范智敏 劉禮劍 王正根

1 南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南省衡陽(yáng)市 421001； 2 湖南省漢壽縣人民醫(yī)院內(nèi)鏡室； 3 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院

在我國(guó)，結(jié)直腸癌在癌癥相關(guān)死因中已躍居第三位，成為男性第三大常見(jiàn)腫瘤和女性第二大常見(jiàn)腫瘤[1]。順鉑是用于治療實(shí)體瘤的最有效和廣泛使用的抗癌劑之一。不幸的是，許多癌癥最初對(duì)順鉑有反應(yīng)，但隨后腫瘤復(fù)發(fā)常難以進(jìn)行鉑類治療，導(dǎo)致耐藥的發(fā)生[2]。因此，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性成為熱點(diǎn)。

JAK蛋白家族是一類非受體型酪氨酸激酶，分4個(gè)亞型，STAT家族是其下游信號(hào)蛋白， STAT3作為JAK/STAT信號(hào)通路的重要成員，主要參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)[3]用小分子酪氨酸激酶抑制劑ZD6474(ZactimamTM,Vandetanib) 能夠抑制p-STAT3 的表達(dá)，并誘導(dǎo)伊馬替尼耐藥細(xì)胞凋亡。 因此，STAT3與腫瘤細(xì)胞的耐藥性有著密不可分的關(guān)系。

研究發(fā)現(xiàn)，鐵死亡誘導(dǎo)劑能夠增強(qiáng)化療藥物(如替莫唑胺、順鉑、阿糖胞苷/阿拉伯糖和多柔比星/阿霉素)在某些癌細(xì)胞中的有效性。例如，索拉非尼是第一種用于全身治療晚期肝細(xì)胞癌的藥物，其機(jī)制是通過(guò)誘導(dǎo)這些腫瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。青蒿琥酯最近也被證明可通過(guò)誘導(dǎo)鐵和ROS依賴性細(xì)胞死亡抑制人胰腺癌和卵巢癌細(xì)胞的增殖[4]。因此，推測(cè)鐵死亡可能在調(diào)節(jié)順鉑敏感性和耐藥性中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究中評(píng)估了鐵壞死在結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性的作用及其涉及的機(jī)制，闡明了結(jié)腸癌細(xì)胞順鉑耐藥性發(fā)展的新分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑 0.25%Trypsin-EDTA購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，DMEM培養(yǎng)基、CCK-8試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物公司、胰蛋白酶購(gòu)自上海仁捷生物公司，青霉素、鏈霉素、阿霉素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，順鉑購(gòu)于江蘇豪森公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)條件和耐藥細(xì)胞株HT29/DDP、SW480/DDP的建立

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)條件：結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480及HT-29購(gòu)自賽百慷(上海)生物技術(shù)有限公司，在實(shí)驗(yàn)室10%胎牛血清細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，選擇融合度達(dá)到90%以上的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[5]。

1.2.2 藥物誘導(dǎo)耐藥：采用大劑量沖擊與逐步增加劑量相結(jié)合的方法來(lái)誘導(dǎo)HT29、SW480細(xì)胞的順鉑耐藥。使用不同濃度順鉑處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT29、SW480細(xì)胞，鏡下觀察后選出HT29、SW480對(duì)順鉑的最低耐受濃度。用質(zhì)量濃度為1μg/ml的順鉑與進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT29、SW480細(xì)胞共同培養(yǎng)24h后，更換不含順鉑的培養(yǎng)液，待細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)后傳代，重復(fù)上述步驟5次后將順鉑濃度更換為2μg/ml，繼續(xù)重復(fù)上述操作5次，再更換為5μg/ml的順鉑處理細(xì)胞3次。直至HT29、SW480細(xì)胞在5 μg/ml濃度下穩(wěn)定生長(zhǎng)和傳代，表明耐藥誘導(dǎo)成功，同時(shí)將該誘導(dǎo)細(xì)胞命名為HT29/DDP、SW480/DDP[6]。

1.2.3 CCK法測(cè)細(xì)胞活力：將結(jié)腸癌細(xì)胞以2×104/ml的密度接種于96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組加入與模型組細(xì)胞加藥量等體積的DMSO溶液后，培養(yǎng)0h、12h、24h、48h、72h。接著在每孔中加入10μl的CCK-8溶液，培養(yǎng)箱孵育1h后用酶標(biāo)儀測(cè)出其光密度值D(450nm)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[2]。

1.2.4 細(xì)胞活性氧水平測(cè)定： 2’，7’-二氯二氫氟醚(DCFH-DA)探針本身是無(wú)熒光的，但其在進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后可水解成2’，7’-二氯二氫熒光素(DCFH)。水解后形成的DCFH能夠被活性氧氧化成高熒光的二氯熒光素(DCF)，可作為細(xì)胞內(nèi)活性氧生成的檢測(cè)指標(biāo)。將細(xì)胞分別置于96孔板中，在培養(yǎng)箱37℃孵育30min后盡快洗滌細(xì)胞降低背景后進(jìn)行ROS檢測(cè)。

1.2.5 丙二醛(MDA)檢測(cè)：本文采用硫代巴比妥酸比色法來(lái)檢測(cè)MDA水平。原理為：過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的MDA可與硫代巴比妥酸結(jié)合，形成紅色復(fù)合物，該復(fù)合物在532nm處有最大吸收峰。

1.2.6 Western blot：提取細(xì)胞蛋白，蛋白定量后進(jìn)行制膠、SDS-PAGE 凝膠電泳并電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，接著使用5%的脫脂奶粉封閉2h，洗膜后一抗(1∶1 000)封閉過(guò)夜，二抗(1∶2 000)孵育 2h，最后加 ECL 顯影。GAPDH作為內(nèi)參照。根據(jù)(目的蛋白凈面積值)/(GAPDH凈面積值)計(jì)算出各目的蛋白的相對(duì)含量(%)。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥與STAT3信號(hào)通路增強(qiáng)有關(guān) 為了研究結(jié)腸癌細(xì)胞的順鉑耐藥是否與STAT3信號(hào)通路有關(guān)，首先用25%的順鉑連續(xù)培養(yǎng)得到順鉑耐藥結(jié)腸癌細(xì)胞HT29/DDP、SW480/DDP。接著通過(guò)Western Blot檢測(cè)順鉑耐藥株與敏感株的STAT3通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示：與敏感株相比, 耐藥株的p-STAT3(Ser727)、Nrf2、GPx4蛋白表達(dá)增加；提示在耐藥株中STAT3信號(hào)通路增強(qiáng)。并且，在這里發(fā)現(xiàn)GPX4蛋白表達(dá)增加，提示耐藥株鐵死亡受到抑制，由此猜測(cè)結(jié)腸癌的順鉑耐藥與STAT3信號(hào)通路的增強(qiáng)從而抑制癌細(xì)胞鐵壞死有關(guān)(圖1)。

圖1 順鉑處理后的HT29細(xì)胞及SW480細(xì)胞

2.2 結(jié)腸癌細(xì)胞耐藥與鐵死亡受到抑制有關(guān) 為了證實(shí)結(jié)腸癌細(xì)胞的順鉑耐藥與鐵死亡受到抑制有關(guān)，接著檢測(cè)了結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞活力以及 ROS、MDA水平。結(jié)果顯示：與敏感株+順鉑組相比，耐藥株+順鉑干預(yù)組的細(xì)胞活力增強(qiáng)(圖2)。而ROS和MDA水平下降(圖3)，提示該組鐵死亡處于抑制狀態(tài)。

圖2 順鉑處理后的HT29及SW480細(xì)胞活力

圖3 順鉑處理后的HT29及SW480細(xì)胞ROS

2.3 促進(jìn)鐵死亡可以增加結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性 為了進(jìn)一步驗(yàn)證：促進(jìn)鐵死亡可以增加結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，使用了鐵死亡激活劑Erastin和RSL3聯(lián)合順鉑來(lái)處理HT29/DDP、SW480/DDP細(xì)胞，接著分別統(tǒng)計(jì)了結(jié)腸癌細(xì)胞0h、12h、24h、48h、72h的細(xì)胞活力。結(jié)果顯示：鐵死亡誘導(dǎo)組(Erastin, RSL3組)的細(xì)胞活力明顯低于耐藥組，其中處理時(shí)間為48h時(shí)差異最明顯(圖4)； 并且鐵死亡誘導(dǎo)組的MDA、ROS的水平均明顯增加(圖5)。以上結(jié)果共同表明，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的鐵死亡可以增加其對(duì)順鉑的敏感性。

圖4 Erastin和RSL3處理的HT29以及SW480細(xì)胞后細(xì)胞活力

圖5 Erastin和RSL3處理的HT29以及SW480細(xì)胞后ROS

2.4 抑制STAT3信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)了順鉑誘導(dǎo)的鐵壞死抑制 接著為了確定結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥與STAT3信號(hào)通路的增強(qiáng)有關(guān)，在使用順鉑的基礎(chǔ)上使用了STAT3信號(hào)抑制劑處理HT29/DDP、SW480/DDP細(xì)胞。結(jié)果顯示：STAT3抑制劑組的細(xì)胞活力相較于耐藥組與順鉑處理組而言是降低的(圖6)；MDA、ROS的水平均明顯增加(圖7)，提示鐵死亡增加； WB結(jié)果顯示抑制劑能使Nrf2、GPx4表達(dá)量增加 (圖8)，說(shuō)明STAT3信號(hào)通路受到明顯抑制，而促進(jìn)鐵死亡。以上結(jié)果表明：抑制STAT3信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)了順鉑誘導(dǎo)的鐵壞死抑制，促進(jìn)藥物對(duì)順鉑的敏感性。

圖8 STAT3的抑制增加HT29及SW480細(xì)胞Nrf2、GPx4的表達(dá)

3 討論

結(jié)腸癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，嚴(yán)重危害人類健康，其發(fā)病率在發(fā)達(dá)的歐美國(guó)家僅次于肺癌。在我國(guó)，隨著飲食習(xí)慣、生活方式及環(huán)境因素等的變化，結(jié)腸癌發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)[2]。化療是目前結(jié)腸癌患者的主要治療手段之一，主要為鉑類藥物，但伴隨鉑類藥物的廣泛使用，結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)順鉑類藥物逐漸出現(xiàn)耐藥的現(xiàn)象，并且這也是目前化療失敗的最常見(jiàn)原因之一[4]。 因此，探索新型的高效低毒的靶向抗癌藥物對(duì)結(jié)腸癌的藥物治療顯得尤其重要。

圖6 STAT3的抑制降低HT29以及SW480細(xì)胞的細(xì)胞活力

圖7 STAT3的抑制增加HT29以及SW480細(xì)胞的ROS和MDA

信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子是介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子家族，具有傳遞胞質(zhì)信號(hào)和啟動(dòng)核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄的雙重功能，其中STAT3與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后相關(guān)。近年來(lái)研究證明，STAT3信號(hào)通路的異常激活可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物耐藥，成為評(píng)價(jià)病情及預(yù)后的指標(biāo)之一[3]。本文的研究也證實(shí)了在耐藥株中STAT3信號(hào)通路是處于異常激活的狀態(tài)，說(shuō)明了結(jié)腸癌細(xì)胞的順鉑耐藥與STAT3信號(hào)通路的異常激活狀態(tài)確實(shí)有關(guān)，證實(shí)了STAT3在腫瘤耐藥中的重要作用。

2012年，Stockwell小組確定了鐵死亡：一種新型的受調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡。它是鐵依賴性和過(guò)氧化驅(qū)動(dòng)的非凋亡性程序性細(xì)胞死亡模式，其特征在于致死的脂質(zhì)活性氧(ROS)的積累[7]。脂質(zhì)修復(fù)酶谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4(GPX4)通過(guò)限制脂質(zhì)氫過(guò)氧化物水平，而被認(rèn)為是鐵蛋白沉積癥的負(fù)調(diào)控因子[8]。研究已經(jīng)證實(shí)了在各種腫瘤細(xì)胞中存在鐵死亡，如纖維肉瘤、肺癌、骨肉瘤、腎癌和前列腺癌細(xì)胞[9-12]。盡管鐵死亡與人類疾病有關(guān)，但其精確的調(diào)節(jié)機(jī)制和生物學(xué)功能仍然難以琢磨。與此研究相一致的是：本研究結(jié)果顯示耐藥菌株的鐵死亡水平低于對(duì)照組，并且呈現(xiàn)出細(xì)胞活力增強(qiáng)，ROS和MDA降低，GPx4蛋白表達(dá)水平降低的現(xiàn)象，驗(yàn)證了結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞活力受抑制是因?yàn)殍F死亡處于抑制狀態(tài)的原因。為了進(jìn)一步驗(yàn)證：在耐藥株加入順鉑的同時(shí)分別使用了鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin、RSL3處理結(jié)腸癌細(xì)胞，結(jié)果表明，使用了鐵死亡誘導(dǎo)劑的結(jié)腸癌細(xì)胞組的細(xì)胞活力下降伴隨著鐵死亡的增加，說(shuō)明促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的鐵壞死能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞活力。證實(shí)了鐵死亡在結(jié)腸癌細(xì)胞耐藥中的重要作用。

為了更好地驗(yàn)證STAT3是否與鐵死亡有關(guān)，在對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞使用順鉑之后加入了STAT3抑制劑。并且檢測(cè)了鐵死亡相關(guān)蛋白與細(xì)胞活力等，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活力下降，鐵死亡水平增加，表明了STAT3的抑制會(huì)增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞的鐵死亡，從而緩解癌細(xì)胞的耐藥，在這個(gè)過(guò)程中，雖然STAT3激活可能是由不同途徑誘導(dǎo)的，但我們的研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)STAT3抑制可以降低結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞活力，增加結(jié)腸癌細(xì)胞的鐵死亡。

綜上所述，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的鐵壞死能夠增強(qiáng)其對(duì)順鉑的敏感性，為臨床上結(jié)腸癌的治療提供了新的思路。