趙文軒，朱清揚(yáng)，張?zhí)N暉

復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院/公共衛(wèi)生安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032

懷孕對(duì)于母親及子代都是至關(guān)重要的一個(gè)過程［1］，在這一過程中，母體內(nèi)的代謝發(fā)生巨大的改變［2］，如血糖水平升高及游離脂肪酸水平改變等［3］。這些生理性調(diào)節(jié)不僅為母體分娩和哺乳做好適應(yīng)性準(zhǔn)備，也可以滿足胎兒生長發(fā)育的需求。不適宜的代謝調(diào)節(jié)會(huì)導(dǎo)致妊娠期糖尿病、妊娠期高血壓綜合征等妊娠期代謝性疾病［4-5］，進(jìn)而對(duì)子代的體格發(fā)育、神經(jīng)發(fā)育等造成不良影響［6-7］。既往研究顯示，細(xì)顆粒物（fine particulate matter，PM2.5）作為一種典型的空氣污染物，是一系列妊娠期代謝性疾?。ㄈ缛焉锲谔悄虿?、子癇前期、甲狀腺功能紊亂等）的危險(xiǎn)因素［8-10］，但其背后的生物學(xué)機(jī)制尚不明確。

近年來，代謝組學(xué)技術(shù)的發(fā)展與成熟為揭示PM2.5的代謝效應(yīng)提供了有力的工具，高通量的代謝組學(xué)方法已被應(yīng)用于大氣污染的健康效應(yīng)研究［11］。如Li等［12］在一項(xiàng)橫斷面研究中，對(duì)180 名研究對(duì)象的血清進(jìn)行高通量代謝組學(xué)檢測，探究與短期暴露于交通相關(guān)空氣污染相關(guān)的代謝通路，發(fā)現(xiàn)NO2、元素碳可干擾氧化應(yīng)激、營養(yǎng)代謝等通路。現(xiàn)階段，由于暴露評(píng)估手段的限制，只有少數(shù)研究對(duì)人體PM2.5暴露與代謝組的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了探討［13-15］。其中Yan 等［13］對(duì)160 名妊娠期婦女開展了代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)孕前三個(gè)月PM2.5高暴露組（PM2.5質(zhì)量濃度中位數(shù)為330 μg·m-3，四分位數(shù)間距為230 μg·m-3）氧化應(yīng)激及炎癥相關(guān)通路發(fā)生改變。雖然該研究關(guān)注了PM2.5長期暴露，但測量僅局限于單一時(shí)間點(diǎn)。相較于單次測量，重復(fù)測量可以校正個(gè)體差異對(duì)結(jié)果的影響，而這一差異在代謝相關(guān)研究中尤為重要。

現(xiàn)有研究已部分揭示了PM2.5暴露對(duì)機(jī)體新陳代謝的影響，提示脂質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)相關(guān)通路可能在PM2.5的健康效應(yīng)中發(fā)揮一定的作用［16-19］。然而各研究結(jié)果不盡相同，且妊娠期PM2.5累積暴露對(duì)妊娠期代謝的影響及其潛在代謝機(jī)制仍不明確。因此，本研究擬通過氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜（gas chromatography-time-of-flight-mass spectrometry，GCTOF-MS）和超高效液相色譜-組合型四級(jí)桿Orbitrap質(zhì)譜（ultra-high-performance liquid chromatography-Q exactive orbitrap mass spectrometry，UHPLC-QE-MS）雙平臺(tái)高通量非靶向代謝組學(xué)技術(shù)獲取孕婦在妊娠期的血清代謝物譜數(shù)據(jù)，探討妊娠期PM2.5暴露與血清代謝組的關(guān)聯(lián)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

基于上海親子隊(duì)列（Shanghai Maternal-Child Pair Cohort，Shanghai MCPC），本研究從329 名進(jìn)行PM2.5個(gè)體暴露采樣的妊娠期婦女中，隨機(jī)選取50 名具有完整妊娠期隨訪數(shù)據(jù)、單胎活產(chǎn)且無妊娠期并發(fā)癥（包括但不限于妊娠期高血壓、妊娠期糖尿病）的健康孕婦，并從上海親子隊(duì)列問卷信息庫中獲取其基本人口學(xué)信息。本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)：IRB#2016-04-0587-EX）。

1.2 PM2.5暴露評(píng)估

研究對(duì)象分別在孕早中期、孕晚期經(jīng)歷兩次連續(xù)72 h PM2.5個(gè)體采樣，并結(jié)合衛(wèi)星數(shù)據(jù)和時(shí)間-活動(dòng)模式等變量構(gòu)建個(gè)體PM2.5預(yù)測模型，模型R2=0.77，具體采樣方案及模型的構(gòu)建見先前報(bào)道［20］。其中時(shí)間-活動(dòng)模式指孕婦在不同活動(dòng)模式下所花費(fèi)的時(shí)間，第一次采樣前的時(shí)間-活動(dòng)模式以同期問卷記錄為準(zhǔn)，其他時(shí)間-活動(dòng)模式通過線性混合效應(yīng)模型平滑獲得，并采用空氣凈化器使用時(shí)間及停止工作日期校準(zhǔn)模型預(yù)測值。取兩次采樣結(jié)束日期前三個(gè)月的平均PM2.5個(gè)體暴露濃度，探討妊娠期PM2.5累積暴露與血清代謝組的關(guān)聯(lián)。

1.3 代謝組學(xué)檢測

血清樣本來自兩次采樣同期產(chǎn)檢時(shí)留存的樣本，自采血日起于復(fù)旦大學(xué)生物樣本庫-80℃條件下凍存，直至檢測。

1.3.1 GC-TOF-MS 法代謝組學(xué)檢測GC-TOF-MS 法適用于分子量跨度較大的代謝組學(xué)研究。質(zhì)譜數(shù)據(jù)的峰提取、矯正、解卷積、峰積分及峰對(duì)齊等處理均在ChromaTOF（版本4.3x）軟件中完成。

1.3.2 UHPLC-QE-MS 法代謝組學(xué)檢測相較以往的液相色譜-質(zhì)譜法，UHPLC-QE-MS 法具有更高的速度、靈敏度、分辨率及特異性，是定性、定量篩查的一種理想方法。分別對(duì)陰離子、陽離子模式下的數(shù)據(jù)進(jìn)行前處理。原始數(shù)據(jù)的保留時(shí)間校正、峰識(shí)別、提取、積分及對(duì)齊等工作均使用R 語言（版本3.5.2）的XCMS包（版本3.12）完成。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用主成分分析法評(píng)價(jià)血清代謝組學(xué)檢測結(jié)果的穩(wěn)定性。運(yùn)用線性混合效應(yīng)模型探討妊娠期PM2.5暴露對(duì)血清代謝組的影響，模型校正變量包括孕婦的年齡、體重指數(shù)（body mass index，BMI）、孕周、產(chǎn)次、孕期增重、職業(yè)及家庭年收入等。為避免引入大量的假陽性錯(cuò)誤，本部分研究基于Benjamini 等［21］提出的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）估計(jì)方法，進(jìn)一步校正了模型中的P值，記為PFDR。進(jìn)入通路分析的代謝物需同時(shí)滿足在混合效應(yīng)模型中P＜0.05 且PFDR＜0.05。

1.5 代謝通路分析及代謝物定性

使用Python（版本3.0）語言環(huán)境下的mummichog工具為與PM2.5暴露相關(guān)的UHPLC-QE-MS 代謝組學(xué)信號(hào)峰進(jìn)行通路注釋。mummichog 算法的假設(shè)是與某一生物學(xué)機(jī)制真正相關(guān)的代謝物必然在人體代謝物網(wǎng)絡(luò)中呈現(xiàn)一定的空間聚集性，而假陽性結(jié)果則應(yīng)服從隨機(jī)分布（Gamma 分布），該算法通過Gamma 分布的累積分布函數(shù)對(duì)通路富集結(jié)果進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)。該方法同時(shí)考慮了代謝物定性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的意義及在生物學(xué)上的合理性，已被廣泛應(yīng)用于非靶向代謝組學(xué)的研究中［17，22］。

選用xMSannotator 工具對(duì)UHPLC-QE-MS 法所識(shí)別的信號(hào)峰進(jìn)行定性分析，該方法同時(shí)考慮了物質(zhì)在不同離子模式下所有潛在的加和態(tài)類型及其在特定代謝通路中與上下游產(chǎn)物的共表達(dá)信息，還可根據(jù)聚類及質(zhì)荷比等信息為代謝物定性給出置信度評(píng)分［23］。所有相關(guān)過程均在R 語言（版本3.5.2）環(huán)境下完成。

GC-TOF-MS法測得代謝物通過匹配實(shí)驗(yàn)室自有標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)庫及外部公開數(shù)據(jù)庫中的代謝物特征信息（保留時(shí)間、質(zhì)荷比）完成定性，包括京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）、人類代謝組數(shù)據(jù)庫（Human Metabolome Database，HMDB），相似度閾值為0.7。通過富集分析完成代謝物通路分析。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象基本人口學(xué)特征及暴露水平

如表1所示，研究對(duì)象平均年齡為（29.31±3.83）歲，孕早中期BMI 為（22.57±2.87）kg·m-2，92%的研究對(duì)象文化程度為大專及以上。該部分孕婦與所有參與PM2.5個(gè)體暴露采樣的孕婦的基本人口學(xué)信息的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 研究對(duì)象基本人口學(xué)信息及PM2.5暴露水平Table 1 Socio-demographic characteristics and PM2.5 exposure levels of participants

研究對(duì)象分別在懷孕的第（17.88±0.81）周、第（32.54±1.26）周接受孕早中期、孕晚期血清代謝組學(xué)檢測，檢測前三個(gè)月PM2.5平均暴露水平分別為（44.03±8.74）、（40.31±6.33）μg·m-3，且二者的數(shù)值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。此外，孕婦的體重隨懷孕進(jìn)程顯示出明顯增長，相較孕早中期而言，孕晚期平均體重增長了約8 kg，BMI相應(yīng)增長了約3 kg·m-2。

2.2 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)質(zhì)控

質(zhì)控樣本在UHPLC-QE-MS 陽離子、陰離子模式及GC-TOF-MS 下測得代謝物的主成分分析結(jié)果見圖1。樣本均在由主成分1、主成分2 及主成分3 組成的三維空中間呈緊密團(tuán)狀分布，提示代謝組學(xué)測定結(jié)果較為穩(wěn)定。

圖1 質(zhì)控樣本GC-TOF-MS及UHPLC-QE-MS 主成分分析結(jié)果Figure 1 Principal component analysis results of quality control samples by GC-TOF-MS and UHPLC-QE-MS

2.3 妊娠期PM2.5暴露與血清代謝組的關(guān)聯(lián)

如表2所示，血清GC-TOF-MS 代謝組學(xué)檢測共測得415 個(gè)信號(hào)峰，其質(zhì)荷比分布在57～459 之間，其中有301 個(gè)信號(hào)峰得到了準(zhǔn)確定性。UHPLC-QE-MS 陽離子、陰離子模式分別檢測到5 436、3 510個(gè)信號(hào)峰，其質(zhì)荷比分布在71～983及70～998之間。

表2 各檢測方法中與PM2.5相關(guān)的代謝物（信號(hào)峰）數(shù)量Table 2 Number of metabolites (signal peaks) related to PM2.5 by different detection methods

線性混合效應(yīng)模型初步分析結(jié)果顯示，GC-TOFMS 法檢測的代謝物中有30 個(gè)信號(hào)峰與妊娠期PM2.5相關(guān)，UHPLC-QE-MS 陽離子、陰離子模式結(jié)果中分別有2 110、675 個(gè)信號(hào)峰與PM2.5暴露相關(guān)。校正FDR 之后，這一數(shù)字分別降低至19、1 903與179。

mummichog 通路分析結(jié)果顯示，妊娠期PM2.5暴露主要影響了15 條相關(guān)代謝通路（表3）。其中，前列腺素的γ 亞麻酸合成、白細(xì)胞三烯代謝及維生素E 代謝通路在陽離子、陰離子模式中均被發(fā)現(xiàn)與妊娠期PM2.5暴露相關(guān)（GammaP＜0.05）。此外，在陽離子模式中額外發(fā)現(xiàn)了PM2.5暴露可以影響脂肪酸激活、脂肪酸代謝、脂肪酸氧化、Ω-3 脂肪酸代謝等相關(guān)通路。在陰離子模式中額外發(fā)現(xiàn)了PM2.5暴露可以影響前列腺素的花生四烯酸合成、維生素A 代謝及C21 甾類激素的生物合成及代謝等生物通路。這些通路主要涉及的生物學(xué)機(jī)制包括外源性化學(xué)物介導(dǎo)的氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)及脂肪酸代謝等。

表3 與妊娠期PM2.5暴露相關(guān)的代謝通路Table 3 Metabolic pathways related to gestational PM2.5 exposure

進(jìn)一步運(yùn)用xMSannotator 工具對(duì)代謝物進(jìn)行UHPLC-QE-MS 代謝產(chǎn)物定性分析，這些代謝產(chǎn)物同時(shí)滿足在3 條主要通路內(nèi)（前列腺素的γ 亞麻酸合成、白細(xì)胞三稀代謝及維生素E 代謝通路），且與PM2.5暴露相關(guān)（PFDR＜0.05）。在前列腺素通路中關(guān)鍵代謝分子包括前列腺素E1、前列腺素F2α、前列腺素G1及前列腺素H1等。PM2.5暴露主要與前列腺素通路中的物質(zhì)呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，僅與前列腺素H1呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。在白細(xì)胞三烯代謝通路中，代謝產(chǎn)物主要為白細(xì)胞三烯B4及其相關(guān)前體（如20-氧代-白細(xì)胞三烯B4 等）。作為機(jī)體氧化應(yīng)激的指標(biāo)，白細(xì)胞三烯及其代謝前體多與妊娠期PM2.5暴露呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。維生素E代謝通路中，與妊娠期PM2.5暴露有關(guān)的物質(zhì)主要包括生育三烯酚與生育酚的代謝前體物質(zhì)，這些參與機(jī)體抗氧化過程的物質(zhì)主要與妊娠期PM2.5暴露呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系。

通過GC-TOF-MS 方法定性的代謝物中，與妊娠期PM2.5暴露呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的物質(zhì)包括丙氨酸、L-葡萄糖辛酸、十八碳烯酸、環(huán)戊硅氧烷、甲醛、L-谷氨酸等，而與PM2.5暴露呈現(xiàn)正相關(guān)的物質(zhì)則主要包括膽固醇、哌啶酸、異吲哚、油酸、花生四烯酸等。其中，花生四烯酸作為前列腺素及白細(xì)胞三烯生物合成的一個(gè)重要前體物質(zhì)，與PM2.5暴露呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系（β=0.21，P＜0.001 且PFDR=0.018）。

將上述物質(zhì)進(jìn)行富集分析，得到如圖2所示的4條主要代謝通路，分別為天冬氨酸代謝、葡糖-丙氨酸循環(huán)、丙氨酸代謝及谷胱甘肽代謝通路。

圖2 GC-TOF-MS檢測中與PM2.5暴露有關(guān)的代謝通路富集情況Figure 2 Metabolic pathways related to PM2.5 exposure by GC-TOF-MS

3 討論

本研究在前期評(píng)估妊娠期婦女個(gè)體PM2.5暴露水平的工作基礎(chǔ)上，結(jié)合全代謝組關(guān)聯(lián)研究進(jìn)一步探討了妊娠期PM2.5累積暴露與血清代謝組的關(guān)聯(lián)。線性混合效應(yīng)模型和通路富集分析結(jié)果指示，妊娠期PM2.5暴露會(huì)干擾孕婦體內(nèi)一些生物學(xué)通路。其中，前列腺素的γ 亞麻酸合成、白細(xì)胞三烯代謝及維生素E 代謝通路在不同離子模式的UHPLC-QE-MS 代謝組學(xué)研究中均被發(fā)現(xiàn)與PM2.5暴露具有關(guān)聯(lián)；這些代謝通路的部分前體物質(zhì)在GC-TOF-MS 代謝組學(xué)研究中則進(jìn)一步被證明與PM2.5暴露正相關(guān)。

前列腺素與白細(xì)胞三烯同屬于類二十碳烷物質(zhì)，參與體內(nèi)多項(xiàng)生物穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)及炎癥反應(yīng)［24］。血漿前列腺素F2水平更被認(rèn)為是在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中反映氧化應(yīng)激水平的“金標(biāo)準(zhǔn)”［25］。對(duì)孕產(chǎn)婦健康而言，前列腺素在子宮肌層活動(dòng)中具有核心地位［26］，而前列腺素F2α及前列腺素E2水平與流產(chǎn)的發(fā)生具有正相關(guān)關(guān)系［27］。白細(xì)胞三烯這類物質(zhì)能促進(jìn)炎癥、變態(tài)反應(yīng)和趨化性。既往流行病學(xué)研究指出，PM2.5急、慢性暴露會(huì)導(dǎo)致一般人群血漿白細(xì)胞三烯B4 水平升高［17，28］。維生素E 在人體中主要以生育酚及生育三乙烯酚的形式存在，作為過氧化自由基清除劑，可拮抗由PM2.5或臭氧所介導(dǎo)的炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激［29］。對(duì)于孕婦而言，維生素E 水平降低是子癇前期的危險(xiǎn)因素之一［30］。其他通過UHPLC-QE-MS 方法定位的與妊娠期PM2.5暴露相關(guān)的代謝通路也佐證了PM2.5對(duì)脂肪酸代謝的影響，包括脂肪酸的從頭合成、激活、代謝及氧化等過程。在既往研究中，PM2.5對(duì)脂質(zhì)代謝的不良影響也已得到廣泛報(bào)道［31］。

使用GC-TOF-MS 代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)的花生四烯酸是白三烯及前列腺素的主要前體物質(zhì)，有效印證了PM2.5暴露與上述代謝通路之間的關(guān)聯(lián)，對(duì)UHPLC-QEMS 結(jié)果形成了良好的補(bǔ)充。此外，本研究發(fā)現(xiàn)PM2.5暴露可降低L-谷氨酸及丙氨酸的水平，并進(jìn)而影響谷胱甘肽代謝。谷胱甘肽是拮抗氧化應(yīng)激作用的重要物質(zhì)［32］，該代謝通路的紊亂可影響機(jī)體抵抗氧化應(yīng)激作用的能力。在孕產(chǎn)婦人群中，谷胱甘肽代謝失調(diào)是子癇前期的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素［33］。

本研究結(jié)果顯示，妊娠期PM2.5暴露可對(duì)孕婦體內(nèi)部分代謝通路造成干擾，而孕婦代謝紊亂造成的代謝性疾病會(huì)進(jìn)一步對(duì)兒童健康造成不良影響。妊娠期糖尿病可以增加死胎、巨大兒、新生兒低血糖等不良妊娠結(jié)局的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，且對(duì)子代的影響可持續(xù)至兒童時(shí)期甚至成年后，增加其肥胖發(fā)生率［34］。亞臨床的妊娠期甲減不僅會(huì)增加早產(chǎn)、低出生體重兒等不良結(jié)局風(fēng)險(xiǎn)，還會(huì)影響子代后續(xù)神經(jīng)發(fā)育［35］。

本研究應(yīng)用高通量的非靶向血清代謝組學(xué)方法探討了妊娠期PM2.5暴露與血清代謝組的關(guān)系，同時(shí)使用了UHPLC-QE-MS 和GC-TOF-MS 雙平臺(tái)進(jìn)行檢測，兩者結(jié)果互為補(bǔ)充，一定程度上揭示了妊娠期PM2.5暴露相關(guān)的生物學(xué)機(jī)制，與其他空氣污染相關(guān)研究的結(jié)果相似［11-13］。

本研究仍存在一些局限性。首先，本研究的樣本量較少，但研究結(jié)論與其他相關(guān)文章相似。其次，本研究只進(jìn)行了兩次血清代謝組學(xué)檢測，雖然彌補(bǔ)了結(jié)局時(shí)間節(jié)點(diǎn)單一的問題，也平衡了個(gè)體內(nèi)不同時(shí)間的代謝差異，但不能反映妊娠期血清代謝改變的中間過程。最后，盡管本研究綜合專業(yè)知識(shí)及既往相關(guān)研究，主要考慮了與孕婦血清代謝相關(guān)且與PM2.5暴露相關(guān)的協(xié)變量，包括孕婦的年齡、BMI、孕周、產(chǎn)次、孕期增重、職業(yè)及家庭年收入等協(xié)變量，但依舊可能存在飲食、被動(dòng)吸煙等混雜因素。

綜上，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)妊娠期PM2.5暴露會(huì)干擾孕婦一些生物學(xué)通路的表達(dá)，這些通路主要指向氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及脂肪酸代謝。