劉姍姍 俞志明① 宋秀賢 曹西華 袁涌銓

(1. 中國科學(xué)院海洋研究所 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266071; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266237; 3. 中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049; 4. 中國科學(xué)院海洋大科學(xué)研究

中心 青島 266071)

隨著人類活動(dòng)對(duì)近海環(huán)境影響的增加, 有害藻華呈全球擴(kuò)展態(tài)勢, 表現(xiàn)出暴發(fā)頻率上升、持續(xù)時(shí)間增長、暴發(fā)規(guī)模擴(kuò)大、致災(zāi)效應(yīng)加重的趨勢(俞志明等, 2019), 嚴(yán)重危害近海生態(tài)環(huán)境和水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè),亟需有效的治理方法。根據(jù)控制原理的不同, 有害藻華的主要治理方法可分為物理法、化學(xué)法、天然礦物絮凝法和生物調(diào)控法等(Yuet al, 2017)。物理法是指通過打撈、引水換水、底泥疏浚、超聲波等手段直接將藻華生物從水體中去除的方法, 存在著成本高、難以大范圍應(yīng)用的問題(Kim, 2006); 化學(xué)法是指利用化學(xué)試劑直接殺滅有害藻華生物, 該方法操作簡單,見效快, 但容易引發(fā)水體的二次污染(Maet al, 2002;Sunet al, 2004); 天然礦物絮凝法則是利用天然礦物無毒、無害、能夠絮凝藻華生物的特點(diǎn), 應(yīng)用于有害藻華的治理, 但是存在治理效率低、用量大的缺點(diǎn)。如何快速消除藻華生物而又不帶來環(huán)境污染問題一直是困擾有害藻華治理領(lǐng)域的技術(shù)難題。

針對(duì)天然礦物絮凝法治理效率低、用量大的技術(shù)難題, 我國科學(xué)家提出了改性粘土治理赤潮的技術(shù):在粘土表面和層間引入帶正電荷和適當(dāng)鏈長的改性劑, 使粘土表面電性翻轉(zhuǎn)、作用半徑加大, 增加了粘土顆粒與藻細(xì)胞之間的橋聯(lián)作用, 提升了絮凝效率,大大降低了粘土用量(俞志明等, 1994)。改性粘土方法除藻效率高、對(duì)非藻華生物安全可靠, 已成為我國近海有害藻華應(yīng)急處置的標(biāo)準(zhǔn)方法, 也是唯一在我國近海得到大規(guī)模應(yīng)用、并走出國門的技術(shù)與方法。

除了這些方法之外, 利用生物間的營養(yǎng)鹽競爭、捕食關(guān)系、藻菌相互作用(鄭天凌等, 2002)等生態(tài)學(xué)原理抑制藻華, 也是很多科學(xué)家不斷探索的藻華治理方法(Mayaliet al, 2004; Sunet al, 2018), 稱之為生物法。這類方法不但可以特異性去除藻華生物(Mankiewicz-Boczeket al, 2016), 且具備生態(tài)調(diào)控的優(yōu)勢, 可以有效降低水體中的銨鹽、亞硝酸鹽水平,調(diào)節(jié)微生物群落結(jié)構(gòu), 提高養(yǎng)殖生物的品質(zhì)(Changet al, 2019; Xuet al, 2019)。但生物法存在著作用時(shí)間長、特異性弱、應(yīng)急處置效果差等問題, 相關(guān)研究大都停留在實(shí)驗(yàn)室階段, 鮮見實(shí)際應(yīng)用的報(bào)道(Palet al, 2020)。

由此可見, 在上述有害藻華治理方法中, 改性粘土方法展現(xiàn)出見效快、用量少、安全可靠的特點(diǎn); 生物方法應(yīng)急性差, 但是在后期會(huì)展現(xiàn)出其生態(tài)調(diào)控的優(yōu)勢。兩種方法各具特色, 如果能夠?qū)⒍呓Y(jié)合在一起, 是否可以形成一種既能應(yīng)急處置有害藻華、又可修復(fù)水體和生態(tài)系統(tǒng)的新型藻華治理方法呢？為此, 本文選取了幾種目前水產(chǎn)養(yǎng)殖與水體修復(fù)常用的微生物, 將改性粘土與之結(jié)合, 研究了微生物復(fù)合改性粘土對(duì)典型有害藻華生物——東海原甲藻的去除效率, 考察了不同配比、熟化時(shí)間與溫度等因素對(duì)去除效率的影響, 并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行探究, 為改性粘土治理有害藻華進(jìn)行了新的探索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所用高嶺土理化性質(zhì)參照文獻(xiàn)報(bào)道(Liuet al, 2016), 對(duì)其進(jìn)行改性處理, 制備I 型改性粘土,簡寫為MC I (modified clay I)。

實(shí)驗(yàn)采用的東海原甲藻來自中科院海洋所海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。所用培養(yǎng)基為L1, 培養(yǎng)溫度為(20±1) °C, 光照強(qiáng)度為65 μmol photons/(m2·s),光暗比L:D=12 h:12 h。所用海水取自青島匯泉灣近海, 采用0.45 μm 混合纖維膜過濾, 高溫蒸汽滅菌后使用。

本研究所用的EM 菌(effective microorganisms,有效性微生物)與糞鏈球菌(Streptococcus faecalis)、乳酸菌(Lactobacillussp.)均產(chǎn)自武漢天辰集團(tuán), 經(jīng)流式細(xì)胞儀(BD FACS Calibur, 美國)進(jìn)行細(xì)菌密度測定,EM 菌與乳酸菌均為液態(tài), 其中活菌含量均為 1010cells/mL; 經(jīng)16S rDNA 高通量測序, EM 菌主要成分為芽孢桿菌(Bacillussp., 61%)、乳酸菌(11%)、弧菌(Vibriosp., 10%)和醋酸菌(Acetobactersp., 6%)。糞鏈球菌為固態(tài), 其中活菌含量為5×108cells/g。光合細(xì)菌(固態(tài))產(chǎn)自天創(chuàng)水產(chǎn)藥品公司, 由四種光合細(xì)菌(沼澤紅假單胞菌、膠質(zhì)紅假單胞菌、球形紅假單胞菌、綠色紅假單胞菌)混合而成, 其中活菌含量為2×109cells/g; 芽孢桿菌(固態(tài))產(chǎn)自落星生物公司, 其中活菌含量為3×108cells/g。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 微生物復(fù)合改性粘土的制備與熟化 稱取一定質(zhì)量的MC I 于50 mL 錐形瓶中, 121 °C 高溫蒸汽滅菌30 min 后于80 °C 烘箱中烘干1 h, 置于紫外燈下滅菌20 min, 冷卻至室溫。向滅菌處理后的MC I中按比例加入微生物(固態(tài)微生物的菌懸液或液態(tài)微生物)與滅菌海水, 搖勻置于恒溫震蕩培養(yǎng)箱(30 °C、150 r/min)中震蕩2 h, 使改性粘土與微生物充分接觸、吸附, 形成微生物復(fù)合改性粘土(modified clay V,MC V)。

取5mL EM 菌液與MC I 按上述方法配置為微生物復(fù)合改性粘土, 將其置于不同溫度(4、20、60 °C)下, 熟化不同的時(shí)間(24、48、72、96 h), 制備不同熟化條件下的微生物復(fù)合改性粘土體系。

1.2.2 微生物復(fù)合改性對(duì)去除率影響的研究

(1) 去除實(shí)驗(yàn)及去除率計(jì)算方法

取50 mL 處于指數(shù)生長期中后期的東海原甲藻藻液(密度為1×108cells/L)置于比色管中, 加入微生物復(fù)合改性粘土懸浮液, 上下顛倒混勻后, 于培養(yǎng)條件下靜置24 h, 取上部(距離液面5 cm 處)藻液, 用魯哥試劑固定后, 在顯微鏡(Olympus IX71, 日本)下計(jì)數(shù)。每組設(shè)置三個(gè)平行。去除率計(jì)算公式為:

(2) EM 菌及其濾液與改性粘土復(fù)合前后去除率的變化

將EM 菌培養(yǎng)液經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾得到無菌濾液, 將其按照1.2.1 所述的方法分別與改性粘土復(fù)合。取50 mL 處于指數(shù)生長期中后期的東海原甲藻藻液置于比色管中, 分別加入液體EM 菌、EM 菌濾液, 設(shè)置體積分?jǐn)?shù)梯度為0.1、0.2、0.5、1、1.5、2×1010cells/L,每組設(shè)三個(gè)平行。計(jì)算其對(duì)東海原甲藻的去除率。

1.3 實(shí)驗(yàn)參數(shù)測定

1.3.1 微生物復(fù)合改性粘土表面的電鏡觀察 將微生物復(fù)合改性粘土離心(8 028 ×g, 3 min), 棄上清液并將樣品完全浸沒于5%戊二醛內(nèi)固定1 h。使用0.1 mol/L 磷酸緩沖液室溫沖洗浸泡樣品3 次(每次10 min)后, 進(jìn)行乙醇梯度脫水, 將其置換到醋酸異戊酯中。置于臨界點(diǎn)干燥儀中干燥處理3 h 后, 利用導(dǎo)電膠固定樣品并噴金。使用掃描電鏡(S-3400N, 日立, 日本)觀察復(fù)合改性粘土表面微生物的吸附情況。

1.3.2 16SrDNA 序列測序 從樣本中提取基因組DNA 后, 用帶有barcode 的特異引物擴(kuò)增rDNA 的保守區(qū)(V3-V4 341F CCTACGGGNGGCWGCAG ～466 806R GGACTACHVGGGTATCTAAT)。將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收, 用QuantiFluor TM 熒光計(jì)進(jìn)行定量。將純化的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行等量混合, 連接測序接頭, 構(gòu)建測序文庫, Illumina PE250 上機(jī)測序。

1.3.3 微生物密度測定 采用流式細(xì)胞儀(BD FACS Calibur, USA)對(duì)微生物進(jìn)行密度測定。將樣品經(jīng)SYBR Green I 染色劑(體積比1︰10 000)避光染色15 min 后, 上機(jī)檢測。微生物與其他生物的判別主要根據(jù)與細(xì)胞大小有關(guān)的前向散射信號(hào)(forward scatter,FSC)、與細(xì)胞內(nèi)部復(fù)雜程度有關(guān)的側(cè)向散射信號(hào)(side scatter, SSC)、DNA 與SYBR Green I 結(jié)合后經(jīng)激發(fā)所產(chǎn)生的綠色熒光信號(hào)(FL1, 波長515—545 nm)等參數(shù)完成。每一樣品在“slow”狀態(tài)下測量30 s, 利用內(nèi)含數(shù)量已知Beads 的絕對(duì)計(jì)數(shù)管(BD Trucount tubes,美國)確定微生物的密度。

1.3.4 吸附在粘土上的微生物密度測定 取1.2.1所述的不同熟化條件下的微生物復(fù)合改性粘土懸濁液5 mL, 靜置3 h 使其完全沉淀, 取上層菌懸液測定微生物密度D1; 向下層沉淀中加入10 mL PBS 緩沖液洗脫吸附在改性粘土表面的微生物后離心(2 057×g, 10 min), 重復(fù)洗脫3 次。利用流式細(xì)胞儀測定上清液中的微生物密度D2, 將沉淀烘干至恒重后稱重得到改性粘土的干重M1。吸附在粘土上的菌密度計(jì)算公式為:

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用FlowJo 軟件(TreeStar, 美國)進(jìn)行細(xì)菌數(shù)量的讀取和分析。運(yùn)用Excel 2013 和Origin 2019 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及繪圖, 數(shù)據(jù)使用SPSS 軟件ANOVA、LSD 功能進(jìn)行方差分析, 對(duì)各實(shí)驗(yàn)與對(duì)照組均值之間的差異性進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同種類的微生物及微生物復(fù)合改性粘土對(duì)東海原甲藻的去除效果

2.1.1 不同種類的微生物對(duì)東海原甲藻的去除效果 為篩選適用于治理東海原甲藻的微生物, 本實(shí)驗(yàn)選用幾種常用于水產(chǎn)養(yǎng)殖與水體修復(fù)的微生物(芽孢桿菌、糞鏈球菌、光合細(xì)菌、乳酸菌)及復(fù)合菌(EM 菌), 分別進(jìn)行了對(duì)東海原甲藻的去除實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 不同微生物去除東海原甲藻的有效密度不同, 光合細(xì)菌、糞鏈球菌、芽孢桿菌的有效密度分別為1.5、2、2×109cells/L, EM 菌、乳酸菌的有效密度分別為1.5、2×1010cells/L; 且去除率隨微生物密度的升高而升高(圖1a)。

以往研究中, 大部分抑藻微生物無法被大規(guī)模應(yīng)用于藻華治理的主要原因在于其無法適應(yīng)目標(biāo)水體環(huán)境, 因此微生物在目標(biāo)水體中的存活狀態(tài)是其抑藻效率的重要因素。為此, 本研究進(jìn)一步探索了各種微生物在東海原甲藻藻液中的存活狀況, 結(jié)果如圖1b 所示。由圖可以看出, 以2×1010cells/L 作為微生物的初始密度, 與東海原甲藻進(jìn)行共培養(yǎng), 發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間增長, 糞鏈球菌、芽孢桿菌、光合細(xì)菌的密度變化較小, 說明其適應(yīng)性較差、難以生長; 相比而言,復(fù)合菌劑EM 菌呈現(xiàn)明顯的增長趨勢, 反映出其適應(yīng)性強(qiáng)、容易在此環(huán)境中生存的特點(diǎn), 具有應(yīng)用于藻華治理的潛力。

以EM 菌為實(shí)驗(yàn)材料, 進(jìn)一步考察了EM 菌對(duì)東海原甲藻的去除作用適宜時(shí)間與方式。結(jié)果表明, 隨作用時(shí)間增長, 低密度(≤1010cells/L) EM 菌添加組內(nèi)的東海原甲藻密度不斷上升; EM 菌添加量為1.5×1010cells/L 的處理組藻密度先緩慢上升而后下降,24 h 后趨于穩(wěn)定; EM 菌密度高于2×1010cells/L 時(shí),藻密度在8 h 后快速下降, 并于24 h 后趨于消亡(圖1c)。將液態(tài)EM 菌經(jīng)過0.22 μm 濾膜過濾, 加入東海原甲藻藻液中, 考察了EM 菌濾液對(duì)去除東海原甲藻的影響, 發(fā)現(xiàn)EM 菌密度≥1.5×1010cells/L 時(shí), 其濾液具有去除效果; 隨菌密度上升, 其濾液去除率升高,且濾液去除率始終低于未過濾的菌液(圖1d)。

圖1 微生物對(duì)東海原甲藻的去除效果Fig.1 Effect of removal of microorganisms on Prorocentrum donghaiense

2.1.2 不同微生物復(fù)合改性粘土對(duì)東海原甲藻的去除效果 由于不同微生物制劑因其制備方式及物態(tài)不同, 相同體積或重量下菌密度存在較大差異;如果設(shè)定統(tǒng)一的菌密度, 微生物制劑的添加量將存在很大的差異。綜合考慮室內(nèi)實(shí)驗(yàn)和實(shí)際應(yīng)用的可行性, 設(shè)定各種微生物制劑添加量為0.5 g/L(固態(tài))或0.5 mL/L(液態(tài)), 與濃度為0.1 g/L 的I 型改性粘土(MC I)復(fù)合, 制備成不同的微生物復(fù)合改性粘土(MC V), 探討微生物復(fù)合改性粘土對(duì)東海原甲藻去除效果(表1)。

表1 不同微生物復(fù)合改性粘土對(duì)東海原甲藻的去除效果Tab.1 Removal rate of MC V on Prorocentrum donghaiense

結(jié)果表明, 僅添加0.1 g/L 的I 型改性粘土(MC I)的處理組對(duì)東海原甲藻的去除率為39%; 芽孢桿菌、乳酸菌與MC I 復(fù)合后, 去除率未發(fā)生顯著性變化;光合細(xì)菌與MC I 復(fù)合后去除率顯著降低(P<0.05);糞鏈球菌與MC I 復(fù)合后, 去除率略有上升; EM 菌與改性粘土復(fù)合后, 去除率可提升至70%左右, 顯著高于其他微生物種類(P<0.01)。值得注意的是, 僅添加0.5 mL/L 的EM 菌時(shí)對(duì)東海原甲藻無去除效果; 將其與MC I 復(fù)合后, 除藻效率可進(jìn)一步提高31%, 表現(xiàn)出1+1>2 的現(xiàn)象, 即復(fù)合后改性粘土去除效率大于二者單獨(dú)添加時(shí)的去除率之和。

2.2 EM 菌復(fù)合改性粘土體系對(duì)除藻效率的影響

根據(jù)2.1 的研究結(jié)果, 相比其他微生物制劑, EM菌更適宜藻華治理, 是一類較好的與改性粘土進(jìn)行復(fù)合、提升其除藻效率的生物材料。為此, 后續(xù)均以EM 菌為主要微生物, 開展了不同復(fù)合制備條件對(duì)除藻效率的影響研究。

2.2.1 EM 菌密度對(duì)復(fù)合改性粘土除藻效率的影響 為了進(jìn)一步探討EM 菌復(fù)合改性粘土對(duì)東海原甲藻的去除作用, 固定改性粘土濃度不變, 將液態(tài)EM 菌和經(jīng)過0.22 μm 濾膜過濾后的濾液(不含菌體)與改性粘土進(jìn)行復(fù)合, 考察其對(duì)東海原甲藻的去除效果, 結(jié)果如圖2 所示。與改性粘土組相比, 隨著EM菌添加量的增加, EM 菌復(fù)合改性粘土的去除率不斷上升; EM 菌密度≤0.5×1010cells/L 時(shí)其濾液對(duì)東海原甲藻的去除率無顯著提升, EM 菌密度>0.5×1010cells/L 時(shí), 隨菌密度上升, 其濾液去除率上升; EM 菌密度為2×1010cells/L 時(shí), 二者去除率均達(dá)100%。

圖2 微生物復(fù)合改性粘土體系中EM 菌及其濾液添加量對(duì)除藻效率的影響Fig.2 Effects of proportion of Effective Microorganisms on algal removal efficiency

2.2.2 EM 菌復(fù)合改性粘土制備條件對(duì)除藻效率的影響 由于微生物的菌密度、活性及其在改性粘土上的吸附能力會(huì)受到培養(yǎng)時(shí)間、溫度等條件的影響, 為優(yōu)化微生物復(fù)合改性粘土的制備方法, 本文對(duì)EM 菌進(jìn)行不同熟化時(shí)間與溫度的處理, 研究不同培養(yǎng)條件對(duì)EM 菌復(fù)合改性粘土去除率的影響, 結(jié)果如圖3所示。

結(jié)果顯示, 熟化溫度與時(shí)間均會(huì)對(duì)EM 菌復(fù)合改性粘土的去除率產(chǎn)生影響(圖3a)。適宜范圍內(nèi), 去除率隨著熟化溫度的上升而上升, 4 °C 熟化處理組的去除率低于未熟化的EM 菌復(fù)合改性粘土, 說明低溫不利于EM 菌復(fù)合改性粘土去除效果的發(fā)揮。在低溫條件下, 時(shí)間對(duì)去除率的影響較小; 在高溫條件下, 隨熟化時(shí)間增長, 去除率升高。

為進(jìn)一步探索熟化時(shí)間、溫度與去除率的關(guān)系,繪制熟化時(shí)間與去除率的散點(diǎn)圖并進(jìn)行擬合(圖3b)。4、20、60 °C 所對(duì)應(yīng)曲線的R2(擬合優(yōu)度)分別為0.112、0.723、0.828。熟化溫度為4 °C 時(shí), 隨熟化時(shí)間增長,去除率呈下降趨勢; 熟化溫度為20、60 °C 時(shí), 微生物復(fù)合改性粘土的去除率與熟化時(shí)間顯著正相關(guān),且隨著熟化溫度的提升, 去除率隨熟化時(shí)間增長而上升的趨勢越明顯。

對(duì)于EM 菌與改性粘土復(fù)合體系, 熟化溫度會(huì)對(duì)菌類生長產(chǎn)生重要影響。換言之, 溫度對(duì)微生物在水體和粘土上的密度產(chǎn)生重要影響。為此, 實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索了不同熟化溫度下微生物在水體和粘土上的密度變化: 將EM 菌復(fù)合改性粘土懸濁液中的上層菌懸液與底層粘土分離, 分別測定其中的微生物密度, 研究不同熟化條件下吸附在改性粘土上的微生物數(shù)目與上層懸液中的游離微生物密度的變化情況。

結(jié)果表明, 4 °C 熟化處理組的游離菌密度低于未熟化處理組; 隨著熟化時(shí)間增長, 4 °C 處理組游離菌密度無顯著變化, 20、60 °C 處理組游離菌密度上升(圖3c)。這說明4 °C 不利于微生物繁殖, 適宜溫度下,增加熟化時(shí)間有利于微生物繁殖。

如圖3d 所示, 熟化時(shí)間越長, 吸附在粘土上的菌密度均呈上升趨勢, 4 °C 處理組上升幅度低于20、60 °C 處理組, 說明低溫條件微生物吸附能力較弱,一定范圍內(nèi)溫度升高有利于微生物在粘土上的吸附。

圖3 不同熟化時(shí)間與溫度對(duì)去除率的影響(24 h)Fig.3 Effects of different incubation time and temperature on removal rate (24 h)

3 討論

受自然水體中土著微生物的競爭和不同環(huán)境條件的影響, 微生物往往難以在實(shí)際應(yīng)用的環(huán)境中穩(wěn)定生存(鄭天凌等, 2011), 這是利用微生物方法控制有害藻華亟待解決的問題之一。本研究結(jié)果表明, 相比單一菌種而言, 復(fù)合微生物EM 菌在藻液中更易生長、性能更為穩(wěn)定、除藻作用更強(qiáng)(圖 1), 這與Boruszko (2017)發(fā)現(xiàn)的復(fù)合菌群在新的環(huán)境中能夠快速占據(jù)生態(tài)位, 更易于在自然水體中生存、形成優(yōu)勢微生物群落的結(jié)論一致。除此之外, 本研究發(fā)現(xiàn)利用EM 菌復(fù)合后的改性粘土去除藻華生物的效率高于單獨(dú)利用EM 菌和改性粘土的去除效果之和, 即EM 菌復(fù)合改性粘土對(duì)東海原甲藻的去除效果具有1+1>2 的特點(diǎn), 成為本研究中非常令人感興趣的一個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3.1 EM 菌抑藻作用機(jī)制及其改性粘土復(fù)合后的影響

理論上講, 微生物的除藻作用可分為直接和間接作用。直接作用指微生物直接攻擊藻細(xì)胞, 通過侵入、攝食藻細(xì)胞, 或接觸藻細(xì)胞后分泌特定的酶類物質(zhì)殺死藻細(xì)胞; 間接作用則指微生物通過分泌胞外活性物質(zhì)、與藻類競爭營養(yǎng)物質(zhì)等方式殺滅藻細(xì)胞。一定菌密度下, EM 菌及其濾液對(duì)東海原甲藻均具有去除效果(圖1c), 這說明EM 菌對(duì)東海原甲藻的去除作用既包括菌體所發(fā)揮的直接作用, 又包括濾液中其分泌的抑藻物質(zhì)的間接作用。

為進(jìn)一步比較改性粘土對(duì)EM 菌的直接與間接抑藻作用的影響, 將圖1d 與圖2 中EM 菌及其濾液與改性粘土復(fù)合前后的除藻率結(jié)合分析, 如圖4 所示。圖中紅線既包括與改性粘土復(fù)合前后EM 菌菌體的直接作用, 又包括其分泌的活性物質(zhì)的間接除藻作用; 黑線則表示與改性粘土復(fù)合前后EM 菌的間接作用, 陰影部分代表二者之差, 即為EM 菌菌體的直接作用。

由圖1a 可知, EM 菌必須到達(dá)一定密度, 其菌液及濾液才具有去除率。但與改性粘土復(fù)合后, EM 菌發(fā)揮直接與間接除藻作用的最低密度由 1.5×1010cells/L 分別降低為0.2×1010、0.5×1010cells/L (圖4)。這說明改性粘土可能具有富集EM 菌及其濾液中的活性物質(zhì)的能力, 使菌-藻混合體系中EM 菌或活性物質(zhì)的局部濃度上升。

圖4 EM 菌及其濾液與改性粘土復(fù)合前后對(duì)東海原甲藻生長的影響(24 h)Fig.4 Influence of Effective Microorganisms and filtrate on Prorocentrum donghaiense before and after adding modified clay(24 h)

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 改性粘土對(duì)EM 菌具有一定的富集能力(圖3d), 進(jìn)一步對(duì)EM 菌復(fù)合改性粘土進(jìn)行電鏡觀察發(fā)現(xiàn), EM 菌可以附著在改性粘土表面(圖5a), 證實(shí)了上述推測。為進(jìn)一步比較改性粘土對(duì)EM 菌及其分泌的抑藻物質(zhì)富集能力的差異, 將圖4 中EM 菌與改性粘土復(fù)合前后的直接、間接除藻作用變化進(jìn)行比較(表2)。與改性粘土復(fù)合后, 隨著EM 菌添加量的上升,直接作用提升比間接作用提升更快, 這可能說明改性粘土對(duì)EM 菌的富集能力大于對(duì)胞外抑藻物質(zhì)的富集能力?？偠灾? 改性粘土可以富集EM 菌及其濾液中的活性物質(zhì), 增加了菌-藻混合體系中EM 菌的局部濃度, 提升了其直接與間接抑藻作用, 因此出現(xiàn)1＋1>2 的現(xiàn)象。

表2 與改性粘土復(fù)合前后EM 菌/濾液去除率的變化Tab.2 Removal efficiency of Effective Microorganisms and filtrate before and after adding modified clay

3.2 EM 菌中可能產(chǎn)生抑藻作用的優(yōu)勢菌種

如前所述, 本實(shí)驗(yàn)使用的EM 菌是一種復(fù)合微生物菌劑, 其除藻效果可能是由某一種或幾種微生物所導(dǎo)致的。為進(jìn)一步探究EM 菌中的有效微生物種類,對(duì)EM 菌的生物組成進(jìn)行了16S 分析, 結(jié)果如表3 所示。結(jié)果表明, 本實(shí)驗(yàn)使用的EM 菌劑主要由芽孢桿菌(Bacillus)、乳酸桿菌(Lactobacillus)、弧菌(Vibrio)、醋酸菌(Acetobacter)等組成, 其優(yōu)勢菌株為芽孢桿菌,達(dá)到61%, 占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢; 占比第二的是乳酸桿菌,僅為11%。所以, 可以認(rèn)為該EM 菌劑產(chǎn)生抑藻作用的主要是芽孢桿菌, 這與前人的相關(guān)結(jié)果一致: Shi等(2006)發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌接觸藻細(xì)胞后可以分泌水解酶從而發(fā)揮直接抑藻作用, 溶解水華束絲藻(Aphanizomenon flosaquae); Lin 等(2020)的報(bào)道證明,芽孢桿菌所分泌的胞外殺藻化合物可以抑制赤潮異彎藻(Heterosigma akashiwo)的酯酶活性和PSⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量(Fv/Fm)。本研究在顯微鏡(Olympus IX71, 日本)下觀察EM 菌復(fù)合改性粘土處理后的東海原甲藻細(xì)胞, 發(fā)現(xiàn)部分藻細(xì)胞的細(xì)胞壁被破壞, 細(xì)胞內(nèi)容物流出(圖5b), 這可能是由芽孢桿菌所引發(fā)的直接抑藻效應(yīng), 與Shi 等(2006)的結(jié)論一致; EM 菌濾液所具備的抑藻功能與Lin 等(2020)的報(bào)道一致。

表3 屬水平最大豐度排名前10 的微生物物種相對(duì)豐度Tab.3 Relative abundances of the top 10 bacteria at the genus level

圖5 EM 菌復(fù)合改性粘土對(duì)藻細(xì)胞的破壞及粘土顆粒表面的細(xì)菌固定情況Fig.5 Damage of micro-modified clay to algal cells and bacterial fixation on the surface of clay

根據(jù)2.1 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 芽孢桿菌作為單菌株存在于水體中時(shí)不易存活, 僅僅使用芽孢桿菌控制藻華的瓶頸在于其無法在自然開闊水體中穩(wěn)定生存。本研究結(jié)果表明, 將芽孢桿菌與其他微生物制成復(fù)合菌劑會(huì)增加其在水體中的穩(wěn)定生存, 從而更好地發(fā)揮抑藻作用。

3.3 微生物復(fù)合改性粘土制備條件的影響

由上述討論可知, 微生物或活性物質(zhì)在粘土上的富集作用導(dǎo)致其產(chǎn)生了1+1>2 的作用, 所以微生物在粘土上的分布會(huì)直接影響去除效率, 而分布狀態(tài)受到時(shí)間、溫度影響。Nathan 等(2000)報(bào)道, 枯草芽孢桿菌(B. subtilis)在石英(SiO2)和剛玉(α-AlO3)表面的吸附反應(yīng)在1 h 內(nèi)達(dá)到平衡。實(shí)驗(yàn)2.2.2 發(fā)現(xiàn)未經(jīng)熟化處理的EM 菌復(fù)合改性粘土體系中, 有3.4%的EM 菌可以附著在改性粘土表面(圖3d), 且隨著培養(yǎng)時(shí)間與溫度上升, 上層菌懸液中的微生物進(jìn)行繁殖(圖3c), 使得EM 菌在改性粘土的吸附狀態(tài)不斷變化。將圖3c、3d 的結(jié)果經(jīng)1.3.4 所述方法計(jì)算后得出不同熟化條件下吸附在粘土上的菌所占比例變化,如圖6 所示。經(jīng)熟化處理后, 吸附率均高于未熟化處理組; 20 °C 吸附率最高, 60 °C 吸附率最低。4 °C 條件下, 隨著熟化時(shí)間增長, 吸附率未發(fā)生顯著變化;20 °C 條件下, 隨著熟化時(shí)間增長, 吸附率先上升后保持穩(wěn)定; 60 °C 條件下, 吸附率先上升后下降。

圖6 熟化溫度與時(shí)間對(duì)吸附率的影響Fig.6 Effect of temperature and time on adsorption rate

結(jié)合圖 3d 游離菌密度的變化情況, 可以發(fā)現(xiàn)4 °C 條件下, 微生物的繁殖被抑制, 導(dǎo)致其除藻率降低; 20 °C 條件下, 微生物的繁殖與吸附作用均被促進(jìn); 60 °C 條件下, 微生物的繁殖被促進(jìn), 而吸附作用比低溫條件下降低。Mceldowney 等(1988)進(jìn)行了溫度(5—45 °C)對(duì)細(xì)菌在聚苯乙烯表面吸附的實(shí)驗(yàn)研究,結(jié)果顯示, 熒光假單胞菌(Pseudomonas ftuorescens)和紫色色桿菌(chromobacteriumsp.)的最大吸附發(fā)生在20—25 °C。本研究進(jìn)一步印證了該結(jié)果。溫度可能是通過改變細(xì)菌表面的蛋白含量或表面電荷來改變其表面疏水性, 進(jìn)而影響細(xì)菌的吸附能力(Parker等, 1984)。此外, 相關(guān)的研究認(rèn)為, 溫度可以通過影響細(xì)菌和土壤顆粒表面活性官能團(tuán)的水解和電離,改變可變電荷的數(shù)量甚至符號(hào), 從而影響二者之間的吸附作用(Venkateswerluet al, 1992)。

綜上, EM 菌具有直接和間接除藻作用, 其中主要發(fā)揮除藻作用的微生物為芽孢桿菌; 改性粘土可以富集EM 菌及其濾液中的抑藻物質(zhì), 從而提升EM菌的直接與間接除藻作用, 因此出現(xiàn)1＋1＞2 的現(xiàn)象;在適宜的熟化溫度、時(shí)間等條件下, EM 菌在改性粘土上的吸附和繁殖得到促進(jìn), 提升了EM 菌復(fù)合改性粘土的除藻能力。

4 結(jié)論

(1) EM 菌劑在藻液中呈現(xiàn)明顯的增長趨勢, 并具有較高的抑藻效果, 是一類適宜于與粘土復(fù)合改性、提升其除藻效率的生物材料。

(2) EM 菌與改性粘土復(fù)合后產(chǎn)生1+1>2 的除藻效果, 主要由于改性粘土對(duì)EM 菌及其分泌的抑藻物質(zhì)具有一定的富集作用, 提升了EM 菌的局部密度,增強(qiáng)了其直接和間接除藻作用。

(3) 對(duì)EM 菌復(fù)合改性粘土進(jìn)行熟化后, 適宜的熟化溫度與時(shí)間能夠促進(jìn)EM 菌的繁殖及其在改性粘土上的吸附, 進(jìn)一步提升對(duì)東海原甲藻的去除效率。