin-shRNA-lent，病毒感染細胞3天后再繼續(xù)低氧刺激7天后發(fā)現(xiàn)，干擾慢病毒感染后能有效下調(diào)Myocardin水平(P<0.001)，同時伴隨心肌細胞譜系分化基因Nkx2.5(P<0.01)和cTnT(P<0.05)表達下調(diào)(圖4)。

圖4 干擾Myocardin后抑制低氧誘導的c-Kit+ BMSC心肌細胞分化基因表達：A.Myocardin特異性shRNA慢病毒感染c-Kit+ BMSC效果；B.定量RT-PCR檢測Myocardin和心肌細胞分化相關(guān)基因Nkx2.5和cTnT mRNA的表達；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.5 HIF-1α直接上調(diào)Myocardin啟動子活性293T細胞轉(zhuǎn)染各組質(zhì)粒后，以常氧狀態(tài)下PG04組為對照，24 h和48 h的HIF-1α+Myocardin-Promoter組熒光素酶比值較HIF-1α+NC-Promoter組均明顯增高，倍數(shù)分別可達3.65±0.6及5.55±0.84(P均<0.01)；48 h后的Myocardin啟動子活性強于轉(zhuǎn)染24 h組(P<0.05，圖5)。

圖5 雙熒光素酶報道基因法檢測HIF-1α對Myocardin啟動子的激活效應：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

組織損傷后局部處于低氧微環(huán)境，如心肌梗死后梗死灶與正常心肌組織相比，其局部氧分壓濃度顯著下降。移植的BMSC由常氧狀態(tài)下轉(zhuǎn)為低氧狀態(tài)下，其分化潛能的變化是本組分析的重點。為闡明低氧對BMSC心肌細胞譜系分化的影響及機制，本組從體外實驗角度進行探索。

本實驗在有效獲得c-Kit+BMSC的基礎上，發(fā)現(xiàn)HIF-1α過表達慢病毒感染c-Kit+BMSC時觀察到明顯的GFP信號伴隨HIF-1α mRNA升高，提示慢病毒感染成功。在外源性HIF-1α表達升高的同時也檢測到Myocardin表達升高，初步提示HIF-1α對Myocardin表達具有正向的表達調(diào)控作用。本實驗感染的慢病毒攜帶HIF-1α基因為突變型，具體為HIF-1α蛋白編碼區(qū)第402和564位脯氨酸(P)均突變?yōu)楸彼?A)，該突變型HIF-1α可保證在常氧條件下的穩(wěn)定性同時又保留其功能活性[13]。隨后在物理性低氧條件下，本組同樣觀察到HIF-1α表達增加，在低氧處理1天內(nèi)HIF-1α水平迅速上升，至7天時仍維持較高水平，進一步證實了HIF-1α是低氧刺激的反應因子。伴隨HIF-1α表達上升，本組觀察到Myocardin蛋白表達和細胞內(nèi)定位情況。

本組和其他前期實驗證實，BMSC在合適的誘導條件下可向心肌細胞譜系分化[14-16]。為證實低氧可刺激c-Kit+BMSC向心肌細胞譜系分化，本組選擇了多個心肌細胞譜系分化標記基因進行檢測。Nkx2.5為心肌細胞分化、發(fā)育早期轉(zhuǎn)錄因子，而肌鈣蛋白cTnT為成熟心肌細胞的標志物，綜合檢測這些因子的表達為判斷干細胞的心肌細胞譜系分化提供了參考[17-18]。本組證實，無論是過表達外源性HIF-1α還是物理性低氧刺激，均可有效誘導心肌細胞分化相關(guān)基因的表達。本組還注意到，在處理7天時低氧組較常氧組上述心肌細胞譜系分化標志基因均顯著表達，但常氧組在一定程度上表達也上調(diào)，提示常氧條件下BMSC可能存在一定程度的自我分化可能，提示干細胞體外培養(yǎng)過程中需要常規(guī)添加抑制分化的因子如LIF。這種自我分化的原因很可能與高密度培養(yǎng)時干細胞旁分泌導致的某些信號活化有關(guān)[19]。免疫熒光染色進一步發(fā)現(xiàn)cTnT在低氧誘導7天組顯著表達，提示了低氧刺激對BMSC心肌細胞樣分化是有效的。

Myocardin在心肌細胞分化過程中起重要作用。本實驗通過過表達HIF-1α和物理性低氧刺激均觀察到Myocardin表達升高。有趣的是，當應用Myocardin特異性干擾慢病毒穩(wěn)定感染c-Kit+BMSC后再次進行低氧刺激，心肌細胞譜系分化基因的表達得到一定程度的抑制。這一結(jié)果證實了Myocardin在BMSC向心肌細胞分化過程中的重要作用。有關(guān)Myocardin與心肌細胞分化的關(guān)系已有較多文獻報道[7-8]。Myocardin主要與血清反應因子組成轉(zhuǎn)錄復合物，介導啟動子上具有CArG序列的下游基因的轉(zhuǎn)錄激活，而具有CArG序列的基因主要是心肌細胞和平滑肌細胞分化相關(guān)基因[7,20]。本組注意到，干擾Myocardin后并不能完全抑制心肌細胞分化相關(guān)因子Nkx2.5和cTnT的表達，提示還存在其他調(diào)節(jié)機制的可能。事實上，Myocardin轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)家族包括了Myocardin及其相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子A(MRTF-A)和B(MRTF-B)，該家族與心血管疾病的關(guān)系已有較多報道[21]。進一步闡明介導干細胞向心肌細胞分化的調(diào)節(jié)機制具有重要的生物學意義。

在乳鼠心肌細胞中，低氧刺激主要通過ERK信號和Angiotensin Ⅱ信號上調(diào)Myocardin表達[22]。本組及多個實驗室證實，在低氧刺激的肺動脈平滑肌細胞中Myocardin表達下降[11,23]，而在腦動脈平滑肌細胞中低氧刺激Mycoardin卻表達上調(diào)[24]。上述結(jié)果提示低氧刺激對Myocardin表達的影響可能有細胞和環(huán)境的依賴性。本實驗采用雙熒光素酶報道基因活性實驗，證實HIF-1α可直接上調(diào)Myocardin啟動子活性。這一結(jié)果對低氧調(diào)節(jié)Myocardin的分子機制作了新的補充。

關(guān)于c-Kit是否可作為干細胞的標志物已有相關(guān)的報道[25]。c-Kit與干細胞因子(SCF)結(jié)合后，活化的SCF/c-Kit信號具有重要的生物學功能[26]。本實驗分離的c-Kit+BMSC作為表型相對“單一”的細胞群，相對于整體表型不均一的BMSC而言可能在細胞生物學方面具有一定的優(yōu)勢，這在前期研究中已經(jīng)進行了討論[6]。

總之，本實驗發(fā)現(xiàn)低氧刺激可有效誘導c-Kit+BMSC向心肌細胞譜系分化，其機制與低氧通過HIF-1α直接調(diào)控Myocardin表達上調(diào)有關(guān)。盡管BMSC移植治療心肌梗死等缺血性心肌病當前還有很多問題需要解決[27]，但本實驗拓展了BMSC分化的相關(guān)理論基礎，為后期基于BMSC移植治療心肌損傷等缺血性心臟病提供了實驗依據(jù)。