李世雄，耿華，徐美林△

肺癌是呼吸系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。近年來由肺癌造成的死亡人數(shù)高于乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌和腦腫瘤死亡人數(shù)的總和［1］。由于不同地區(qū)醫(yī)療水平差異和患者的臨床病理分期不同，肺癌的5年生存率為4%~17%［2］。肺腺癌是最為常見的一種肺癌亞型，其發(fā)生發(fā)展的機制尚未完全闡明。長鏈非編碼RNA（LncRNA）是長度超過200個核苷酸，但不編碼蛋白質(zhì)的核酸序列。研究表明，lncRNA的紊亂與人類多種疾病密切相關(guān)，其中包括多種癌癥［3］。LncRNA腦胞質(zhì)RNA1（brain cytoplasmic RNA 1，BCYRN1）在食管癌［4］、乳腺癌、結(jié)直腸癌［5］和肝癌［6］等腫瘤中高表達。目前關(guān)于lncRNA BCYRN1在肺腺癌中作用機制的相關(guān)研究鮮見報道。本研究通過多種分子實驗技術(shù)探究BCYRN1對肺腺癌生物學(xué)惡性行為的影響，并結(jié)合肺腺癌數(shù)據(jù)庫探究BCYRN1表達與患者臨床病理特征以及預(yù)后的相關(guān)性，旨在探究BCYRN1在肺腺癌細(xì)胞中的表達情況及其對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

比較 PAC吸附和 Fenton試劑降解對 HHCB與AHTN的去除效果可以發(fā)現(xiàn)，在適宜的條件下，F(xiàn)enton試劑比PAC吸附對HHCB與AHTN的去除效果更好，但Fenton試劑反應(yīng)受pH值的影響更大。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細(xì)胞株 正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B購于上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)公司，293T細(xì)胞及肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1299由天津醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室孫保存課題組贈予。

海德堡對印刷未來圖景的描繪讓我們充滿遐想，忍不住追問，在中國何時能實現(xiàn)自主印刷？黃連光坦率表示，自主印刷在國內(nèi)只是剛開始，但是相信一定會迎來跳躍式的發(fā)展?！拔覀兂３e誤估計中國的發(fā)展速度，其實往往在其他國家需要花十幾二十年時間才能實現(xiàn)的事情，在國內(nèi)則會很短。當(dāng)然，這也是必然的發(fā)展方向?！?/p>

侵襲實驗：步驟大致同前，不同點是實驗前4 h需要在Transwell小室內(nèi)鋪一層稀釋比為1︰7的martigel膠，在培養(yǎng)箱內(nèi)水化。48 h后再固定染色。

1.1.3 實驗設(shè)備及儀器 10 cm培養(yǎng)皿、6孔板、12孔板、24孔板（Invitrogen），離心機（德國Eppendorf），搖床（德國Eppendorf，RT430），生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，BSC-600IIA2），微量移液器和槍頭（Thermo ScientificTMClipTipTM），純水機（法國Millipore，明澈-D 24 UV），紫外分光光度計（美國Molecular Devices，UPG-723），熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystem，ABI7500型），Transwell小室（康寧公司），普通光學(xué)顯微鏡（日本Nikon，Ts2/Ts2-FB），熒光顯微鏡（日 本Nikon，Ts2/Ts2-FL），流 式 細(xì) 胞 儀（美 國BD，F(xiàn)ACSCalibur）。

1.2 方法

2.2 轉(zhuǎn)染效率的檢測 與對照組相比，慢病毒感染后BCYRN1敲低組的BCYRN1表達水平明顯下降，見圖2。

1.2.2.5 職業(yè)技能訓(xùn)練:每周1次，每次 60 min。通過求職面試技能訓(xùn)練、開放模擬超市、蛋糕烘焙制作、包餛飩、做壽司、手工制作和環(huán)境保潔等勞動技能訓(xùn)練和外出社會實踐活動等方式，提高患者的勞動技能，改變患者的觀念，鼓勵患者做力所能及的事。

1.2.2 qPCR檢測BCYRN1在不同類型肺癌細(xì)胞系中表達 在細(xì)胞生長融合度達到80%時消化細(xì)胞，離心收集細(xì)胞沉淀。采用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，使用紫外分光光度計檢測各個樣本的濃度和純度。隨后通過反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，按照qPCR使用說明書進行擴增和熒光定量檢測。反轉(zhuǎn)錄條件：37℃15 min；85℃5 s；4℃保存。qPCR反應(yīng)條件：95℃30 s；95℃5 s，60℃30 s，共40個循環(huán)。每個樣本重復(fù)3次，最后所得到的數(shù)據(jù)經(jīng)過2-??Ct法分析處理。BCYRN1引物：上游5'-CTGGGCAATATAGCGAGAC-3'，下 游5'-TGCTTT?GAGGGAAGTTACG-3'；GAPDH引物：上游5'-GGAGCGA?GATCCCTCCAAAAT-3'，下游5'-GGCTGTTGTCATACTTCT?CATGG-3'。

直流側(cè)不平衡故障相當(dāng)有將系統(tǒng)的零電位從換流器上下橋臂中點移向故障點，從而引起交直流電壓的偏置。交流側(cè)變壓器由于流過直流電流而發(fā)生直流偏磁，影響變壓器的安全運行；直流電壓偏置將對設(shè)備的絕緣造成影響，但配網(wǎng)設(shè)備的絕緣水平相對容易提高。

2.4 BCYRN1敲低對細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響 實驗12 h和24 h后，BCYRN1敲低組劃痕愈合率均較對照組降低，見圖4。Transwell遷移實驗也顯示BCYRN1敲低組H1299細(xì)胞穿過小室的細(xì)胞顯著減少，見圖5。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實驗觀察細(xì)胞遷移能力 胰酶消化細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，計數(shù)相同的細(xì)胞數(shù)，接種于6孔板培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達到95%時，用槍頭在6孔板內(nèi)均勻劃線，PBS沖掉劃下的細(xì)胞，加入含2%血清的低濃度培養(yǎng)基。根據(jù)細(xì)胞生長速度分別于0、12、24 h拍照記錄至任意一組劃痕愈合。

1.2.6 Transwell實驗檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞遷移及侵襲能力 遷移實驗：胰酶消化細(xì)胞，離心后加入1 mL無血清培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，經(jīng)PBS稀釋后使細(xì)胞含量為1×105個/mL。24孔板加入600μL完全培養(yǎng)基，吸取200μL細(xì)胞懸液至Transwell小室，繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后，取出小室，用PBS小心沖洗，棉簽擦拭掉未穿過的細(xì)胞。用預(yù)冷過的甲醇固定細(xì)胞，PBS沖洗，再用0.4%結(jié)晶紫染色1 h，PBS沖洗。選取不同的視野拍照記錄。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基（凱基生物科技公司），胎牛血清（Gibco公司），胰酶、嘌呤霉素（Sigma公司），PBS緩沖液（中杉金橋生物技術(shù)有限公司），RNA提取試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒（天根生化公司），RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）檢測試劑盒（寶日醫(yī)生物技術(shù)公司），引物、慢病毒包裝試劑盒（吉凱基因化學(xué)技術(shù)公司），BCYRN1敲低和對照質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染試劑lipfit3.0（漢恒生物科技公司），碘化丙啶染色液、結(jié)晶紫染色液（碧云天生物技術(shù)有限公司），聚凝胺Polybrene（索萊寶科技有限公司），基質(zhì)膠Matrigel（美國Becton&Dickinson公司）。

2.3 BCYRN1對肺癌細(xì)胞周期和凋亡的影響 G1/G0峰到G2/M峰之間為細(xì)胞周期S期，G1/G0峰之前有小段的凋亡峰，見圖3。BCYRN1敲低組的S期細(xì)胞百分比和細(xì)胞凋亡率均高于對照組，見表1。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用IBM SPSS Statistics 24軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，2組樣本間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，χ2檢驗分析BCYRN1表達與臨床病理特征的關(guān)系，Cox回歸分析BCYRN1表達與患者預(yù)后的關(guān)系，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BCYRN1在肺腺癌細(xì)胞A549、H1299中的表達 與正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B相比，LncRNA BCYRN1在肺腺癌細(xì)胞內(nèi)高表達（P＜0.05）。BCYRN1在A549細(xì)胞的表達水平約為BEAS-2B細(xì)胞的3倍，BCYRN1在H1299細(xì)胞的表達水平約為BEAS-2B細(xì)胞的11倍，見圖1。因此選用H1299細(xì)胞進行后續(xù)細(xì)胞功能實驗。

1.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染以及慢病毒感染目的細(xì)胞 計數(shù)相同數(shù)量的H1299細(xì)胞，分為實驗組和對照組，分別轉(zhuǎn)染BCYRN1敲低及對照質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染前2 h將293T細(xì)胞培養(yǎng)基更換為Opti-MEM培養(yǎng)基，取慢病毒載體質(zhì)粒、Lenti-Easy Packaging Mix和Opti-MEM混合為A液；Lipfit 3.0和Opti-MEM混合為B液，兩者混合形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。轉(zhuǎn)染體系加入293T培養(yǎng)液中，8 h后換為正常DMEM培養(yǎng)基。48~72 h收集細(xì)胞上清，離心、過濾、純化收集病毒液。感染目的細(xì)胞時，目的細(xì)胞換為融合度為50%~60%的6孔板，每孔加入2 mL含有熱滅活血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜，第2天換液加入慢病毒液、完全培養(yǎng)基、Polybrene，晃動混勻后培養(yǎng)12 h，隨后換為正常培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染效率通過質(zhì)粒內(nèi)的綠色熒光檢測，經(jīng)嘌呤霉素篩選后獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的目的細(xì)胞株。

Fig.1 Expression levels of BCYRN1 in lung cancer cells and normal lung epithelium cells圖1 BCYRN1在肺腺癌細(xì)胞及正常肺上皮中的表達水平

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 肺腺癌細(xì)胞A549、H1299和正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B用相適應(yīng)的培養(yǎng)基加入10%胎牛血清，在37℃、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長密度適時進行細(xì)胞傳代和凍存。使用細(xì)胞計數(shù)板，按照計上、不計下，計左、不計右的原則計算細(xì)胞數(shù)目。

Fig.2 H1299 cells transfected with green fluorescently labeled plasmid venom(×100)圖2 綠色熒光標(biāo)記病毒液轉(zhuǎn)染后的H1299細(xì)胞（×100）

1.2.7 LncRNA BCYRN1的生物信息學(xué)分析 肺腺癌患者的RNA-seq數(shù)據(jù)和臨床病理特征數(shù)據(jù)從癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫下載，共包括585個腫瘤樣本，所有RNA-seq數(shù)據(jù)進行l(wèi)og2（x+1）變換。根據(jù)BCYRN1的表達水平，將BCYRN1表達高于平均值的患者定義為高表達組，低于或等于平均值患者定義為低表達組。再根據(jù)年齡、性別、腫瘤分期、TNM分期對患者進行分層。分析BCYRN1表達水平與患者臨床病理特征的關(guān)系。從lnCAR網(wǎng)站（http://lncar.renlab.org/）獲取BCYRN1在肺腺癌中的表達數(shù)據(jù)，通過Cox回歸分析BCYRN1表達與患者預(yù)后的關(guān)系。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測BCYRN1對細(xì)胞周期和凋亡的影響 收集貼壁細(xì)胞，1 mL預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，離心沉淀細(xì)胞后，用70%的預(yù)冷乙醇混勻固定細(xì)胞12~24 h。再次用PBS重懸細(xì)胞，離心沉淀細(xì)胞后，每個樣本加入0.5 mL的碘化丙啶染色液，37℃避光溫育30 min，隨后完成流式細(xì)胞檢測。

虛擬技術(shù)應(yīng)用教學(xué)的模式不僅豐富了教學(xué)方法，而且通過發(fā)揮不同教學(xué)手段的優(yōu)勢，突出構(gòu)建學(xué)生的臨床空間思維，提高學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，激勵學(xué)生提高學(xué)習(xí)自主性、提高實踐操作動手、全面思考問題的能力。為培養(yǎng)優(yōu)秀的肝膽外科醫(yī)生提供扎實的基礎(chǔ)，激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)樂趣，達到教學(xué)目的。

Fig.3 Cell cycle and apoptosis detected by flow cytometry圖3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡

Tab.1 Changes of cell cycle and apoptosis in control group and BCYRN1 down-regulated group表1 對照組和BCYRN1敲低組細(xì)胞周期和凋亡變化（n=3，%，x±s）

Fig.4 Scratch healing rates in BCYRN1 knockdown group and control group圖4 對照組和BCYRN1敲低組的劃痕愈合率

Fig.5 Results of Transwell migration and invasion experiments(Crystal violet staining,×100)圖5 Transwell遷移侵襲實驗結(jié)果（結(jié)晶紫染色，×100）

2.5 BCYRN1表達與肺腺癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系 使用TCGA數(shù)據(jù)將肺腺癌患者分為BCYRN1高表達組與低表達組，通過χ2檢驗得到BCYRN1表達水平與肺腺癌患者腫瘤分期和N分期有關(guān)（P＜0.05），但與年齡、性別以及其他臨床病理特征無關(guān)（P＞0.05），見表2。Cox回歸分析結(jié)果顯示，與BCYRN1低表達組患者相比，BCYRN1高表達組患者的生存時間顯著降低（P＜0.05），BCYRN1高表達的肺腺癌患者的預(yù)后較差，見圖6。

（1）測量標(biāo)準(zhǔn)：對于平面式電加熱板型的表面溫源采用表面溫度計測量，表面溫度計校準(zhǔn)結(jié)果擴展不確定度應(yīng)符合U=2.0℃ k=2。對于干井式或有校準(zhǔn)孔型的表面溫源采用柔性T型熱電偶溫度傳感器測量，柔性T型熱電偶溫度傳感器連電測儀表整體檢測應(yīng)符合≤0.3℃。

“完成黨的十九大提出的目標(biāo)任務(wù)，必須充分發(fā)揮工人階級主力軍作用。”10月29日，習(xí)近平總書記在同中華全國總工會新一屆領(lǐng)導(dǎo)班子成員集體談話并發(fā)表重要講話時指出，我國廣大職工要牢牢把握為實現(xiàn)中國夢而奮斗的時代主題，把自身前途命運同國家和民族前途命運緊緊聯(lián)系在一起，把個人夢同中國夢緊密聯(lián)系在一起，把實現(xiàn)黨和國家確立的發(fā)展目標(biāo)變成自己的自覺行動，愛崗敬業(yè)、爭創(chuàng)一流，以不懈奮斗書寫新時代華章，共同創(chuàng)造幸福生活和美好未來。

3 討論

肺腺癌是肺癌最常見的病理亞型，是發(fā)病率和死亡率均較高的惡性腫瘤。LncRNA BCYRN1又名BC200、LINC00004，位于染色體2p21，是由RNA聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄的長度為200個核苷酸的非編碼RNA。序列分析顯示BCYRN1由3段不同序列的結(jié)構(gòu)域組成，包括一個5'端的Alu片段、一段富含腺嘌呤的結(jié)構(gòu)和一個富含胞嘧啶的區(qū)域［7］。筆者試圖探究BCYRN1對肺腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

3.1 BCYRN1在多種腫瘤中的生物學(xué)功能 Gu等［5］研究表明，與癌旁對照組織相比，結(jié)腸癌腫瘤組織中BCYRN1表達明顯上調(diào)，并且BCYRN1的過表達與腫瘤體積增大和晚期病理階段相關(guān)。另有研究顯示，BCYRN1的高表達與高度核分裂象相關(guān)，而核分裂是癌細(xì)胞侵襲行為的指標(biāo)，提示其作為一種預(yù)后指標(biāo)可評估早期乳腺腫瘤的侵襲能力［8］。Ming等［9］發(fā)現(xiàn)，將患者血漿內(nèi)的BCYRN1和甲胎蛋白表達水平相結(jié)合可顯著提高肝癌的診斷效能。周亞楠等［10］關(guān)于BCYRN1與食管鱗癌關(guān)系的研究表明，BCYRN1在食管癌中高表達，抑制其表達后，食管癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力降低。上述研究揭示了BCYRN1作為一種促癌基因的潛能。

Tab.2 Relationship between expression level of BCYRN1 and clinicopathological characteristics of lung adenocarcinoma patients表2 BCYRN1表達水平與肺腺癌患者臨床病理特征間的關(guān)系

Fig.6 Survival curves of high and low expression groups of BCYRN1 in patients with lung adenocarcinoma圖6 肺腺癌患者BCYRN1高、低表達組生存曲線

3.2 BCYRN1的潛在分子作用機制 LncRNA的生物學(xué)作用主要表現(xiàn)為順式或反式轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控、mRNA的加工、轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)和蛋白激活等功能［11］。此外，lncRNA已被發(fā)現(xiàn)在表觀遺傳以及基因表達調(diào)控中發(fā)揮重要作用［12］。LncRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展的多個病理過程中也發(fā)揮著積極的作用，參與多種分子通路的調(diào)控，可作為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）潛在的治療靶點［13］。有研究顯示lncRNA對肺癌有較好的診斷效能，轉(zhuǎn)移相關(guān)肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1（MALAT1）被視為診斷NSCLC的血液生物學(xué)標(biāo)志物［14］。另一項研究表明，NSCLC患者的肌動蛋白絲相關(guān)蛋白1-反義RNA 1（AFAP1-AS1）明顯高于對照組，患者血清中AFAP1-AS1高表達與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期差、腫瘤體積大相關(guān)［15］。LncRNA參與表觀遺傳機制的調(diào)控，其可作為癌癥治療中克服或逆轉(zhuǎn)耐藥的新指標(biāo)和靶點［16］。有研究者在BCYRN1分子機制的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，包含E1的冷激結(jié)構(gòu)域（CSDE1）通過異二聚體作用與BCYRN1結(jié)合，并存在相互的調(diào)節(jié)作用［17］。體內(nèi)研究顯示，五味子乙素（Schisandrin B）通過上調(diào)miR-150降低BCYRN1的表達而影響大鼠氣道平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移［18］。3.3 BCYRN1在肺腺癌中的生物學(xué)功能 通過上述關(guān)于BCYRN1的相關(guān)研究，筆者試圖探究BCYRN1在肺腺癌細(xì)胞中的表達，并進一步研究BCYRN1對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。本研究通過qPCR證實，BCYRN1在肺腺癌細(xì)胞內(nèi)的表達水平顯著高于正常肺上皮細(xì)胞。流式結(jié)果顯示，BCYRN1敲低的細(xì)胞出現(xiàn)顯著的S期阻滯，并且凋亡細(xì)胞的比例也明顯升高。通過劃痕實驗和Transwell實驗發(fā)現(xiàn)敲低H1299細(xì)胞BCYRN1降低了細(xì)胞的遷移和侵襲能力。結(jié)合生物信息學(xué)分析結(jié)果，BCYRN1的高表達與肺腺癌患者的N分期和腫瘤分期相關(guān)。生存分析表明BCYRN1高表達的患者預(yù)后較差，與細(xì)胞功能實驗結(jié)果一致。

綜述所述，本研究證實BCYRN1在肺腺癌細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達，肺腺癌中高表達的BCYRN1促進了癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，故推測BCYRN1在肺腺癌進展中可能有重要作用，但潛在分子機制仍有待深入研究和探討。