岳宗進，劉汝銀，于露，王新立，馮仲鍇，王西彬

中老年人椎間盤退變加重常引起腰痛和下肢疼痛，甚至引起尿便失禁及其他功能障礙。椎間盤退變的典型癥狀是髓核細胞數(shù)目減少、椎間盤內細胞外基質減少、終板軟骨鈣化等［1］。其主要治療方法包括基因治療、細胞因子治療、細胞或髓核移植及組織工程技術等［2-3］，但這些方法均無法恢復脊柱的原有解剖結構，甚至造成相鄰椎間盤的病變。隨著干細胞治療研究的深入，誘導干細胞分化成髓核細胞修復椎間盤有望成為一種新治療手段，但是其調控機制尚不清楚。葛根屬于豆科植物，具有促進人體新陳代謝、提高肝臟解毒能力的功效。葛根中的三萜及皂苷類化合物主要為齊墩果烷型，主要有黃豆皂苷元A、B，葛根皂苷元A、B、C等。藥理實驗證明葛根總皂苷（total saponins of pueraria lobata，TSPL）可改善小鼠免疫性肝損傷［4］。目前有關TSPL促進軟骨細胞增殖的研究鮮有報道。本研究旨在探討TSPL對骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）定向分化成髓核樣細胞的調控作用及機制，為TSPL改善椎間盤退變提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和動物 大鼠BMSCs（Cat NO.RBM-005F）購自美國ALLCELLS公司。SPF級雄性SD大鼠32只，體質量（230±13）g，由河南省中醫(yī)院（河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院）實驗動物中心提供，動物生產許可證號SYXK（豫）2017-0012。飼養(yǎng)條件：溫度為25℃，相對濕度為50%~70%，保持動物房環(huán)境及鼠籠清潔、透氣，自然光照，自由進食和飲水。大鼠適應性喂養(yǎng)1周后進行實驗。所有動物實驗均經河南省中醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準（批準文號Z1.0/612）。

1.1.2 試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶（含EDTA）、Ⅱ型膠原蛋白酶、Alcian Blue、DMEM培養(yǎng)基（高糖）、胎牛血清（Sigma公司）；二甲基亞甲基藍（DMMB）比色法定量檢測試劑盒（上海赫澎生物公司）；引物合成（上海生工生物公司）；Trizol（美國Invitrogen公司）；反轉錄試劑盒、實時熒光PCR（qPCR）試劑（大連TaKaRa公司）；總蛋白提取試劑盒、Prestained Protein Ladder（Thermo Fisher Scientific公司）；Lipo?fectamineTM2000轉染試劑（美國Invitrogen公司）；兔抗COL2A1多克隆抗體（貨號：ab34712）、兔抗Aggrecan單克隆抗體（Aggrecan，貨號：ab186414）、兔抗Sox9單克隆抗體（貨號：ab185230）、兔抗Tie2單克隆抗體（貨號：ab221154）、兔抗Sirt1單克隆抗體（貨號：ab189494）、山羊抗兔IgG（貨號：ab205718）和過氧化物酶（HRP）購自英國Abcam公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）/NADH檢測試劑盒（Biovision公司）；腺苷三磷酸（ATP）檢測試劑盒（北京索萊寶公司）；煙酰胺單核苷酸（NMN）和煙酰胺磷酸核糖轉移酶（NAMPT）抑制劑FK866（北京?，B生物科技有限公司）；沉默交配型信息調節(jié)2同系物1（Sirt1）檢測試劑盒（美國Invitrogen公司）；細胞增殖檢測試劑盒（CCK-8，北京百泰克生物公司）；去離子水設備Milli-Q水純化系統(tǒng)（美國Millipore公司）；SRT2104試劑（上海普邁生物科技有限公司）。

1.1.3 儀器 細胞培養(yǎng)箱、酶標儀、凝膠成像系統(tǒng)（iBright）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；qPCR儀（型號：ABI-7300）購自美國ABI公司；蛋白免疫印跡電泳系統(tǒng)（型號1659001）購自美國Bio-Rad公司；紫外/可見分光光度計（型號752）購自上海光譜儀器有限公司；倒置電子顯微鏡（型號FM-500）購自上海普丹光學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 建立大鼠腰椎間盤退變模型 采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為假手術組、模型組、30 mg/kg TSPL治療組和50 mg/kg TSPL治療組，每組8只。腹腔注射6.5%水合氯醛麻醉大鼠，取俯臥位，固定四肢，腰背部備皮，沿腰背部棘突做后正中切口。切開皮膚后，沿骨膜下剝離，咬骨鉗去除以L3為中心的L1~S1的棘突、關節(jié)突和棘上及棘間韌帶，切斷雙側豎棘肌，逐層縫合皮下筋膜、皮膚。假手術組僅切開皮膚，然后進行縫合，處理結束后將大鼠放入單獨籠中飼養(yǎng)。治療組大鼠分別給予30、50 mg/（kg·d）TSPL灌胃治療，假手術組和模型組大鼠給予等量生理鹽水灌胃。飼喂8周后，處死大鼠，顯微鏡下采集大鼠L5~S1椎間盤組織。

1.2.2 TSPL的提取 采用乙醇熱回流及大孔吸附樹脂方法提取制備葛根總皂苷［3］，含量＞50%。稱取葛根飲片1 kg（廣州中醫(yī)藥大學大藥房有限公司，批號：20100319），碾碎后，加入75%乙醇，水浴加熱回流提取3次后，濃縮收集提取液，稱質量。然后，大孔吸附樹脂為固態(tài)相，分別用水和不同梯度（30%、40%、50%、60%和70%）乙醇進行洗脫，濃縮收集洗脫液，再次稱質量。最后，將TSPL樣品溶解于去離子水，質量濃度為2 g/L，去離子水作為參照組。采用分光光度計于400~800 nm處測定TSPL的吸光度。

1.2.3 BMSCs的培養(yǎng)和處理 取生長狀況良好的大鼠BMSCs，使用含10%胎牛血清、100 mg/L鏈霉素、100 U/mL青霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞融合度達80%時按1∶3傳代，選取第3代細胞，胰酶消化后，調整細胞濃度為1×109/L，接種于6孔板中。體外實驗分為：（1）BMSCs組，給予生理鹽水處理。（2）BMSCs-TSPL組，分別給予不同劑量（10、20、30、40、50μmol/L）TSPL處理。（3）BMSCs-TSPL-FK866組，分別給予30μmol/L TSPL和2.5μmol/L FK866處理。（4）BMSCs-TSPL-SRT2104組，分別給予30μmol/L TSPL和10μmol/L SRT2104處理。

1.2.4 DMMB比色法檢測糖胺聚糖含量 分別取各組大鼠L5~S1椎間盤組織0.5 g，加入1 mL HEPENGBIO清理液清洗1次，勻漿器研磨成勻漿，置于離心管中，加入5 mL HEPENGBIO萃取液，漩渦震蕩后，分別在56℃恒溫水槽中孵育16 h，90℃恒溫水槽中孵育10 h。離心后取50μL上清液，加入0.1 mL HEPENGBIO染色液，室溫孵育30 min后，離心棄上清液，加入0.1 mL HEPENGBIO解離液，震蕩后轉移到比色皿中，在656 nm處用分光光度計檢測吸光度值，根據(jù)標準曲線獲得樣品對應的糖胺聚糖含量。細胞實驗中，收集第1、4、7、10、14天的細胞，通過高鹽萃取細胞中可溶性糖胺聚糖，與DMMB染料結合，在丙醇解離溶液中，產生不溶性紫色或粉紅色糖胺聚糖染料復合物釋放出染料，分光光度計于656 nm處定量分析糖胺聚糖的含量，操作步驟同組織測定。

1.2.5 CCK-8法測定髓核樣細胞增殖情況 按照CCK-8試劑盒檢測各組細胞的增殖情況。將經過不同處理的細胞以1.5×104/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中。孵育24、48和72 h后，丟棄上清液，并向每孔中添加10μL CCK-8溶液。37℃孵育2 h后，酶標儀檢測450 nm處的吸光度值。

1.2.6 qPCR檢測髓核樣細胞中COL2A1、Aggrecan、Sox9、Tie2和Sirt 1mRNA水平 細胞誘導成熟后，用Trizol試劑盒提取細胞中總RNA。測定RNA濃度后，將RNA反轉錄成cDNA，以cDNA作為模板進行qPCR反應，根據(jù)試劑盒要求進行定量分析。反應體系：10×Taq bufffer 2.5μL，dNTP mix 2.5μL，上下游引物各1μL，cDNA模板1μL，RNase-free water補足至25μL。反應條件如下：95℃5 min；94℃15 s，54℃30 s，72℃20 s，共35個循環(huán)。以GAPDH為內參，基因引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法計算各基因mRNA相對表達量。

1.2.7 Western blot測定COL2A1、Aggrecan、Sox9、Tie2和Sirt1蛋白的表達 細胞培養(yǎng)14 d后，使用RIPA裂解液提取細胞中的總蛋白，并溶解于SDS蛋白上樣緩沖液中。每組取40μg上樣蛋白，等量蛋白經10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠分離后，轉至PVDF膜上。用5%牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉1 h，TSBT清洗后，加入兔抗COL2A1多克隆抗體（稀釋比例1∶300），兔抗Aggrecan單克隆抗體（稀釋比例1∶300），兔抗Sox9單克?。ㄏ♂尡壤?∶500），兔抗Tie2單克隆抗體（稀釋比例1∶200）和兔抗Sirt1單克隆抗體（稀釋比例1∶100）于4℃冰箱中孵育過夜，經TBST漂洗后，與HRP標記的山羊抗兔IgG抗體（稀釋比例1∶1 000）室溫孵育1 h，以GAPDH為內參。采用增強化學發(fā)光法顯色，用凝膠成像儀觀察條帶并拍照，并用Image J軟件對蛋白進行定量分析。

1.2.8 WST-8法檢測各組骨髓間充質干細胞中NAD+水平 誘導培養(yǎng)14 d后，收集各組細胞，根據(jù)NAD+/NADH測定試劑盒的步驟進行操作，制作標準曲線后，計算NAD+的水平。

1.2.9 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測骨髓間充質干細胞中ATP水平及髓核樣細胞的NAMPT水平 用離心管離心沉淀細胞，棄上清液，然后加入裂解液裂解細胞后，在4℃，12 000×g條件下離心10 min，取上清液，按照ATP試劑盒說明書檢測ATP水平。按照ELISA試劑盒說明檢測各處理組細胞中NAMPT水平，用酶標儀檢測450 nm處吸光度，繪制標準曲線并計算NAMPT水平。

Tab.1 Primers for qPCR表1 qPCR引物序列

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗；不同時點多組間比較采用重復測量設計的方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 椎間盤組織和BMSCs中糖胺聚糖含量比較 體內實驗結果顯示，假手術組、模型組和30、50 mg/kg TSPL治療組椎間盤組織中糖胺聚糖含量（ng/g）分別為2.66±0.22、1.37±0.05、2.01±0.07和2.42±0.17，差異有統(tǒng)計學意義（F=3 694.896，P＜0.05）。其中模型組低于假手術組，30、50 mg/kg TSPL治療組高于模型組，且50 mg/kg TSPL治療組高于30 mg/kg TSPL治療組（P＜0.05）。

體外實驗結果顯示，BMSCs組和不同劑量TSPL組細胞中糖胺聚糖含量隨處理時間的延長呈增高趨勢（P＜0.05）。除處理1 d時各組細胞中糖胺聚糖含量差異無統(tǒng)計學意義外，其余各時點TSPL各組糖胺聚糖含量均高于BMSCs組，10、20、30μmol/L TSPL組糖胺聚糖含量依次升高，40、50μmol/L TSPL組糖胺聚糖含量逐漸降低，見表2。故后續(xù)實驗選擇30μmol/L TSPL處理細胞。

不同處理組細胞中糖胺聚糖含量隨處理時間的延長呈增高趨勢（P＜0.05）。處理1 d時，各組細胞中糖胺聚糖含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；其余各時點，與BMSCs組比較，BMSCs-TSPL組、BMSCs-TSPL-SRT2104組糖胺聚糖含量均增高（P＜0.05），BMSCs-TSPL-FK866組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與BMSCs-TSPL組比較，BMSCs-TSPL-FK866組糖胺聚糖含量降低，BMSCs-TSPL-SRT2104組糖胺聚糖含量增高；與BMSCs-TSPL-FK866組比較，BMSCs-TSPL-SRT2104組糖胺聚糖含量明顯增高（P＜0.05），見表3。

2.2 不同處理組BMSCs向髓核樣細胞分化情況比較 BMSCs組細胞貼壁后逐漸顯現(xiàn)出梭形、紡錘形；與BMSCs組比較，TSPL單獨或聯(lián)合SRT2014處理后的BMSCs細胞形態(tài)由梭形向多角形轉變，核周顆粒明顯，細胞表型接近髓核樣細胞；與BMSCs-TSPL組比較，BMSCs-TSPL-FK866組BMSCs分化程度減少，而BMSCs-TSPL-SRT2014組促進BMSCs向髓核樣細胞分化，見圖1。

2.3 不同處理組BMSCs細胞增殖能力比較 不同處理組細胞增殖能力隨處理時間的延長呈增強趨勢（P＜0.05）。處理0 h時，各組細胞增殖能力差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；處理24 h時，BMSCs-TSPL組和BMSCs-TSPL-SRT2104組細胞增殖能力強于BMSCs組；處理48、72 h時，與BMSCs組相比，BMSCs-TSPL組和BMSCs-TSPL-SRT2104組細胞增殖能力增強；與BMSCs-TSPL組相比，BMSCs-TSPLFK866組細胞增殖能力減弱，BMSCs-TSPLSRT2104組細胞增殖能力增強；BMSCs-TSPLSRT2104組細胞增殖能力較BMSCs-TSPL-FK866組增強（P＜0.05），見表4。

Tab.2 Comparison of glycosaminoglycan contents in cells between the six treatment groups表2 BMSCs組和不同劑量TSPL組細胞各時點的糖胺聚糖含量比較 （n=4，mg/L，x±s）

Tab.3 Comparison of glycosaminoglycan contents between the four different treatment groups of cells表3 不同處理組細胞各時點的糖胺聚糖含量比較 （n=4，mg/L，x±s）

Fig.1 Cytographic view of BMSCs differentiated into nucleus pulposus like cells（×100）圖1 BMSCs向髓核樣細胞分化的細胞圖（×100）

Tab.4 Comparison of cell proliferation between the four different treatment groups表4 不同處理組細胞增殖情況的比較 （n=4，x±s）

2.4 不同處理組BMSCs中COL2A1、Aggrecan、SOX9和Tie2mRNA表達 qPCR結果顯示，與BMSCs組相比，BMSCs-TSPL組和BMSCs-TSPL-SRT2104組COL2A1、Aggrecan和Sox9mRNA表達水平升高，Tie2mRNA表達水平降低（P＜0.05）；與BMSCs-TSPL組相比，BMSCs-TSPL-FK866組COL 2A1、Aggrecan和Sox9mRNA表達水平降低，Tie2mRNA表達水平升高（P＜0.05）；與BMSCs-TSPL-FK866組比較，BMSCs-TSPL-SRT2104組COL2A1、Aggrecan和Sox9mRNA表達水平升高，Tie2mRNA表達水平降低（P＜0.05），見表5。

Tab.5 Comparison of mRNA levels of COL2A1,Aggrecan,SOX9 and Tie2 in BMSCs between the four different treatment groups表5 不同處理組COL2A1、Aggrecan、SOX9和Tie2 mRNA表達比較 （n=4，x±s）

2.5 不同處理組BMSCs中COL2A1、Aggrecan、SOX9和Tie2蛋白表達 Western blot結果顯示，與BMSCs組相比，BMSCs-TSPL組和BMSCs-TSPL-SRT2104組COL2A1、Aggrecan和Sox9蛋白表達水平升高，Tie2蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與BMSCs-TSPL組相比，BMSCs-TSPL-FK866組COL2A1、Aggrecan和Sox9蛋白表達水平降低，Tie2蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與BMSCs-TSPL-FK866組比較，BMSCs-TSPL-SRT2104組COL2A1、Aggrecan和Sox9蛋白表達水平升高，Tie2蛋白表達水平降低（P＜0.05），見圖2、表6。

Fig.2 COL2A1,Aggrecan,Sox9 and Tie2 protein levels in TSPL-treated BMSCs圖2 Western blot檢測各組COL2A1、Aggrecan、SOX9和Tie2蛋白表達

Tab.6 Comparison of protein levels of genes in nucleus pulposus-like cells between the four different treatment groups表6 不同處理組COL2A1、Aggrecan、SOX9和Tie2蛋白表達比較 （n=4，x±s）

2.6 不同處理組BMSCs中NAD+、ATP和NAMPT水平 ELISA結果顯示，與BMSCs組相比，BMSCs-TSPL組和BMSCs-TSPL-SRT2104組BMSCs中NAD+、ATP和NAMPT水平升高（P＜0.05）；與BMSCs-TSPL組相比，BMSCs-TSPL-FK866組BMSCs中NAD+、ATP和NAMPT水平降低（P＜0.05）；與BMSCs-TSPL-FK866組 比 較，BMSCs-TSPL-SRT2104組BMSCs中NAD+、ATP和NAMPT水平升高（P＜0.05），見表7。

Tab.7 Comparison of the levels of NAD+,ATP and NAMPT in BMSCs between the four different treatment groups表7不同處理組BMSCs中NAD+、ATP和NAMPT相對水平的比較 （n=4，x±s）

2.7 不同處理組BMSCs中Sirt1 mRNA和蛋白的表達 與BMSCs組相比，TSPL單獨或聯(lián)合SRT2104處理顯著上調BMSCs中Sirt1 mRNA和蛋白表達水平（P＜0.05）；與BMSCs-TSPL組相比，BMSCs-TSPLFK866組細胞中Sirt1 mRNA和蛋白表達水平下調（P＜0.05），而BMSCs-TSPL-SRT2104組 細 胞 中Sirt1 mRNA和蛋白表達水平上調（P＜0.05），見表8、圖3。

Tab.8 Comparison of Sirt1 mRNA and protein levels in BMSCs between the four different treatment groups表8不同處理組BMSCs中Sirt1 mRNA和蛋白表達水平的比較 （n=4，x±s）

Fig.3 Sirt1 protein level in myeloid cells圖3 髓核樣細胞相關蛋白的表達

3 討論

有研究表明，牛膝皂苷、當歸、梓醇、黃芪甲苷等中藥及提取物均可促進BMSCs分化成髓核樣細胞而改善椎間盤退化［5-8］。葛根素通過ERK1/2和P38MAPK途徑促進成骨分化，改善去卵巢大鼠骨質疏松［9］。椎間盤退變的主要表現(xiàn)為細胞外基質成分的變化，尤其是糖胺多糖丟失［10］。因此，本研究分別測定大鼠椎間盤組織和BMSCs中糖胺聚糖含量來判斷椎間盤退變情況，結果顯示，與假手術組相比，模型組大鼠椎間盤組織中糖胺聚糖含量降低；與模型組相比，TSPL治療組糖胺聚糖含量增加，且50 mg/kg TSPL效果較30 mg/kg顯著；體外實驗結果顯示，不同劑量TSPL組糖胺聚糖含量均高于BMSCs組，其中10、20、30μmol/L TSPL組糖胺聚糖含量依次升高，40、50μmol/L TSPL組糖胺聚糖含量逐漸降低，故后續(xù)實驗選擇30μmol/L TSPL處理細胞。

BMSCs具有多向分化能力，根據(jù)所處的微環(huán)境不同，可分化成神經細胞、心肌細胞和肝樣細胞等［11-12］。椎間盤由外層的纖維環(huán)及其包繞的髓核構成，髓核由細胞和細胞外基質組成，基質主要包括水、蛋白多糖、膠原和非膠原蛋白。退變的椎間盤組織中，細胞外基質降解增強，導致髓核細胞內Ⅱ型膠原蛋白轉變成Ⅰ型膠原蛋白［13］，糖胺聚糖含量降低。因此，研究BMSCs向髓核樣細胞分化對椎間盤退變疾病的治療具有重要意義。據(jù)報道，黃芪甲苷Ⅳ可通過調節(jié)糖原合成酶激酶（GSK）3β/β-連環(huán)蛋白信號通路促進神經生長因子（NGF）誘導的成骨細胞分化［14］。梓醇通過Wnt/β-catenin途徑促進骨髓間充質干細胞的成骨分化［15］。本研究結果顯示，BMSCs經TSPL處理后，BMSCs中糖胺聚糖含量增加，且促進BMSCs向髓核樣細胞分化。COL2A1、Aggrecan、Sox9和Tie2作為髓核樣細胞的特有基因，可用來判斷BMSCs分化至髓核細胞的程度［16-17］。Liu等［18］研究表明椎間盤退變過程中Aggrecan蛋白表達量降低。本研究結果發(fā)現(xiàn)，BMSCs經TSPL處理可上調COL2A1、Aggrecan以及Sox9的mRNA和蛋白表達水平，并且下調Tie2 mRNA和蛋白表達水平。

NAD+是一種典型的輔酶，介導多種氧化還原反應，促進關鍵代謝途徑中的氫轉移。Sirt1是一個與細胞分化、衰老、凋亡和能量代謝密切相關的NAD＋依賴的組蛋白去乙?；福?9］。Sirt1通過連接調節(jié)NAD+補救途徑的酶反饋回路和晝夜節(jié)律轉錄-翻譯反饋回路，調節(jié)代謝及晝夜節(jié)律［20-22］。在神經退行性疾病治療過程中，可通過補充NAD+中間產物來恢復NAD+水平，進而改善記憶退化和動作遲鈍等癥狀。在細胞增殖和分化的過程中，NAMPT作為整個反應啟動因子，最終產生Sirt1，激活下游信號通路，對細胞進行調控。據(jù)報道，在高糖和游離脂肪酸微環(huán)境中，miR-449通過抑制Sirt1途徑抑制BMSCs的成骨分化［20］。NAMPT/NAD/Sirt1軸信號轉導通路是調控BMSCs增殖、分化的重要通路之一［23］。NAMPT抑制劑FK866通過抑制尼克酰胺的合成，降低Sirt1活性，進而減少BMSCs的分化。本研究結果顯示，NAMPT抑制劑FK866下調TSPL處理的BMSCs中NAMPT和Sirt1蛋白表達水平，且降低NAD+水平，提示NAMPT/NAD/Sirt1信號通路被阻斷；經Sirt1蛋白的激活劑SRT2104處理后，Sirt1蛋白表達量增加，提示NAMPT/NAD/Sirt1信號通路可能在TSPL誘導的BMSCs向髓核樣細胞分化中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，TSPL可通過激活NAMPT/NAD/Sirt1信號通路，促進BMSCs向髓核樣細胞分化來改善椎間盤退變，這為TSPL治療椎間盤退變提供了實驗基礎。