黃子威，汪志文，黎 源，夏洪麗，簡紀常，魯義善

（1.廣東海洋大學水產(chǎn)學院// 2.廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室// 3.廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病害控制重點實驗室，廣東 湛江 524088；4.廣東海洋大學深圳研究院// 5.廣東省水生動物健康評估工程技術(shù)研究中心，廣東 深圳 518000）

羅非魚（Oreochromis）為慈鯛科羅非魚屬魚類，原產(chǎn)非洲約旦，屬熱帶性魚類，有生長快、食性雜、疾病少、適應性強等特點[1]，其肌肉富含蛋白質(zhì)，多種維生素及微量元素，且肉嫩味美，深受人們喜愛[2]。但是隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，病害頻發(fā)，給羅非魚產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[3]。

A 類清道夫受體（SCARA）已在大黃魚(Larimichtys crocea)、斑馬魚 (Danio rerio)、綠河鲀(Tetraodon nigroviridis)、鯉 (Cyprinus carpio)、斑點叉尾鮰(Ictalurus punctatus)等魚類中被鑒定[4-7]。SCARA由巨噬細胞清道夫受體1（SCARA1）、有膠原結(jié)構(gòu)的巨噬細胞受體（SCARA2）、細胞應激反應蛋白（SCARA3）、C型凝集素清道夫受體（COLEC12）和A類清道夫受體成員5（SCARA5）等5 個成員組成，其中A清道夫受體4（SCARA4）是唯一有C型凝集素 (CLECT) 結(jié)構(gòu)域的蛋白[4]。SCARA4 參與巨噬細胞炎癥反應，參與機體識別、清除病原細菌的免疫反應。但目前對于清道夫受體的研究主要集中于哺乳動物上，魚類中的研究相對較少。而硬骨魚中SCARA4 結(jié)構(gòu)與功能與高等脊椎動物不盡相同[5,8-11]，研究魚類SCARA4 對魚類病害防治有重要意義。已在虹鱒 (Oncorhynchus mykiss)[12]、鯉[8]和斑馬魚[5]中鑒定出SCARA4，并證實SCARA4 在抵抗病原入侵發(fā)揮重要作用[5,8]。目前，以水產(chǎn)動物為對象的研究報道相對較少，尚未見羅非魚清道夫受體SCARA4 相關(guān)報道。本研究對羅非魚SRA4基因（On-SRA4）進行克隆鑒定、亞細胞定位及定量分析，為獲得rOn-SRA4 蛋白，進一步研究羅非魚清道夫受體rOn-SRA4 奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）購自廣東湛江東海島研究基地，規(guī)格為(100±10) g。于水溫 (28±2)℃，光照周期12 h/d，24 h循環(huán)水系統(tǒng)中暫養(yǎng)4 周后備用。無乳鏈球菌 (Streptococcus agalctiae) ZQ0910、HEK293T細胞均取自廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室。

主要試劑：qPCR試劑盒 (TransStart Green qPCR SuperMix)、RNA提取試劑盒 (TransZol Up Plus RNAKit) 購自北京全式金公司，Premix ExTaq、克隆質(zhì)粒Transt-T1 載體、DNA Marker、Quick限制性內(nèi)切酶和反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Reverse Transcriptase M-MLV)購于TaKaRa 公司 (大連)，DNA凝膠回收純化試劑盒 (Thermo Scientific GeneJET) 和RNAlater購于Thermo公司；E.Z.N.A.Endo-Free plasmid DNA mini kit 試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司。DH5α購自武漢轉(zhuǎn)導生物實驗室，引物由生工生物股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1尼羅羅非魚總RNA提取及cDNA合成 取健康羅非魚6 尾，剖取鰓、腦、肌肉、中腸、頭腎、脾、肝、胸腺、皮膚組織，尾靜脈取血。按照全式金公司的TransZol Up Plus RNA Kit 說明書提取所有羅非魚組織RNA，再參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒Reverse Transcriptase M-MLV 說明書進行反轉(zhuǎn)錄，檢測On-SRA4的組織分布。

1.2.2尼羅羅非魚On-SRA4基因片段的擴增 從NCBI數(shù)據(jù)庫獲得On-SRA4基因序列，以羅非魚頭腎cDNA為模板，利用引物F與R (表1) 擴增獲得On-SRA4編碼區(qū)序列。PCR反應體系 (20 μL)：PremixTaq10 μL，ddH2O 7.5 μL，cDNA模板0.5 μL，上下游引物各1 μL。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測、目的條帶切膠回收，連接至pMD-18T，轉(zhuǎn)化至Trans5a感受態(tài)細胞。挑取單菌落進行菌落PCR檢測，陽性菌送至生工生物工程股份有限公司廣州測序部測序。

表1 引物名稱及序列Table 1 Primers and their sequences

1.2.3On-SRA4胞外段原核表達載體構(gòu)建 對測序正確的菌液和pET28a(+)提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒在 37 ℃下雙酶切15 min，純化回收酶切后的目的片段。將回收的目的片段與載體片段用T4 連接酶于 4 ℃下連接12 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α 感受態(tài)，方法同1.3.2。采用T7(F)、T7(R) 進行菌落PCR鑒定，選取陽性克隆菌測序。對測序吻合的菌液提取質(zhì)粒，并將提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 感受態(tài)。

1.2.4rOn-SRA4 的誘導表達 對構(gòu)建的PET28a-OnSRA4 表達載體原核菌種12 h，活化，待菌液OD600nm值為0.6 時，取部分菌液于超凈臺瓶，加入異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度 1 mmol/L，另1 瓶不加IPTG，兩瓶菌液均于搖床37 ℃、160 r/min條件下誘導5 h。收集誘導、未誘導菌液各2 mL，以12 000 r/min離心，棄上清液，沉淀用PBS重懸2 次，加入PBS重懸菌液50 μL，蛋白上樣緩沖液10 μL，混勻。于100 ℃水中煮沸5 min，離心，取上清液（全菌蛋白）進行SDS-PAGE 電泳檢測。

1.2.5尼羅羅非魚On-SRA4生物信息學分析 用InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)預測結(jié)構(gòu)域，ExPASy (http://web.expasy.org/protparam/)分析理化性質(zhì)。用SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測信號肽；利用在線軟件SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL (http://www.expasy.org) 模擬二級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)。用程序ClustalX對rOn-SRA4 氨基酸序列進行多重比對。用MEGA10.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.6尼羅羅非魚亞細胞定位分析 構(gòu)建pDsRed-Mon-N1-SRA4 真核表達載體，限制性酶切位點為NotI與BamH。按E.Z.N.A.Endo-Free plasmid DNA mini kit試劑盒說明書提取真核表達去內(nèi)毒素質(zhì)粒。將HEK-293T細胞接種至24 孔板，培養(yǎng)18 h，分別轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pDsRed-Mon-N1 和重組質(zhì)粒pDsRed-Mon-N1-SRA4。孵育48 h，經(jīng)PBS（pH=7）洗滌2 次，用體積分數(shù)4%多聚甲醛固定，PBS（pH=7）洗滌2 次。滴加1 μg/mL 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) 進行細胞核染色。用PBS（pH=7）清洗2 次，加入抗熒光猝滅封片劑封片，用激光共聚焦顯微鏡觀察、拍照。

1.2.7尼羅羅非魚攻毒實驗 攻毒實驗參照Han等[13]方法。取健康尼羅羅非魚，隨機分為3 組，每組21 尾，分別腹腔注射0.1 mL的1×107mL-1的滅活無乳鏈球菌、0.2 mg/mL的Poly I:C、無菌磷酸鹽緩沖液 (PBS，pH=7，對照)。在0、6、12、24、48、72、96 h時分別取羅非魚3 尾，剖取脾臟、胸腺、腸道和頭腎，迅速放入RNAlater中，于–80 ℃冰箱中保存。按照全式金公司的TransZol Up Plus RNA Kit 說明書提取所有組織RNA，再參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒Reverse Transcriptase M-MLV說明書進行反轉(zhuǎn)錄。

1.2.8尼羅羅非魚On-SRA4表達分析 根據(jù)On-SRA4基因全長序列的保守區(qū)，用Primer Premier 5.0 設計引物qRT-SRA4-475F、qRT-SRA4-563R，對照組β-actin蛋白為管家基因。qRT-PCR反應體系（10 μL）：引物 (10 μmol/L) 各0.5 μL，Mix 5 μL，ddH2O 2.5 μL，cDNA 0.5 μL。反應條件：95 ℃ 4 min；95 ℃20 s、56 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s，40 個循環(huán)；95 ℃ 15 s。使用Light Cycler96 實驗儀器，結(jié)果用2-ΔΔCt法計算，用GraphPad Prism 8 軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅非魚On-SRA4 的克隆與序列分析

羅非魚SRA4基因命名為On-SRA4（GenBank登錄號：MZ031929），編碼區(qū)序列全長2 289 bp，可編碼762 個氨基酸（圖1）。

圖1 羅非魚On-SRA4 及其推導的氨基酸序列Fig.1 Tilapia On-SRA4 and its deduced amino acid sequence

2.2 羅非魚rOn-SRA4 氨基酸序列理化性質(zhì)分析

理化性質(zhì)分析表明，rOn-SRA4 蛋白可編碼762個氨基酸，分子式為C3566H5678N1050O1156S34，其中甘氨酸 (Gly) 含量最高，占比10.2%，其次為異亮氨酸（Leu）(7.6%)，帶正電荷氨基酸為97 個，帶負電荷氨基酸為80 個，理論分子質(zhì)量為82.84 ku，等電點為5.37。不穩(wěn)定指數(shù)為39.09，為不穩(wěn)定蛋白，該基因編碼蛋白質(zhì)的理論親疏水性（GRAVY）平均水平為 -0.675（圖2），該蛋白質(zhì)為親水蛋白。蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，rOn-SRA4 蛋白在40～ 62位氨基酸存在一跨膜結(jié)構(gòu)域（圖3）。Signal P 5.0預測結(jié)果顯示，該序列不存在信號肽。

圖2 rOn-SRA4 蛋白親水/疏水性預測Fig.2 Prediction of hydrophilicity/hydrophobicity of rOn-SRA4 protein

圖3 rOn-SRA4 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預測分析Fig.3 Prediction of transmembrane domain of rOn-SRA4 protein

2.3 rOn-SRA4 蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域與空間結(jié)構(gòu)預測

圖4(A)顯示，rOn-SRA4 蛋白分別在第60～ 259位、174～ 437 位、456～ 518 和626～ 752 位存在典型的SMC結(jié)構(gòu)域、SMC-PROK-A結(jié)構(gòu)域、Collagen結(jié)構(gòu)域和CLECT結(jié)構(gòu)域，表明克隆的On-SRA4基因編碼蛋白屬于CLECT 超家族成員，二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果（圖4(B)）顯示，α螺旋在多肽鏈中為53.02%，無規(guī)則卷曲為35.43%，延伸鏈為7.74%，β轉(zhuǎn)角為3.81%。該蛋白形三維結(jié)構(gòu)呈簡單三級結(jié)構(gòu)（圖4(C)）。

圖4 rOn-SRA4 蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域預測與空間結(jié)構(gòu)分析Fig.4 Prediction of conserved domain and analysis of spatial structure of rOn-SRA4 protein

2.4 rOn-SRA4 蛋白序列表達特性與相關(guān)性分析

On-SRA4編碼的氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中其他物種rOn-SRA4 氨基酸序列的同源比對結(jié)果表明，rOn-SRA4 與布氏新亮麗鯛（Neolamprologus brichardi）、斑馬擬麗魚（Maylandia zebra）同源性較高，相似度分別為97.6%、96.7%，與尖吻鱸（Lates calcarifer）、大西洋鮭（Salmo salar）同源性較低，相似度分別為79.19%、58.6%，與現(xiàn)代人（Homo sapiens）同源性最低，相似度為49.3%（圖5）。比對發(fā)現(xiàn)，rOn-SRA4 在魚類中相對保守。

圖5 羅非魚rOn-SRA4 與其他物種rOn-SRA4 氨基酸序列比對Fig.5 Amino acid sequence alignment between tilapia rOn-SRA4 and other species

續(xù)圖5（Continued）

2.5 rOn-SRA4 蛋白序列的進化分析

構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹 (1 000 倍bootstrap) 表明，羅非魚rOn-SRA4 與尖吻鱸（Lates calcarifer）聚為一支，親緣關(guān)系最為接近，而在進化關(guān)系上遠離哺乳動物（圖6）。

圖6 N-J 法構(gòu)建rOn-SRA4 氨基酸系統(tǒng)進化樹Fig.6 Phylogenetic tree of rOn-SRA4 by neighbour-joining method

2.6 羅非魚rOn-SRA4 亞細胞定位分析

亞細胞定位結(jié)果如圖 7，在轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pDsRed-Mon-N1 的HEK-293T細胞中，Red紅色熒光在全細胞分布，而融合蛋白Red-Mon-SRA4 的紅色熒光在細胞核、細胞質(zhì)上呈點狀分布，表明羅非魚rOn-SRA4 主要定位于細胞核與細胞質(zhì)。

圖7 羅非魚rOn-SRA4 亞細胞定位Fig.7 Subcellular localization of rOn-SRA4 in tilapia

2.7 羅非魚On-SRA4 基因組織表達分析

圖8 表明，On-SRA4在羅非魚各組織中均有表達，在血液中表達量最高，其次是腸道、肌肉、皮膚、肝臟、胸腺，而頭腎、腦、鰓、脾臟表達量較低。

圖8 羅非魚On-SRA4 的組織表達Fig.8 Expression of On-SRA4 in different tissues of tilapia

2.8 羅非魚On-SRA4 時序表達

2.8.1羅非魚免疫后On-SRA4的表達 用滅活的無乳鏈球菌刺激健康羅非魚，羅非魚On-SRA4基因在腸道、胸腺、脾臟、頭腎的表達呈顯著性上調(diào)，呈現(xiàn)時序性表達，頭腎、脾臟的表達量在96 h 達到最高 (P＜ 0.01)，其余時間表達量較低，腸道表達量在48 h 達到最高 (P＜ 0.01)，胸腺表達量在24 h達到最高 (P＜ 0.01)（圖9）。

圖9 無乳鏈球菌感染后羅非魚On-SRA4 在各個組織中的時序表達Fig.9 Time-sequence expression of On-SRA4 in various tissues oftilapia infected with Streptococcus agalactiae

2.8.2Poly I:C病毒類似物刺激后羅非魚On-SRA4的表達變化 圖10 顯示，Poly I:C病毒類似物刺激后，羅非魚SRA4基因在腸道、胸腺、脾臟、頭腎的表達量均顯著上調(diào)，在腸道中刺激24 h時表達量最高；脾臟、胸腺均在6 h達到最高，隨后降低；在頭腎中

圖10 Poly I:C病毒類似物感染后羅非魚On-SRA4 在各個組織中的時序表達Fig.10 Time-sequence expression of On-SRA4 in various tissues of tilapia infected with Poly I:C

24 h表達量最高（P＜0.01)，其余時間表達量較低。

2.9 rOn-SRA4 原核表達鑒定

圖11 可見，未誘導的rOn-SRA4 在80 ku處未出現(xiàn)明顯條帶，經(jīng)IPTG誘導后在約80 ku處出現(xiàn)條帶，與預測蛋白質(zhì)大小一致，表明該蛋白誘導表達獲得成功，rOn-SRA4 在上清中表達量較低，主要在包涵體中表達。蛋白印跡實驗顯示，該蛋白質(zhì)為目標蛋白。

圖11 重組蛋白rOn-SRA4 原核表達鑒定Fig.11 Prokaryotic expression identification of the recombinant protein rOn-SRA4

3 討論

本研究克隆的羅非魚SRA4（On-SRA4）序列編碼區(qū)長2 289 bp，可編碼762 個氨基酸，理論分子質(zhì)量為82.84 ku，與人類SRA4大小接近。On-SRA4為親水蛋白，在第456～ 518 位氨基酸有A類清道夫受體特有的膠原樣結(jié)構(gòu)域，在第626～ 752 位氨基酸有與人、雞等類似的CLECT結(jié)構(gòu)域[4,14]。人類SRA4 的CLECT結(jié)構(gòu)域（607～ 732 位氨基酸）在結(jié)構(gòu)上與羅非魚高度相似，可識別、吞噬低密度脂蛋白等帶負電荷大分子物質(zhì)或大腸桿菌等病原微生物[15]。與人類不同的是，rOn-SRA4 有染色體ATP酶結(jié)構(gòu)域（SMC），該結(jié)構(gòu)與細胞增殖調(diào)控相關(guān)。亞細胞定位顯示，rOn-SRA4 主要在293T細胞核、細胞質(zhì)上呈現(xiàn)點狀分布。因此，rOn-SRA4 主要定位于細胞核和細胞質(zhì)上，在進化上相對保守，可能有識別、吞噬病原微生物及調(diào)控細胞周期的功能。

在哺乳動物中，SRA4主要表達于吞噬細胞、血管內(nèi)皮細胞[16-18]，可識別某些真菌、細菌并介導吞噬反應[18-19]，是誘導先天免疫和炎癥反應中不可或缺的受體之一[20]。魚類SRA4有先天免疫[6,11]、清除病原體[9,11,12,21]及在非特異性細胞毒性細胞[22]表面表達的功能。在斑馬魚中，SRA4在血管母細胞中表達，參與血小管和血管生成[5]。本研究中，On-SRA4在健康羅非魚所有組織中均有表達，但主要在血液和腸中表達。羅非魚血液中含紅細胞、吞噬細胞等多種免疫細胞。吞噬細胞主要發(fā)揮吞噬病原作用。羅非魚紅細胞轉(zhuǎn)錄組中含有大量模式識別受體，炎癥因子、受體，抗原提呈、處理分子等[23]免疫基因，是發(fā)揮免疫作用的重要組成部分。因此，推測On-SRA4與斑馬魚cl-p1(SRA4) 一樣在血管母細胞中表達，在血液中發(fā)揮識別、吞噬病原的作用。

魚類的免疫器官與組織主要有胸腺、腎臟、脾臟[24]。本研究中，健康羅非魚在滅活無乳鏈球菌刺激后，腸道、脾臟、頭腎、胸腺On-SRA4表達量均顯著上調(diào)，表明On-SRA4可被無乳鏈球菌所誘導，在羅非魚免疫抗感染過程發(fā)揮作用。同時，健康羅非魚在Poly I:C 病毒類似物刺激后，腸道、脾臟、頭腎、胸腺的On-SRA4表達量均顯著上調(diào)，脾臟中的表達量在刺激后6 h 即達最高值。脾臟、腸道和頭腎在羅非魚免疫中發(fā)揮重要作用，同時脾臟是T細胞分化成熟場所，因此，On-SRA4可被病毒類似物誘導表達，在羅非魚抗病毒感染過程中發(fā)揮作用。

原核蛋白表達系統(tǒng)有在短時間內(nèi)獲得大量重組蛋白等優(yōu)點，因而廣泛應用于各種研究[25]。本研究用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)，在1 mmol/L IPTG，37 ℃、160 r/min 條件下誘導5 h，成功誘導了rOn-SRA4 的表達，該蛋白主要表達于包涵體中。因膜蛋白在原核載體中表達多呈現(xiàn)為不溶性包涵體，需進一步優(yōu)化表達條件，獲取該蛋白制作多克隆抗體及進行體外細菌感染實驗，以探究其識別、吞噬病原微生物及調(diào)控細胞周期的功能。

4 結(jié)論

對羅非魚On-SRA4進行重組表達、亞細胞定位及組織分布分析，發(fā)現(xiàn)On-SRA4主要定位于細胞質(zhì)與細胞核，在魚類中較為保守，在各組織中均有表達，血液中表達量最高，無乳鏈球菌與病毒類似物刺激均可引起羅非魚On-SRA4表達量上調(diào)。因此，On-SRA4參與病原引起的免疫反應，是羅非魚抵抗病原的相關(guān)基因。原核表達系統(tǒng)為后續(xù)該蛋白的功能研究奠定基礎(chǔ)。