何 淵 楊娟娟 沈頌東

(蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院 蘇州 215000)

非生物脅迫嚴(yán)重影響了植物的生長(zhǎng)和發(fā)育, 面對(duì)不利的環(huán)境, 植物可以通過(guò)引發(fā)一系列的生理生化反應(yīng)去適應(yīng)這種不良影響(Huanget al, 2012)。MYB轉(zhuǎn)錄因子可以作為植物響應(yīng)非生物脅迫的重要調(diào)控因子,已被廣泛研究(Ambawatet al, 2013),MYB(V-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一, 存在于真核生物中, 廣泛參與植物細(xì)胞分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和次級(jí)代謝調(diào)控等多種生命活動(dòng), 特別在植物的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用(Mikamiet al, 2013)。根據(jù)MYB 蛋白含有的不同數(shù)量的結(jié)構(gòu)域,MYB基因可以分為1R、R2R3、3R、4R 這四種類型(杜靜靜等, 2019)。尤其是R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子, 該類轉(zhuǎn)錄因子含有2 個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域, 參與調(diào)節(jié)植物在面對(duì)環(huán)境脅迫時(shí)的初級(jí)和次級(jí)代謝活動(dòng)(Chenet al, 2019)。植物中最早發(fā)現(xiàn)MYB基因的是玉米體內(nèi)的C-MYB, 該基因參與玉米的花青素合成過(guò)程(Maroccoet al, 1989), 在后續(xù)的研究中又陸續(xù)在多種植物中發(fā)現(xiàn)了MYB基因, 在棉花中發(fā)現(xiàn)了219 個(gè)基因(Baldoniet al, 2015), 在水稻中鑒定出183個(gè)MYB基因(Chenet al, 2006),GmMYB010參與了大豆抗蟲(chóng)的過(guò)程(陸撿花等, 2017)。

在環(huán)境脅迫響應(yīng)方面, 對(duì)MYB基因也進(jìn)行了相應(yīng)的研究。比如在剛毛檉柳(Tamarix hispida)中對(duì)MYB基因家族在環(huán)境脅迫下的表達(dá)進(jìn)行了差異分析(Zhanget al, 2018),TaMYB參與了擬南芥(Arabidopsis thaliana)對(duì)干旱環(huán)境脅迫的響應(yīng)過(guò)程(Zhaoet al,2018), 植物中大部分的R2R3-MYB能夠響應(yīng)植物的鹽脅迫從而提高其耐鹽能力(張遵強(qiáng)等, 1998)。在諸多的環(huán)境因素中, 光照和鹽度是影響藻類生命活動(dòng)的重要環(huán)境因子(Heet al, 2017)。在光照方面, 高光照條件下會(huì)影響杜氏鹽藻和雨生紅球藻類胡蘿卜素合成途徑中關(guān)鍵基因的表達(dá)水平(Picket al, 2019), 光照強(qiáng)度同樣對(duì)滸苔的生長(zhǎng)狀態(tài)有關(guān)鍵的影響(Liet al, 2012); 在鹽度方面, 高鹽度的培養(yǎng)會(huì)促進(jìn)杜氏鹽藻類胡蘿卜素的合成(Shanget al, 2018), 鹽度同樣會(huì)影響滸苔的氮元素富集從而影響其增殖(Zhenget al, 2019)。

滸苔(Ulva prolifera)是一種常見(jiàn)的大型海洋綠藻,具有單層細(xì)胞圍繞成的管狀結(jié)構(gòu), 廣泛分布于低潮區(qū)的灘涂、礁石和底泥之中(Fanet al, 2014)。滸苔具有細(xì)絲狀易于漂浮的外觀, 多樣的繁殖方式以及能夠抵御多種環(huán)境因子脅迫等生物學(xué)特征可以幫助滸苔承受多種環(huán)境壓力, 例如高鹽、干旱和強(qiáng)光照條件,且可以在較廣的溫度范圍內(nèi)存活, 是一種生命力很強(qiáng)的海藻(Xiaoet al, 2016)。從2007 年起, 我國(guó)的黃海海域每年都會(huì)暴發(fā)以滸苔為主的“綠潮”災(zāi)害, 據(jù)統(tǒng)計(jì)每年“綠潮”災(zāi)害所引發(fā)的生物量達(dá)到了數(shù)百萬(wàn)噸(Liuet al, 2015), 給沿海地區(qū)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失和嚴(yán)重社會(huì)影響(Zhanget al, 2017; 王宗靈等, 2018;Zhaoet al, 2019a)。相對(duì)于MYB家族在高等植物中的生長(zhǎng)發(fā)育、生理代謝、生物脅迫與非生物脅迫功能研究的大量研究成果, 人們對(duì)MYB家族轉(zhuǎn)錄因子在滸苔中的結(jié)構(gòu)和功能研究較少。滸苔能夠引發(fā)“綠潮”災(zāi)害和滸苔具有抵御夏季海面的極端環(huán)境的能力密切相關(guān), 研究表明MYB家族的轉(zhuǎn)錄因子具有應(yīng)答外界環(huán)境脅迫的能力(Duboset al, 2010), 因此我們推測(cè)MYB類轉(zhuǎn)錄因子在滸苔夏季抵御海面嚴(yán)酷的環(huán)境脅迫大量增殖的過(guò)程中起到了一定的作用。

本研究依據(jù)前期已經(jīng)完成的滸苔光照和鹽度脅迫下的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果, 篩選出具有表達(dá)水平顯著變化的MYB類基因MYB44, 將其命名為UpMYB44,進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行序列擴(kuò)增、生物信息學(xué)分析、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析等實(shí)驗(yàn)初步探究了該基因的表達(dá)模式和分子功能, 證明其在非生物脅迫例如鹽度和光照的響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用, 為今后深入研究UpMYB44 基因的功能奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

于2020 年7 月在山東省青島市市南區(qū)棧橋潮間帶(37.46°N, 121.71°E)采集滸苔配子體樣品, 放入容器中帶回蘇州大學(xué)藻類實(shí)驗(yàn)室。用無(wú)菌水清洗藻體,除去表面的泥沙和其他雜物, 放置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為f/2 培養(yǎng)基, 溫度為20 °C, 光照強(qiáng)度為 90 μmol photons/(m2·s), 鹽度為 24, 光周期為:L:D=12 h : 12 h。每3 d 換一次過(guò)濾海水, 預(yù)培養(yǎng)7 d。

1.2 光照和鹽度脅迫處理

用三種不同光照培養(yǎng)滸苔 5 d, 18 μmol photons/(m2·s) 設(shè) 置 為 低 光 照 組(l), 90 μmol photons/(m2·s) 設(shè) 置 為 中 光 照 組(m), 216 μmol photons/(m2·s)設(shè)置為高光照組(h); 用三種不同鹽度海水培養(yǎng)滸苔5 d, 低鹽度組(L)設(shè)置為12, 中鹽度組(M)設(shè)置為24, 高鹽度組(H)設(shè)置為40, 培養(yǎng)密度為20 g/L, 溫度為20 °C, 光周期為: L:D=12 h : 12 h, 1 d換一次過(guò)濾海水, 以上處理的每種樣品均設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3 RNA 提取和cDNA 合成

參照(Heet al, 2018)的方法使用Takara 的總RNA提取試劑盒對(duì)三種不同光照和鹽度處理的滸苔進(jìn)行總RNA 的提取, 同時(shí)通過(guò)Thermo Fisher NanoDrop 2000 和瓊脂糖凝膠電泳對(duì)所提取的RNA 的濃度和純度進(jìn)行檢測(cè), 使用Takara Reverse Transcription kit 將2 μg 檢測(cè)合格的RNA 合成為cDNA 第1 鏈。

1.4 UpMYB44 基因的cDNA 全長(zhǎng)克隆

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室獲得的滸苔光照和鹽度脅迫下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(GenBank: SRX4552126, SRX5502767)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物UpMYB44F/R,UpMYB44F: ATGAC TTCCGAGGGGATGGAG,UpMYB44R: GACGAGCT GCTCGCGGTTAAA。以之前獲得的cDNA 為模板,使用 2×HieffTMPCR Master Mix (Yeasen) 擴(kuò)增UpMYB44的ORF 全長(zhǎng)序列, 50 μL PCR 反應(yīng)體系如下:2×HieffTMPCR Master Mix 25 μL, 上游引物和下游引物(10 μmol/L)各2 μL, cDNA 模板2 μL, 加19 μL 的ddH2O 補(bǔ)至50 μL。PCR 反應(yīng)程序如下: 94 °C 預(yù)變性5 min, 94 °C 變性30 s, 55 °C 退火30 s, 72 °C 延伸1 min, 30 個(gè)循環(huán), 72 °C 延伸10 min。取上述PCR 產(chǎn)物 10 μL 進(jìn)行 1%瓊脂糖凝膠電泳, 使用 Gel Extraction Kit (康為世紀(jì))切取符合目的基因片段大小的條帶進(jìn)行回收。使用 Hieff Clone?Zero TOPOBlunt Cloning Kit (Yeasen)進(jìn)行目的片段平末端擴(kuò)增,將構(gòu)建好的質(zhì)粒接種于LB 固體培養(yǎng)基上過(guò)夜培養(yǎng),第二天挑取陽(yáng)性克隆測(cè)序, 獲得UpMYB44基因ORF區(qū)全長(zhǎng)序列。

1.5 UpMYB44 生物信息學(xué)分析

使用DNAMAN 軟件對(duì)UpMYB44 進(jìn)行氨基酸保守序列分析; 利用 Expays (https://web.Expasy.Org/protparam/)在線軟件分析編碼蛋白的大小、氨基酸數(shù)量和等電點(diǎn); 使用 NCBI 的 CDD 數(shù)據(jù)庫(kù)

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)

對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè); 利用 ProtScale 工具(http://web.Expasy.org/protscale/)對(duì) UpMYB44 蛋白進(jìn)行親水性/疏水性分析; 采用 ExPaSy-SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)在線軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu);利用 SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/interactive) 對(duì)UpMYB44 蛋白3D 結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.6 表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

參照Al-Muhanna 等(2018)的方法采用T4 連接酶將UpMYB44 目的片段與pET-32a 載體(反應(yīng)體系包含0.1 pmol 目的片段, 0.03 pmol 載體片段, 3 U T4 DNA 連接酶, 1×T4 DNA 連接酶緩沖液)在16 °C 反應(yīng) 12 h。采用熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌Trans-T1 感受態(tài)細(xì)胞。用雙酶切進(jìn)行(Nde I, Xba I)鑒定, 將陽(yáng)性質(zhì)粒送去蘇州金唯智公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.7 UpMYB44 的蛋白表達(dá)

參照 B a n e y x(1 9 9 9)的方法將 p E T-3 2 a+UpMYB44(+)1 μL 加入100 μL BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)菌中, 置冰上20 min, 37 °C, 220 r/min 振搖1 h, 離心后全部涂布于含50 μg/mL Amp 的LB 平板, 37 °C 倒置培養(yǎng)過(guò)夜。挑取轉(zhuǎn)化平板上的單克隆接種在含50 μg/mL Amp 的3 mL LB 液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)管中,在220 r/min, 37 °C, 4 h 搖床里進(jìn)行培養(yǎng), 當(dāng)分光光度計(jì)測(cè)量值顯示其OD600(600 nm處的吸光值)≈ 0.6—0.8時(shí), 滴入濃度為1.0 mmol/L IPTG, 37 °C 220 r/min 經(jīng)過(guò)振搖4 h 誘導(dǎo)蛋白表達(dá)后取2 mL, 然后14 000 r/min離心, 棄去上清液, 采用PBS 來(lái)重懸沉淀, 加2×十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate loading buffer,SDS)上樣緩沖液混合均勻之后, 沸水煮沸10 min。然后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDSPAGE)超聲破碎后收集上清, 用0.45 μm 濾膜過(guò)濾,用3 倍體積的平衡液[ 25 mmol /L Tris( pH 值 8.0),300 mmol/L NaCl, 10 mmol/L 咪唑] 平衡 His 純化基質(zhì), 將過(guò)濾后的上清與His 純化基質(zhì)于50 mL 離心管中4 °C 混勻1 h。用洗滌緩沖液[25 mmol /L Tris ( pH值 8.0), 300 mmol/L NaCl, 30 mmol/L 咪唑] 沖洗4 次,用洗脫緩沖液[25 mmol/L Tris ( pH 值 8.0),300 mmol/L NaCl, 250 mmol/L 咪唑]洗脫3 次, SDSPAGE 電泳檢測(cè)融合蛋白純化效果。

1.8 UpMYB44 亞細(xì)胞定位

參照Xiong 等(2019)的方法設(shè)計(jì)亞細(xì)胞定位引物YFP-UpMYB44F/R, YFP-UpMYB44F: AAGAGA CAGGATCCGAATTCATGACTTCCGAGGGGATGGA G, YFP-UpMYB44R: ACCTCCGACCGGTGCACTA GTGACGAGCTGCTCGCGGTTAAA。將酶切位點(diǎn)BamH I 和Sac I 加入目的基因ORF 兩端, 將測(cè)序成功的陽(yáng)性質(zhì)粒T-blunt-UpMYB44 為模板進(jìn)行擴(kuò)增和切膠回收。使用BamH I 和Sac I 對(duì)質(zhì)粒pC131-YFP 進(jìn)行雙酶切, 產(chǎn)物純化。將目的基因片段和載體pC131-YFP 進(jìn)行連接轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞,獲得重組質(zhì)粒 pC131-UpMYB44-YFP。將空載質(zhì)粒pC131-YFP 和重組質(zhì)粒pC131-UpMYB44-YFP 分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101 菌株中, 將陽(yáng)性克隆放入含有50 μg/mL 卡那霉素和35 μg/mL 利福平的LB 培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng), 放置于28 °C 搖床中以250 r/min 速度培養(yǎng)過(guò)夜, 收集并重懸菌體, 當(dāng)菌體濃度的OD600值在0.5—1.0 之間, 靜置3 h 后注射入煙草葉片中, 注射后的煙草放置于28 °C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。用激光共聚焦顯微鏡觀察侵染的煙草葉片, 進(jìn)行UpMYB44蛋白亞細(xì)胞觀察。

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

參照He 等(2019)的方法設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR并以不同光照和鹽度處理的滸苔cDNA 為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn), 熒光定量PCR 采用 Hieff?qRT-PCR SYBR Green Master Mix (Yeasen)試劑, 使用ASA-4800 Real-Time PCR 儀器(百源基因)進(jìn)行反應(yīng), 以18S rDNA為內(nèi)參基因, 具體引物序列如表1所示, 上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。結(jié)果分析采用 2-ΔΔCT法進(jìn)行相對(duì)定量, 采用軟件Origin 8.0 對(duì)表達(dá)結(jié)果進(jìn)行單因素方差統(tǒng)計(jì)(ANOVA)。數(shù)據(jù)使用 SPSS 21.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,P< 0.05 設(shè)定為顯著性差異,P< 0.01 設(shè)定為極顯著性差異。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 所用引物Tab.1 Primers used for quantitative real-time PCR

1.10 UpMYB44 和UpCPP5 互作驗(yàn)證

參照Cai 等(2016)的方法制備Y2H Gold 酵母感受態(tài)細(xì)胞, 將UpCPP5 作為誘餌構(gòu)建PGBKT7-CPP5重組質(zhì)粒進(jìn)行毒性檢測(cè)和自激活檢測(cè): 于100 °C 沸水煮carrier DNA 5 min, 立即置于冰上2 min, 如此重復(fù)一次, 取1.5 mL 無(wú)菌EP 管, 配制轉(zhuǎn)化體系, 50 μL感受態(tài)細(xì)胞+5 μL carrier DNA+100 ηg 誘餌質(zhì)粒+100 ηg 獵物空載, 加入500 μL PEG/LiAc (8 mL 50%PEG+1 mL LiAc+1 mL TE), 30 °C 水浴30 min, 加入20 μL DMSO, 42 °C 水浴15 min, 800 ×g離心1 min,去上清, 加入800 μL YPDA 重懸, 30 °C, 150 r/min,振蕩培養(yǎng)1.5 h, 800 ×g離心5 min, 棄上清, 加入1 mL 0.9% NaCl 重懸, 取150 μL 涂平板, 30 °C 倒置培養(yǎng) 4 d, 觀察菌落直徑及顏色; 構(gòu)建 PGADT7-MYB44 重組質(zhì)粒作為獵物進(jìn)行誘餌和獵物的共轉(zhuǎn)化,依次從自激活、共轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)組和共轉(zhuǎn)化陰陽(yáng)性對(duì)照組涂布的平板 DDO 上挑單菌落, 分別接種于 5 mL DDO 液體培養(yǎng)基, 30 °C 250 r/min 培養(yǎng)16 h, 取300 μL 菌液于50 mL DDO 中, 30 °C 250 r/min 培養(yǎng)8—12 h 至OD600值為0.4—0.6; 各取10 μL 菌液點(diǎn)種到平板DDO、TDO/3AT (15 mmol/L)、QDO 上, 30 °C培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d, 觀察菌斑生長(zhǎng)情況, 若涂布在平板DDO 上長(zhǎng)菌則共轉(zhuǎn)化成功, 在平板 TDO/3AT(15 mmol/L)上長(zhǎng)菌而在QDO 上不長(zhǎng)菌為陽(yáng)性結(jié)果,在平板TDO/3AT (15mmol/L)上不長(zhǎng)菌為陰性結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 UpMYB44 ORF 區(qū)全長(zhǎng)序列的克隆與序列分析

利用RT-PCR 以滸苔cDNA 為模板, PCR 擴(kuò)增相應(yīng)片段, 測(cè)序得到UpMYB44的ORF 區(qū)全長(zhǎng)序列, 序列全長(zhǎng)為1 437 bp, 共編碼478 個(gè)氨基酸。序列上傳至Genbank 數(shù)據(jù)庫(kù), 登錄號(hào)為MW174238。

2.2 UpMYB44 生物信息學(xué)分析結(jié)果

通過(guò) NCBI 與其他物種的 MYB 蛋白進(jìn)行BLASTn 比對(duì), 結(jié)果顯示UpMYB44 蛋白與另一種綠藻小球藻的MYB44 蛋白有較高的同源性, 氨基酸的一致性為50.00%, 與高等植物番木瓜、荷花、木槿、牽?；?、柿樹(shù)和向日葵的氨基酸相似率也在45.00%—50.00%之間, 用DNAMAN 將UpMYB44 氨基酸序列與上述物種進(jìn)行比對(duì), 發(fā)現(xiàn)了較為保守的序列區(qū)域(圖1), 推測(cè)與這些MYB 類轉(zhuǎn)錄因子有相似的生物學(xué)功能。利用Expays 在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果顯示UpMYB44 蛋白含有 478 個(gè)氨基酸, 分子量為52.49 kDa, 等電點(diǎn)為6.15; 利用CDD 數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示 UpMYB44 含有兩個(gè) SANT 結(jié)構(gòu)域, 是典型的R2R3-MYB(圖2); 利用ProtScale 工具對(duì)UpMYB44蛋白進(jìn)行親水性/疏水性分析, 結(jié)果顯示UpMYB44為親水性蛋白; 在SOPMA 在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu), UpMYB44 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中含有42.68%的α-螺旋結(jié)構(gòu)、8.16%的延伸連結(jié)構(gòu)、9.62%的β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)、39.54%的無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)(圖3)。利用Swiss-model網(wǎng)站對(duì)UpMYB44 蛋白進(jìn)行3D 結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè), 發(fā)現(xiàn)與其蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果類似, 具有較多的α-螺旋結(jié)構(gòu)和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)(圖4)。

圖1 UpMYB44 與其他物種MYB 類轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列的多重比對(duì)Fig.1 Multiple alignment of the amino acid sequence of UpMYB44 and MYB transcription factors from other species

圖2 UpMYB44 蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.2 Prediction of conservative domain of UpMYB44 protein

圖3 UpMYB44 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction of secondary structure of UpMYB44

圖4 UpMYB44 蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型Fig.4 Predicted 3D structure model of UpMYB44 protein

2.3 pET-32a+UpMYB44 融合蛋白的可溶性分析和純化

結(jié)果表明, UpMYB44 融合蛋白主要以可溶性蛋白的形式存在于上清中, 但是在包涵體沉淀中也有一定量的表達(dá)(圖5)。選擇上清中可溶性蛋白進(jìn)行后續(xù)蛋白純化實(shí)驗(yàn), 通過(guò)4 次洗滌和3 次洗脫, 獲得了大小約為65 kD (含標(biāo)簽)的純度較好的UpMYB44 融合蛋白(圖6)。

圖5 UpMYB44 蛋白表達(dá)鑒定SDS-PAGE 分析Fig.5 Identification of UpMYB44 protein expression by SDS-PAGE analysis

圖6 UpMYB44 蛋白純化SDS-PAGE 分析Fig.6 Purification of UpMYB44 protein by SDS-PAGE analysis

2.4 UpMYB44 蛋白的定位

在對(duì)照組空載pC131-YFP 中, 黃色熒光在細(xì)胞膜、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都有分布, 而融合表達(dá)載體pC131-UpMYB44-YFP 的細(xì)胞中, 黃色熒光僅在細(xì)胞核中被發(fā)現(xiàn), 而在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中都沒(méi)有熒光發(fā)現(xiàn), 并且黃色熒光和核定位的marker 蛋白的紅色熒光發(fā)生重合。結(jié)果顯示UpMYB44 蛋白僅定位在細(xì)胞核上, 這一點(diǎn)符合MYB 類轉(zhuǎn)錄因子的特點(diǎn)(圖7)。

圖7 UpMYB44 蛋白的亞細(xì)胞定位Fig.7 Subcellular localization of the UpMYB44 protein

2.5 UpMYB44 在不同光照和鹽度處理下的表達(dá)模式分析

UpMYB44在三種不同光照和鹽度處理下的表達(dá)量發(fā)生了顯著變化, 在光照組中, 18 μmol photons/(m2·s)處理的低光組中UpMYB44的表達(dá)量最高, 隨著光照強(qiáng)度的增加,UpMYB44的表達(dá)量逐漸降低( 圖 8),UpMYB44的 表 達(dá) 量 在 216 μmol photons/(m2·s)處理的高光組中最低; 在鹽度組中, 隨著鹽度的增加,UpMYB44的表達(dá)量逐漸升高,UpMYB44的表達(dá)量在鹽度40 處理的高鹽組中最高,在鹽度12 處理的低鹽組中最低(圖9)。

圖8 UpMYB44 在三種光照強(qiáng)度條件下的表達(dá)分析Fig.8 Expression analysis of UpMYB44 under three lights stresses

圖9 UpMYB44 在三種鹽度強(qiáng)度條件下的表達(dá)分析Fig.9 Expression analysis of UpMYB44 under three salinities stresses

2.6 UpMYB44 和UpCPP5 蛋白存在互作關(guān)系

MYB 類轉(zhuǎn)錄因子通常需要與其他蛋白互作進(jìn)行發(fā)揮其功能。利用STRING 在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)UpMYB44的互作蛋白, 根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)UpMYB44 和另一種調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和響應(yīng)非生物脅迫中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子UpCPP 存在互作關(guān)系,以缺失蛋白UpCPP5 為誘餌, 通過(guò)酵母雙雜交點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證, 結(jié)果表明重組誘餌質(zhì)粒PGBKT7-CPP5 對(duì)酵母細(xì)胞無(wú)毒性且3-氨基-1,2,4 三唑(3AT, 15mmol/L)能抑制激活Y2H Gold 酵母報(bào)告基因, 酵母雙雜交的結(jié)果顯示, 將獵物質(zhì)粒 PGADT7-MYB44 與誘餌質(zhì)粒PGBKT7-CPP5 共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞: 對(duì)照結(jié)果符合預(yù)期,說(shuō)明該系統(tǒng)可用于雙雜交驗(yàn)證; 實(shí)驗(yàn)組涂布DDO 平板能生長(zhǎng)說(shuō)明誘餌和獵物共轉(zhuǎn)化成功, 涂布TDO/3AT (15mmol/L)板能生長(zhǎng), QDO 平板不長(zhǎng), 說(shuō)明激活報(bào)告基因HIS3 的表達(dá), 說(shuō)明UpMYB44 蛋白和UpCPP5 蛋白之間存在相互作用(圖10)。

圖10 UpMYB44 與UpCPP5 互作蛋白驗(yàn)證Fig.10 Verification of UpMYB44 interacting with UpCPP5

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)在植物中MYB類轉(zhuǎn)錄因子參與了多種生物和非生物脅迫的響應(yīng)過(guò)程(Leaet al, 2007)。超表達(dá)玉米中的ZmMYB3R可以增加其對(duì)干旱和鹽度的耐受性(Yinet al, 2017), 過(guò)量表達(dá)煙草的NtMYB15可以促進(jìn)其適應(yīng)低溫脅迫(Wuet al, 2019), 在模式生物擬南芥中超表達(dá)AtMYB74同樣具有增強(qiáng)其鹽耐受性的功能(Xuet al, 2015), 而且MYB 類轉(zhuǎn)錄因子常常需要與其他蛋白互作來(lái)發(fā)揮功能(Kasparet al, 1999)。

本研究以受關(guān)注度較高的引發(fā)“綠潮”災(zāi)害的滸苔為研究對(duì)象, 初步分析了MYB類家族成員UpMYB44的生物學(xué)功能。結(jié)果表明UpMYB44有兩個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域, 屬于典型的R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子, 研究表明該類轉(zhuǎn)錄因子參與了棉花和月季對(duì)高鹽脅迫的響應(yīng)(Zhaoet al, 2019b, 包穎等, 2020)。鹽度和光照是影響藻類正常生長(zhǎng)和生理生化指標(biāo)的重要的兩個(gè)環(huán)境因子(Araiet al, 1991), 特別是對(duì)滸苔而言, 鹽度和光照的改變會(huì)引起其氧化應(yīng)激反應(yīng)(Luoet al,2011), 以及影響其體內(nèi)的總類胡蘿卜素含量(Heet al,2020)。在本研究中,UpMYB44在高鹽條件下的表達(dá)量發(fā)生了顯著提高, 說(shuō)明該轉(zhuǎn)錄因子參與了滸苔的對(duì)高鹽脅迫的響應(yīng)過(guò)程, 可能對(duì)提高滸苔適應(yīng)惡劣的外界環(huán)境的能力有一定幫助, 最終有利于其快速增殖。R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子也會(huì)對(duì)光照的改變作出響應(yīng), 在早期的研究中發(fā)現(xiàn)紅色紫蘇中存在一種光誘導(dǎo)的Myb-p1基因, 其在花青素的形成過(guò)程中起到了決定性作用(Gonget al, 1999), 在馬鈴薯中發(fā)現(xiàn)的StR2R3-MYB1就是一種光響應(yīng)MYB類轉(zhuǎn)錄因子, 基于對(duì)光處理后基因表達(dá)特性分析的結(jié)果表明該轉(zhuǎn)錄因子可能受到光信號(hào)和環(huán)境脅迫的誘導(dǎo)(秦玉芝等,2015)。在滸苔中UpMYB44的表達(dá)量同樣受到了不同光照強(qiáng)度的影響, 且隨著光照的逐漸增強(qiáng)其表達(dá)量呈下降趨勢(shì), 這和一般應(yīng)激反應(yīng)的表現(xiàn)有差異, 推測(cè)夏季滸苔在漂浮狀態(tài)下的高光照強(qiáng)度脅迫會(huì)影響其正常的生長(zhǎng)狀態(tài), 導(dǎo)致部分基因的表達(dá)出現(xiàn)下調(diào), 說(shuō)明過(guò)高的光強(qiáng)對(duì)其增殖反而不利。UpMYB44基因在滸苔受到光照和鹽度脅迫時(shí)會(huì)發(fā)生響應(yīng), 對(duì)夏季抵御海面嚴(yán)酷的環(huán)境脅迫起到一定作用。對(duì)MYB類轉(zhuǎn)錄因子互作模式的研究也已經(jīng)開(kāi)展, 比如在蘋果中MdMYB23 蛋白通過(guò)結(jié)合MdBT2 蛋白來(lái)抑制原花色素的積累(Anet al, 2018), 通過(guò)鑒定與AtMAPK3P 相互作用的MYB 轉(zhuǎn)錄因子成員, 增強(qiáng)了我們對(duì)擬南芥中MAPK 相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí), 也證實(shí)了蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用對(duì)于生物過(guò)程至關(guān)重要(Giriet al, 2014)。

在本研究中, 通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)證明了UpMYB44 蛋白和一種CPP 蛋白具有互作, 通過(guò)和Genbank 中的序列進(jìn)行比對(duì), 我們將其命名為UpCPP5。CPP 蛋白又稱為tesmin/TSO1-like 蛋白, 在植物中廣泛分布, 該家族在植物生長(zhǎng)發(fā)育和細(xì)胞分裂控制中起重要作用(Yanget al, 2008), TSO1 參與了擬南芥花發(fā)育的細(xì)胞分裂過(guò)程(Liuet al, 1997), 如果該基因輕度的突變會(huì)影響擬南芥胚珠發(fā)育, 而強(qiáng)突變對(duì)所有花卉組織都有影響(Andersenet al, 2007),因此, 猜測(cè)這兩類轉(zhuǎn)錄因子的相互作用影響了滸苔的細(xì)胞分裂過(guò)程, 這個(gè)研究方向正好和目前滸苔如何引發(fā)“綠潮”災(zāi)害的研究熱點(diǎn)相互關(guān)聯(lián)。本實(shí)驗(yàn)的研究材料滸苔是一種能夠快速生長(zhǎng)的災(zāi)害綠藻, 只要外界條件合適, 其生長(zhǎng)速率相當(dāng)驚人(Hiraokaet al,2008), 每年夏季由于其暴發(fā)性生長(zhǎng)對(duì)我國(guó)沿海城市造成了巨大的環(huán)境污染(Yuet al, 2017; Heet al, 2019),對(duì)近海的生態(tài)系統(tǒng)也造成了嚴(yán)重的破壞(Quet al,2020)。根據(jù)之前滸苔基因組的研究, 我們推測(cè)滸苔的快速生長(zhǎng)和細(xì)胞的快速分裂密切相關(guān), 但是滸苔增殖最終重要的是營(yíng)養(yǎng)增殖, 因此后續(xù)可以通過(guò)深入研究滸苔中MYB 家族和CPP 家族的互作是否會(huì)影響滸苔的生長(zhǎng)發(fā)育和細(xì)胞分裂, 并結(jié)合滸苔營(yíng)養(yǎng)增殖方面的研究為進(jìn)一步了解環(huán)境脅迫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供依據(jù), 更重要的是為研究滸苔的快速繁殖機(jī)制提供了全新的思路。

4 結(jié)論

本研究在本實(shí)驗(yàn)室已有的研究基礎(chǔ)上, 克隆了1個(gè)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子基因——UpMYB44的ORF 區(qū)全長(zhǎng)序列, 其氨基酸序列與GenBank 中已有的小球藻MYB 蛋白具有相似性, 我們對(duì)其進(jìn)行了生物學(xué)功能驗(yàn)證, 在異于滸苔最適環(huán)境的光照和鹽度的培養(yǎng)條件下,UpMYB44的表達(dá)量會(huì)發(fā)生顯著變化, 證明其參與了滸苔響應(yīng)光照和鹽度壓力的過(guò)程, 可能在鹽度和光照壓力應(yīng)答中具有關(guān)鍵作用。實(shí)驗(yàn)證明UpMYB44 與CPP 類轉(zhuǎn)錄因子UpCPP5 存在較強(qiáng)的互作, 推測(cè)二者的結(jié)合可能參與了滸苔的生長(zhǎng)發(fā)育和細(xì)胞分裂過(guò)程, 但其具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。