吳遠(yuǎn)彩,李日美,申光榮,黃 放,楊奇慧,譚北平,遲淑艷
(1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,廣東 湛江 524088;2.深圳市裕農(nóng)科技股份有限公司,廣東 深圳 518110)
凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)對(duì)鹽度和溫度的適應(yīng)范圍較廣,其蝦肉品質(zhì)好,生長迅速,是我國乃至世界上養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的對(duì)蝦之一[1-2]。小肽(Small peptide)是蛋白質(zhì)分解時(shí)的產(chǎn)物,是由2~ 4 個(gè)氨基酸構(gòu)成的一種高活性肽。研究發(fā)現(xiàn)人類組織可完整地利用小肽而直接參與蛋白質(zhì)合成[3]。小肽與氨基酸的吸收是兩個(gè)獨(dú)立的系統(tǒng),且小肽的吸收比氨基酸快,避免了兩者的吸收競爭,進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的代謝[4]。小肽可與礦物質(zhì)和金屬離子等物質(zhì)結(jié)合,形成小肽螯合物[5-6],推動(dòng)礦物質(zhì)和金屬離子在機(jī)體內(nèi)的吸收和沉積[7]。此外,小肽還有保護(hù)腸道健康和促進(jìn)腸道發(fā)育的功能。飼料中添加適量小肽有利于提高水產(chǎn)動(dòng)物生長,改善飼料效率,增強(qiáng)抗逆能力,從而提高成活率[8-9]。飼料中添加小肽可有效提升星斑川鰈(Platichthys stellatus)幼魚的生長性能[10]。適量大豆小肽蛋白替代魚粉對(duì)黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)的生長指標(biāo)、酶活和抗氧化能力無不良影響[11]。添加小肽可有效提升凡納濱對(duì)蝦的生長和抗病能力[12-13]。但不同小肽產(chǎn)品,促生長效果可能不盡相同。本研究分析飼料中添加小肽后,凡納濱對(duì)蝦幼蝦生長性能、抗氧化能力、非特異性免疫、腸道菌群組成,評(píng)估小肽在對(duì)蝦飼料中的應(yīng)用效果與適宜添加水平,為凡納濱對(duì)蝦飼料中小肽應(yīng)用研究提供理論依據(jù)。
小肽購自深圳裕農(nóng)生物技術(shù)有限公司,是酶解豆粕蛋白,分子質(zhì)量范圍見表1。在基礎(chǔ)飼料中分別添加0.0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%小肽(分別記為L0、L1、L2、L3、L4 和L5 組),配制成6 種飼料(表2)。全部飼料原料均過孔徑180 μm的篩,用模具粒徑為1.0 mm 和1.5 mm 的制粒機(jī)制成顆粒飼料,陰涼處風(fēng)干,于-20 ℃冰箱保存待用。
表1 小肽分子質(zhì)量分布Table 1 Molecular mass of small peptides
表2 基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 2 Composition and nutrient levels of basal diets(DM basis)
凡納濱對(duì)蝦幼蝦由廣東海興農(nóng)集團(tuán)有限公司提供,購進(jìn)后暫養(yǎng)30 d,蝦苗養(yǎng)殖全程使用購置的商品飼料。挑選體質(zhì)量為(0.47±0.01)g 的幼蝦960 尾,在0.3 m3的玻璃纖維桶中飼養(yǎng)8 周。設(shè)6個(gè)處理組,4 個(gè)重復(fù)組。實(shí)驗(yàn)前3 周每日按照幼蝦初始體質(zhì)量的8%~ 10%,以3∶2∶2∶3 的比例分別在7:30、12:00、16:30、21:00 投料,隔天換水1/3~ 1/2。后5 周根據(jù)蝦體大小和水質(zhì)調(diào)整投食量,每天換水1/3~ 2/3。養(yǎng)殖期間pH 為7.8~ 8.2,水溫在28.4~ 31.2 ℃,氨氮質(zhì)量濃度小于0.03 mg·L-1,連續(xù)充氣,溶解氧大于6.7 mg·L-1,海水鹽度26~ 28。
養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束時(shí),對(duì)蝦饑餓處理24 h,統(tǒng)計(jì)數(shù)量和質(zhì)量。隨機(jī)取對(duì)蝦10 尾,圍心腔抽血,離心,取上清,保存在-80 ℃,用于血清抗氧化和非特異性免疫的檢測;活蝦置于冰上剖取全腸,分別于凍存管中,保存在-80 ℃超低溫冰箱,用于腸道菌群分析。每個(gè)重復(fù)組隨機(jī)取蝦5 尾,保存于-20 ℃冰箱,用于全蝦體成分分析。
1.4.1生長性能指標(biāo) 主要為增重率(Weight gain rate,WGR)、飼料系數(shù)(Feed conversion rate,F(xiàn)CR)、特定生長率(Special growth rate,SGR)、成活率(Survival rate,SR)、蛋白質(zhì)效率(Protein efficiency ratio,PER)。
增重率(%)=(mt-m0)/m0,
飼料系數(shù)=攝食量干質(zhì)量/(mt-m0),
特定生長率=(lnmt-lnm0)/t,
成活率(%)=終末數(shù)量/ 初始數(shù)量,
蛋白質(zhì)效率=(mt-m0)/ 蛋白質(zhì)攝入量。
式中,mt為終末均體質(zhì)量(g);m0為初始均體質(zhì)量(g);t為試驗(yàn)持續(xù)時(shí)間(d)。
1.4.2飼料常規(guī)及全蝦體成分分析 飼料和全蝦常規(guī)分析參照AOAC(1995)[14]的方法。于105 ℃恒溫烘箱中烘干,測定飼料及全蝦樣品水分含量;粗蛋白質(zhì)含量用凱氏定氮法測定(KjeltecTM8400,Sweden);用索氏抽提法(石油醚作為提取溶劑)測定粗脂肪含量;粗灰分含量使用550 ℃馬弗爐灰化法測定。
1.4.3血清中非特異性免疫指標(biāo)和抗氧化酶活的測定 血清中溶菌酶 (LSZ)、超氧化物歧化酶(SOD)、總蛋白(TP)、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、總抗氧化(T-AOC)、丙二醛(MDA)、酚氧化物酶(PO)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力分別用南京建成生物研究所相應(yīng)的試劑盒測定,按照試劑盒說明書進(jìn)行。
1.4.4凡納濱幼蝦腸道菌群的測序分析 腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)由蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行16S rDNA 測序分析。使用Magen Hipure Soil DNA Kit(Qiagen,Germany)試劑盒提取基因組DNA,用檢測合格的PCR 引物擴(kuò)增原核生物16S rRNA 基因上包括V3 和V4 兩個(gè)高度可變區(qū),采用包含“CCTACGGRR BGCASCAGKVRVGAAT”序列的上游引物和包含“GGACTACNVGGGTWTCTAATCC”序列的下游引物擴(kuò)增V3 和V4 區(qū)。PCR 產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測。構(gòu)建 Meta Vx?文庫,使用Illumina MiSeq 測序,通過對(duì)讀數(shù)(Reads)拼接過濾、聚類,并進(jìn)行對(duì)蝦腸道微生物有效操作分類單元(Operational taxonomic units,OTUs)統(tǒng)計(jì),分析物種多樣性及腸道菌群結(jié)構(gòu),探討飼料中添加小肽對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的影響。
試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示,數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析,用Duncan’s 進(jìn)行多重比較,存活率數(shù)據(jù)則先進(jìn)行反正弦平方根轉(zhuǎn)換再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,設(shè)α=0.05。
由表3 可知,與L0 組相比,飼喂不同水平的小肽飼料對(duì)凡納濱對(duì)蝦幼蝦的成活率、特定生長率、蛋白質(zhì)效率均無顯著影響(P> 0.05);L1、L4 和L5 組幼蝦增重率顯著高于L0 組(P< 0.05);L1 組飼料系數(shù)顯著低于L0 組(P< 0.05),其余各組與L0 組無顯著差異(P> 0.05)。
表3 小肽對(duì)凡納濱對(duì)蝦幼蝦生長性能的影響Table 3 Effects of small peptides on growth performance of juvenile Litopenaeus vannamei
由表4 可知,小肽對(duì)凡納濱對(duì)蝦幼蝦粗脂肪含量、水分含量無顯著影響(P> 0.05);小肽組幼蝦粗蛋白含量顯著高于L0 組(P< 0.05);L3 組與L0 組幼蝦粗灰分含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),均顯著高于其余小肽組(P< 0.05)。
表4 小肽對(duì)凡納濱對(duì)蝦幼蝦體成分的影響Table 4 Effects of small peptides on body composition of juvenile Litopenaeus vannamei %
由表5 可知,小肽組幼蝦血清總蛋白(TP)含量、酚氧化物酶(PO)和酸性磷酸酶(ACP)活力顯著高于L0 組(P< 0.05);L0 組的堿性磷酸酶(AKP)活力與L5 組無顯著差異(P> 0.05),顯著低于其余小肽組(P< 0.05)。
表5 小肽對(duì)凡納濱對(duì)蝦幼蝦血清生化指標(biāo)的影響Table 5 Effects of small peptides on serum biochemical indexes of juvenile Litopenaeus vannamei
由表6 可知,小肽組幼蝦超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力和總抗氧化(T-AOC)均顯著高于L0 組(P< 0.05);小肽組幼蝦丙二醛(MDA)含量顯著低于L0 組(P< 0.05)。
表6 小肽對(duì)凡納濱對(duì)蝦幼蝦血清抗氧化能力的影響Table 6 Effects of small peptides on serum antioxidant activity of juvenile Litopenaeus vannamei
由表7 可知,經(jīng)過拼接、質(zhì)量控制后每個(gè)樣品平均產(chǎn)生153 392 條讀數(shù),質(zhì)量值大于等于30 的堿基數(shù)均超過總堿基數(shù)的90%,測序結(jié)果準(zhǔn)確;各樣品覆蓋指數(shù)均在0.998 以上,滿足測序質(zhì)量要求。
表7 凡納濱對(duì)蝦腸道測序序列數(shù)據(jù)量及測序質(zhì)量Table 7 Data quantity and sequencing quality of intestinal sequences of Litopenaeus vannamei
由圖1 可知,飼料中添加不同水平小肽對(duì)凡納濱對(duì)蝦全腸OTUs 數(shù)目無顯著影響(P >0.05)。全腸OTUs 數(shù)目最高值出現(xiàn)在L4 組。
圖1 小肽對(duì)凡納濱對(duì)蝦幼蝦全腸OTUs 數(shù)目的影響Fig.1 Effects of small peptides on the number of OTUs in whole intestine of juvenile Litopenaeus vannamei
如表8 可知,凡納濱對(duì)蝦全腸Ace、Chao1、Shannon、Simpson 指數(shù)均無顯著差異(P>0.05)。
表8 小肽對(duì)凡納濱對(duì)蝦全腸α 多樣性指數(shù)的影響Table 8 Effects of small peptides on α diversity index in whole intestine of Litopenaeus vannamei
如圖2(a)所示,在門水平上,豐度較高的主要有變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、軟壁菌門(Tenericutes)和厚壁菌門(Firmicutes)等。L0 組和L2 組的腸道細(xì)菌群落組成類似,兩個(gè)組別的優(yōu)勢菌群的豐度相對(duì)一致。各組間相比,L0 組幼蝦腸道中變形菌門、厚壁菌門相對(duì)豐度最高,L3 組幼蝦腸道中擬桿菌門相對(duì)豐度最低,軟壁菌門豐度最高。
圖2(b)表明,在綱水平上,主要優(yōu)勢菌有擬桿菌綱(Bacteroidia)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、柔膜菌綱(Mollicutes)和α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)。與L0 組相比,小肽組腸道中α-變形菌綱豐度增加,γ-變形菌綱豐度減少,并在L1 組最低。與其他處理組相比,L3 組腸道擬桿菌綱豐度降低,柔膜菌綱豐度增加。
圖2(c)表明,在屬水平上,除部分無法鑒別的菌屬(Unclassified)外,魯杰氏菌(Ruegeria)、Motilimonas菌、弧菌 (Vibrio)、Hopperia為優(yōu)勢菌屬。
圖2 凡納濱對(duì)蝦腸道細(xì)菌種群門(a)、綱(b)、屬(c)水平分布Fig.2 Distribution of bacterial population in gut of Litopenaeus vannamei at taxonomic level of phylum(a),class(b) and genus(c)
由圖3 可知,L1 組弧菌豐度顯著降低(P<0.05),其余各組間無顯著差異。
圖3 凡納濱對(duì)蝦腸道中弧菌屬豐度組間差異Fig.3 Differences between groups in the abundance of Vibrio spp.in gut of Litopenaeus vannamei
傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)消化、吸收理論認(rèn)為,蛋白質(zhì)在腸道內(nèi),在胰蛋白酶和糜蛋白酶作用下生成游離氨基酸和小肽,小肽在肽酶的作用下被完全水解成游離氨基酸,并以游離氨基酸形式進(jìn)入血液循環(huán)[15]。多種生物活性小肽(磷酸肽、阿片肽、內(nèi)啡肽、促泌肽等)可在消化過程中釋放出來,促進(jìn)消化道的蠕動(dòng),改善消化機(jī)能,促進(jìn)動(dòng)物生長[16]。本研究中,小肽添加組增重率均高于對(duì)照組,且L1 組最大,表明在凡納濱對(duì)蝦飼料中添加小肽可提高其生長性能。在星斑川鰈幼魚(Platichthys stellatus)[10]、牙鲆幼魚(Paralichthys olivaceus)[17]、雙棘原黃姑魚(Nibea diacanthus)[18]、日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)[19]研究中也得出類似的結(jié)果。
研究表明,在飼料中添加適量小肽對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成有促進(jìn)作用[11,20],血液循環(huán)中的小肽可直接參與組織蛋白質(zhì)的合成[21]。本研究中,添加小肽組全蝦粗蛋白均顯著高于對(duì)照組,表明飼料中添加小肽可提高凡納濱對(duì)蝦的蛋白質(zhì)合成。此外,各小肽添加組全蝦水分和粗脂肪與對(duì)照組無顯著差異,而各添加小肽組粗灰分均低于對(duì)照組,可能是因?yàn)槔业鞍琢姿犭?(CPP) 在動(dòng)物小腸內(nèi)可與鈣結(jié)合而阻止磷酸鈣沉淀的形成,從而導(dǎo)致全蝦粗灰分減少[15]。在星斑川鰈幼魚[10]的研究中也發(fā)現(xiàn),隨著飼料中小肽添加水平的上升,全魚的粗灰分出現(xiàn)下降趨勢,與本研究一致。
血液指標(biāo)是評(píng)價(jià)動(dòng)物機(jī)能狀態(tài)的重要指標(biāo)之一。血清中TP 除與機(jī)體合成蛋白質(zhì)的能力有關(guān),還與血液的代謝運(yùn)輸,維持滲透壓等息息相關(guān)[22],是機(jī)體非特異性免疫中極其重要的一部分[23]。本研究中,與L0 組相比,小肽組幼蝦血清總蛋白含量顯著提高,隨小肽添加量的增加,總蛋白含量呈先升后降的變化趨勢,L3 組最高,這與全蝦粗蛋白趨勢相似,兩者成正相關(guān)的關(guān)系。說明一定量的小肽提高了凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)蛋白質(zhì)沉積以及對(duì)蝦的免疫能力。AKP 是溶酶體的重要組成部分,可促進(jìn)磷酸物質(zhì)的水解和轉(zhuǎn)運(yùn),在對(duì)蝦機(jī)體免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[24-25],此外,AKP 與骨骼[26-27]和性腺[28]的發(fā)育有關(guān)。酸性條件下,ACP 對(duì)磷酸單酯進(jìn)行催化水解,生成無機(jī)磷酸,同時(shí)也對(duì)機(jī)體能量平衡和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等有重要作用[29-30]。本研究中,小肽組幼蝦血清ACP 活力顯著高于L0 組,而血清中AKP活力L0 和L5 組之間沒有顯著差異,顯著低于其余各組,總體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。表明添加一定量的小肽可增強(qiáng)對(duì)蝦的酸、堿性磷酸酶活力,這反映對(duì)蝦機(jī)體對(duì)外源性物質(zhì)污染防御強(qiáng)度,體液、細(xì)胞免疫綜合能力的提高。劉文斌等[31]在研究酶解豆粕對(duì)異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)的免疫酶活力時(shí)發(fā)現(xiàn),添加適量小肽可有效提高AKP 與ACP 酶的活力,與本研究一致,可能是因?yàn)樾‰脑隰~、蝦血清中酸、堿性磷酸酶的調(diào)節(jié)機(jī)制有相似性。
PO 是一種氧化酚類物質(zhì)的酶,其誘導(dǎo)產(chǎn)生的黑色素及中間代謝產(chǎn)物可殺死入侵蝦體的微生物和寄生蟲,機(jī)體缺乏抗氧化酶會(huì)導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂和阻礙信號(hào)傳導(dǎo),嚴(yán)重時(shí)還會(huì)導(dǎo)致機(jī)體死亡[32-33]。陳永康等[34]用富含小肽的酵母水解物飼料飼喂低溫脅迫條件下的凡納濱對(duì)蝦,有助于提高其血清中的PO 活力,增強(qiáng)機(jī)體的抵抗力。楊奇慧等[35]研究表明,飼料中添加富含小肽的酶解植物蛋白時(shí),凡納濱對(duì)蝦血清中PO 的活力隨著添加水平的提高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。本研究中,添加小肽可提高凡納濱對(duì)蝦血清的PO 活力,增強(qiáng)其抵抗外界侵染的能力,與前人的結(jié)果基本一致。
機(jī)體內(nèi)的SOD與GSH-Px形成具有抗氧化能力的保護(hù)系統(tǒng),可抵御氧化物的干擾和損傷[36-37]。SOD 有抗炎、抗病毒及抗氧化等多種功能,是機(jī)體內(nèi)常見的抗氧化酶,主要清除超氧陰離子。GSH-Px可消除機(jī)體內(nèi)過多的過氧化物,使體內(nèi)自由基保持在低水平,維持生物膜的功能。脂質(zhì)過氧化時(shí)產(chǎn)生的MDA 會(huì)導(dǎo)致機(jī)體生物膜的結(jié)構(gòu)異變與功能紊亂,MDA 含量一定程度上可反映機(jī)體受自由基損害的程度。研究表明,飼料中添加小肽可提高在低溫脅迫條件下的小黃魚(Larimichthys polyactis)的GSH-Px 活力[38],飼料中添加大豆酶解蛋白可顯著提高凡納濱對(duì)蝦血清中SOD 活力[39],凡納濱對(duì)蝦血清MDA 含量在適量添加酵母培養(yǎng)物后下降,抗氧化能力有所提高[40]。本研究中,小肽組SOD、GSH-Px 以及T-AOC 顯著升高,MDA 的含量顯著降低,其中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%小肽的L1 組SOD、GSH-Px 以及T-AOC 最高,表明在凡納濱對(duì)蝦飼料中添加小肽,可提高機(jī)體抗氧化酶活力,提高自身免疫能力,形成完善的抗氧化系統(tǒng),減輕過氧化物對(duì)機(jī)體的損傷。
腸道菌群在動(dòng)物消化吸收過程中有至關(guān)重要作用,其分泌的各種代謝產(chǎn)物還直接或間接影響動(dòng)物的機(jī)體健康[41-43]。在腸道菌群研究中,Ace 指數(shù)、Chao1 指數(shù)、Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)等α 多樣性指數(shù)可指示腸道微生物的豐富度[44]。本研究中,4 種α 多樣性指數(shù)均無顯著差異,表明在飼料中添加小肽,對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道微生物群豐富度無顯著影響。可能是因?yàn)閷?duì)蝦腸道對(duì)微生物系統(tǒng)提供一定的庇護(hù)作用,微生物群落的整體豐富度和多樣性不易改變[44-45]。
對(duì)蝦腸道中主要細(xì)菌類群在門水平上為變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門[46],在綱水平上為γ-變形菌綱和α-變形菌綱[47]。本研究有類似結(jié)果,凡納濱幼蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)在門水平上的變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和綱水平上擬桿菌綱、γ-變形菌綱、α-變形菌綱占主要優(yōu)勢。在屬水平上,凡納濱幼蝦腸道主要優(yōu)勢菌為魯杰氏菌、Motilimonas菌、弧菌和Hopperia菌?;【呛Q笾械膬?yōu)勢菌屬,也是海水養(yǎng)殖動(dòng)物的主要致病菌之一[48]。何遠(yuǎn)法等[49]研究發(fā)現(xiàn),增加酵母培養(yǎng)物可降低凡納濱對(duì)蝦腸道的弧菌數(shù)量。本研究有類似結(jié)果,L1 組弧菌相對(duì)豐度顯著降低,表明在飼料中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%小肽可降低凡納濱對(duì)蝦腸道弧菌數(shù)量,可在一定程度上抑制弧菌毒性,降低凡納濱對(duì)蝦感染腸炎的風(fēng)險(xiǎn)。
本研究表明,飼料中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的小肽可提高凡納濱對(duì)蝦的增重率,降低飼料系數(shù),促進(jìn)凡納濱對(duì)蝦生長,提高抗氧化能力和非特異性免疫力,降低弧菌數(shù)量,減輕不良菌群對(duì)腸道的侵害作用。