田愛(ài)現(xiàn)，馬劍雄，馬信龍△，李巖

骨骼肌的功能與其肌纖維的數(shù)量和體積有關(guān)，當(dāng)骨骼肌出現(xiàn)萎縮時(shí)，其質(zhì)量會(huì)相應(yīng)減少，機(jī)體的運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)功能也會(huì)受到明顯影響，從而影響患者的身體健康，降低生活質(zhì)量，老年患者尤為明顯［1］。當(dāng)前對(duì)骨骼肌萎縮的研究已成為熱點(diǎn)。藥物治療以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)與良好的療效在防治骨骼肌萎縮方面發(fā)揮著重要作用。阿侖膦酸鈉（Alendronate，ALN）作為第3代雙膦酸鹽藥物，可有效抑制骨吸收，維持骨量，是治療原發(fā)性及繼發(fā)性骨質(zhì)疏松的一線藥物［2］。ALN除了可治療骨質(zhì)疏松癥外，還能明顯增加骨骼肌質(zhì)量［3］，并能通過(guò)提高自噬、抑制骨骼肌蛋白降解等途徑抑制骨骼肌萎縮［4-5］。本研究以地塞米松（Dexamethasone，Dexa）誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞肌小管萎縮，通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討ALN在骨骼肌萎縮中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器 阿侖膦酸鈉（Merck Sharp&Dohme Italia SPA，國(guó)藥準(zhǔn)字J20130085，600 mg/片）；地塞米松購(gòu)自Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；4%中性多聚甲醛固定液、HE染色試劑盒、免疫組化試劑盒為武漢賽維爾生物科技有限公司產(chǎn)品；微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）、Beclin-1、肌球蛋白重鏈（MHC）抗體，肌肉特異性環(huán)指蛋白1（MuRF1）單克隆抗體及辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的對(duì)應(yīng)二抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；CCK-8檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）。酶標(biāo)儀（Rayto，RT6100），離心機(jī)（大龍，D3024R），成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司，Tanon-1600R），光學(xué)顯微鏡（日本，Nikon EclipseE100），Western blot電泳儀（Bio-Rad公司，美國(guó)）。

1.2 研究方法

1.2.1 C2C12細(xì)胞培養(yǎng)、分化和分組 C2C12肌細(xì)胞來(lái)源于天津市骨科研究所，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，添加1%青霉素和鏈霉素（生長(zhǎng)培養(yǎng)基），細(xì)胞置于37℃、5%CO2孵箱，48 h更換生長(zhǎng)培養(yǎng)基。細(xì)胞生長(zhǎng)至70%左右時(shí)更換含2%馬血清的DMEM高糖培養(yǎng)基（分化培養(yǎng)基）繼續(xù)培養(yǎng)4 d，以誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞肌小管形成。實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組（DMSO處理），Dexa組（100μmol/L Dexa處理），Dexa+ALN組（100μmol/L Dexa+1.0μmol/L ALN處理）。

1.2.2 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以5×103細(xì)胞/孔接種于96孔板，接種12 h后加入藥物處理。實(shí)驗(yàn)設(shè)4組，ALN濃度分別為0、0.1、0.5和1.0μmol/L，設(shè)置僅含有等體積DMEM全培養(yǎng)基的空白孔排除培養(yǎng)基干擾，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。藥物處理48 h后，根據(jù)CCK-8試劑盒說(shuō)明書操作，棄原有培養(yǎng)基，每孔加入100μL的CCK-8試劑，37℃孵育2 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的光密度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞存活率，篩選ALN合適劑量。

1.2.3 C2C12細(xì)胞肌小管HE染色 細(xì)胞生長(zhǎng)至70%左右時(shí)更換含2%馬血清的DMEM高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 d，棄掉培養(yǎng)基，加冷PBS（pH=7.4~7.6）清洗2次，每次30 s，每孔加入4%中性多聚甲醛固定液15 min，PBS清洗3次，每次5 min。每孔加入蘇木素染液2 min，適量PBS清洗3次，每次5 min。每孔加入伊紅染液30 s，適量PBS清洗3次，每次5 min。光鏡下觀察C2C12細(xì)胞肌小管情況。

1.2.4 C2C12細(xì)胞肌小管直徑和融合指數(shù)測(cè)定 C2C12細(xì)胞肌小管呈長(zhǎng)梭形，以每條肌小管中部2/3作為其直徑測(cè)量部位，沿軸線方向測(cè)定多組數(shù)據(jù)，每組隨機(jī)拍攝3張圖。肌小管是多個(gè)C2C12細(xì)胞融合而形成的，因此以視野下肌小管中的細(xì)胞核數(shù)量占總細(xì)胞核數(shù)量的百分比評(píng)估C2C12細(xì)胞的分化程度。其計(jì)算方式：融合指數(shù)（%）=視野肌小管中細(xì)胞核數(shù)（n）/視野中細(xì)胞核總數(shù)（N）×100%。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)取6張照片，最終結(jié)果取其平均值，采用Image J 1.48軟件統(tǒng)計(jì)肌小管直徑和融合指數(shù)。

1.2.5 Dexa刺激誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞肌小管萎縮模型的建立 C2C12細(xì)胞采用分化培養(yǎng)基培養(yǎng)4 d形成肌小管，更換分化培養(yǎng)基，使用濃度100μmol/L的Dexa刺激24 h。

1.2.6 Western blot法檢測(cè)肌蛋白和自噬相關(guān)蛋白表達(dá) 細(xì)胞生長(zhǎng)至70%左右時(shí)更換含2%馬血清的DMEM高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 d，24 h后收集各組細(xì)胞并提取總蛋白，BCA法測(cè)量蛋白濃度，經(jīng)SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉，隨后加入MHC、MuRF1、LC3、Beclin-1和抗β肌動(dòng)蛋白一抗（均為1︰1 000稀釋），于4℃孵育過(guò)夜，次日TBST震蕩洗滌3次，加入按比例稀釋的HRP標(biāo)記的對(duì)應(yīng)二抗（1∶4 000），室溫孵育60 min，TBST洗滌3次后進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光顯影，成像系統(tǒng)顯影，所有蛋白條帶灰度值定量密度分析采用Image J 1.48軟件。

1.2.7 免疫熒光檢測(cè)肌合成蛋白MHC表達(dá) 細(xì)胞生長(zhǎng)至70%左右時(shí)更換含2%馬血清的DMEM高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 d，24 h后棄掉培養(yǎng)基，加冷PBS（pH=7.4~7.6）清洗2次，每次30 s；每孔加入4%中性多聚甲醛固定15 min，適量PBS清洗3次，每次5 min；每孔加入0.3%TritonX-100作用20 min，適量PBS清洗3次，每次5 min；每孔加入5%胎牛血清封閉液，在37℃搖床下孵育1 h；加入一抗兔源MHC（1︰1 000），4℃孵育過(guò)夜，一抗孵育結(jié)束后，加入適量PBS清洗3次，每次5 min；加入熒光標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，加入適量PBS清洗3次，每次5 min；每孔加入DAPI染細(xì)胞核，室溫孵育5 min，加入適量PBS清洗3次，每次5 min；防熒光淬滅樹脂膠封片，共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度ALN對(duì)C2C12細(xì)胞增殖能力的影響 結(jié)果顯示，0、0.1、0.5和1.0μmol/L ALN組細(xì)胞增殖能力組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，F(xiàn)=74.978，P＜0.01）；相較于其他濃度組，1.0μmol/L ALN組細(xì)胞增殖能力更高（P＜0.05），見圖1。因此本實(shí)驗(yàn)選擇1.0μmol/L ALN進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Fig.1 Effects of different concentrations of ALN on theproliferation of C2C12 cells圖1 不同濃度ALN對(duì)C2C12細(xì)胞增殖能力的影響

2.2 不同濃度ALN對(duì)C2C12細(xì)胞分化的影響 結(jié)果顯示，0、0.1、0.5和1.0μmol/L ALN處理后，1.0 μmol/L ALN組相較于其他組的細(xì)胞分化能力更高，其肌小管直徑最大、肌小管融合指數(shù)最高（P＜0.05），見圖2。

2.3 ALN對(duì)Dexa誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞肌蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Dexa組細(xì)胞MuRF1蛋白表達(dá)水平升高（1.00±0.00vs.2.46±0.12），Dexa+ALN組中MuRF1蛋白表達(dá)水平（0.67±0.03）較Dexa組顯著下調(diào)，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，F(xiàn)=337.335，P＜0.01)，見圖3。免疫熒光結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Dexa組肌小管萎縮，并且MHC蛋白熒光表達(dá)強(qiáng)度（紅光）明顯降低，Dexa+ALN組MHC蛋白熒光表達(dá)強(qiáng)度表達(dá)較Dexa組顯著升高，見圖4。

Fig.2 Effects of different concentrations of ALN on the differentiation of C2C12 cells圖2 不同濃度ALN對(duì)C2C12細(xì)胞分化的影響

Fig.3 Western blot assay showed the effect of ALN on the expression of MuRF1 protein induced by Dexa in C2C12 cells圖3 Western blot法檢測(cè)ALN對(duì)Dexa誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞MuRF1蛋白表達(dá)的影響

2.4 ALN對(duì)Dexa誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞自噬水平的影響 Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Dexa組自噬信號(hào)通路相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1表達(dá)水平較對(duì)照組顯著下調(diào)（P＜0.05），Dexa+ALN組中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表達(dá)較Dexa組顯著上調(diào)（P＜0.05），見圖5、表1。

Fig.4 The effects of ALN on Dexa-induced MHC protein expressions in C2C12 cells detected by immunofluorescence圖4 免疫熒光檢測(cè)ALN對(duì)Dexa誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞MHC蛋白表達(dá)的影響

Fig.5 Western blot assay showed the effect of ALN on Dexa-induced autophagy in C2C12 cells圖5 Western blot法檢測(cè)ALN對(duì)Dexa誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞自噬水平的影響

Tab.1 Comparison of the expression levels of autophagy related proteins between three groups of C2C12 cells表1 各組C2C12細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較（n=3，x±s）

3 討論

3.1 雙膦酸鹽類抗骨質(zhì)疏松藥物在骨骼肌中的作用 雙膦酸鹽類抗骨質(zhì)疏松藥物對(duì)骨骼肌生長(zhǎng)和功能的影響目前尚存在爭(zhēng)議。Yoon等［6］研究表明雙膦酸鹽中的帕米膦酸鹽對(duì)杜氏肌萎縮癥小鼠模型具有增加骨骼生長(zhǎng)和提高骨骼肌功能的作用。B?rsheim等［7］認(rèn)為，帕米膦酸鈉可通過(guò)調(diào)節(jié)骨骼肌蛋白的合成和分解來(lái)減輕骨骼肌萎縮，并提高燒傷后患者的骨骼肌力量。Uchiyama等［8］發(fā)現(xiàn)32例骨質(zhì)疏松癥患者服用雙膦酸鹽治療3年后，股骨周圍骨骼肌密度明顯改善。Widrick等［9］研究結(jié)果也表明一定劑量的ALN在可以增加去勢(shì)大鼠骨量，但對(duì)骨骼肌功能沒(méi)有影響。Shiomi等［10］研究發(fā)現(xiàn)100μmol/L ALN可抑制人肌細(xì)胞的增殖和分化。本研究發(fā)現(xiàn)，與0、0.1和0.5μmol/L ALN組相比，1.0μmol/L ALN組能夠顯著促進(jìn)C2C12細(xì)胞增殖和分化，增加肌小管直徑和肌小管融合指數(shù)，并顯著改善Dexa誘導(dǎo)的C2C12細(xì)胞肌小管萎縮，促進(jìn)骨骼肌合成蛋白MHC表達(dá)上調(diào)，抑制肌降解蛋白MuRF1的表達(dá)。

3.2 自噬信號(hào)通路相關(guān)蛋白在骨骼肌細(xì)胞中的作用 LC3是自噬標(biāo)志蛋白之一。LC3作為一種前肽可產(chǎn)生含C末端的肽，并釋放到細(xì)胞質(zhì)中。LC3-Ⅰ通過(guò)Atg7和Atg3將磷脂酰乙醇胺偶聯(lián)，生成脂質(zhì)化形式的LC3，也稱作LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ廣泛存在于真核生物中，其表達(dá)程度與自噬活性密切相關(guān)。LC3-Ⅱ可被整合到細(xì)胞膜中，并與LC3-Ⅰ強(qiáng)烈結(jié)合，常用LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ來(lái)評(píng)價(jià)自噬水平［11］。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠在跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)1 h或急性鈍挫傷干預(yù)后，骨骼肌細(xì)胞的自噬標(biāo)志蛋白含量均明顯升高［12］。Takegaki等［13］發(fā)現(xiàn)過(guò)度訓(xùn)練能抑制骨胳肌降解蛋白表達(dá)，激活自噬信號(hào)通路，使ULK1 Ser757和Ser555磷酸化，LC3-Ⅱ表達(dá)增加。Kotani等［14］研究發(fā)現(xiàn)，反復(fù)的電刺激可通過(guò)磷酸化自噬啟動(dòng)因子（ULK1）減弱雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體1（mTORC1）活性，激活自噬體LC3的形成。本研究體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，100μmol/L Dexa處理C2C12細(xì)胞24 h后，1.0μmol/L ALN通過(guò)上調(diào)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1蛋白含量，增加肌小管內(nèi)肌合成蛋白MHC表達(dá)，抑制肌降解蛋白MuRF1表達(dá)，有效改善Dexa誘導(dǎo)的骨胳肌萎縮，促進(jìn)骨骼肌再生。ALN對(duì)骨骼肌萎縮的逆轉(zhuǎn)，可能與刺激肌小管形成有關(guān)。

綜上所述，抗骨質(zhì)疏松藥物ALN可以通過(guò)上調(diào)自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1表達(dá)，抑制肌降解蛋白MuRF1表達(dá)，顯著預(yù)防體外Dexa誘導(dǎo)的細(xì)胞肌小管萎縮。