楊佳麗 馮澤中 牛建峰 顧文輝 何幫翔劉雪華 邵之卓 鄭陣兵 王旭雷 王廣策

(1. 中國科學(xué)院海洋研究所實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266071; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266237; 3. 中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049; 4. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院 青島266109; 5. 中國科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心 青島 266071)

紫菜生長于潮間帶, 隨著每日的潮漲潮落, 周期性地經(jīng)歷干出、強(qiáng)光、溫度等脅迫, 在此過程中, 藻體細(xì)胞會產(chǎn)生一系列生理響應(yīng), 其中最重要的就是氧自由基(ROS)的產(chǎn)生與清除(Collénet al, 1999)。目前, 國際上已有大量關(guān)于潮間帶海藻ROS動態(tài)平衡與抗氧化酶活性變化的相關(guān)報(bào)道。Burritt等(2002)通過比較低潮位和高潮位生長的Stictosiphonia arbuscula藻體中過氧化氫和脂質(zhì)過氧化物的含量,確定體內(nèi)抗氧化酶活性較高的藻體具有更強(qiáng)的逆境耐受能力。類似的, 研究人員也發(fā)現(xiàn)壇紫菜耐高溫性狀與藻體本底的抗氧化能力密切相關(guān)(楊銳等, 2007;張?jiān)? 2011)。壇紫菜對高溫脅迫的生理響應(yīng)總體上可概括為: 高溫脅迫導(dǎo)致ROS含量升高, 丙二醛(MDA)含量增加, 抗氧化機(jī)制和滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)在活性氧信號下被激活, ROS被清除, 最終體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和消除重新獲得平衡(張?jiān)? 2011)。而且, 還原型NADPH氧化酶(NOX)介導(dǎo)的超氧陰離子生成被認(rèn)為是導(dǎo)致生物體細(xì)胞內(nèi)ROS水平上調(diào)的第一反應(yīng)(Lambet al, 1997; 郝福順等, 2005)。

在條斑紫菜(Pyropia yezoensis)抗氧化系統(tǒng)響應(yīng)逆境脅迫方面, 亦有眾多研究成果發(fā)表。Heber等(2010)報(bào)道稱, 干出過程中條斑紫菜的光合活性持續(xù)降低且ROS逐漸累積。黃林斌等(2020)也發(fā)現(xiàn)22 °C高溫脅迫條件下培養(yǎng)的不同品系條斑紫菜,Fv/Fm均呈下降趨勢, 而且其下降幅度與脅迫的溫度、脅迫的時(shí)間呈正相關(guān)。侯和勝等(2008)研究了條斑紫菜絲狀體在高溫脅迫下的生理響應(yīng), 發(fā)現(xiàn)長時(shí)間的高溫脅迫使得藻體葉綠素含量下降, 藻體顏色變紅, 可溶性蛋白、丙二醛、可溶性糖含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,后期細(xì)胞內(nèi)容物滲露。Yu等(2020)發(fā)現(xiàn)多種抗氧化酶和抗氧化分子在條斑紫菜應(yīng)對高鹽脅迫中發(fā)揮作用,且本底抗氧化庫庫容大小對清除活性氧的瞬時(shí)暴發(fā)具有重要意義。

我國是世界上最大的紫菜生產(chǎn)國, 但近年來, 隨著全球氣候變暖, 栽培海區(qū)同期溫度不斷升高。同時(shí),由于紫菜栽培面積持續(xù)而無序的擴(kuò)張, 導(dǎo)致海區(qū)栽培密度過大, 從而造成了潮流不暢, 水質(zhì)貧瘠, 最終導(dǎo)致大面積爛菜現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。病爛發(fā)生時(shí), 藻體梢部顏色變紅, 部分藻體顏色變淡, 細(xì)胞死亡呈空胞化,發(fā)白、腐爛甚至脫落(陳偉洲等, 2015)。2012 年, 福鼎敏灶灣壇紫菜大面積病爛暴發(fā)期間, 林曉明(2014)檢測了當(dāng)?shù)睾Ｋ白喜吮砻嫖⑸锴闆r, 認(rèn)為海水中細(xì)菌對壇紫菜爛苗基本無影響, 壇紫菜葉狀體表面并未檢測到微生物的異常繁殖。因而, 這種爛菜現(xiàn)象被認(rèn)為是源于生理性的病變。在氣溫異常升高、海水交換不暢、二氧化碳和營養(yǎng)鹽供給滯緩的情況下易導(dǎo)致壇紫菜病爛的發(fā)生(宋武林, 2009; 賴平玉, 2009;林曉明, 2014)。另一方面, 我們在長期的觀察中也發(fā)現(xiàn), 缺乏干出的紫菜苗簾, 或者連續(xù)的陰雨天, 更容易導(dǎo)致病爛發(fā)生。而病爛發(fā)生時(shí), 處于較高潮位的紫菜受影響程度較輕。目前, 對紫菜病爛現(xiàn)象發(fā)生的原因, 相關(guān)研究基本是從環(huán)境因素方面進(jìn)行分析(宋武林, 2009; 林曉明, 2014), 至于環(huán)境改變對藻體細(xì)胞造成了怎樣的影響, 以及導(dǎo)致紫菜病爛發(fā)生的內(nèi)在生物學(xué)機(jī)制, 一直沒有較為明確和系統(tǒng)的研究。

據(jù)報(bào)道, 壇紫菜耐高溫性狀與其本底的抗氧化能力密切相關(guān)(楊銳等, 2007; 張?jiān)? 2011)。因此我們推測, 條斑紫菜中可能也存在類似的機(jī)制, 即活躍的抗氧化酶活性有助于藻體抵御不良環(huán)境的脅迫;相反, 長期生長于最適環(huán)境條件下的藻體, 其ROS的產(chǎn)生和消除功能處于較不活躍的狀態(tài), 導(dǎo)致條斑紫菜細(xì)胞對逆境響應(yīng)的減弱, 若此時(shí)經(jīng)歷高溫脅迫,很容易造成藻體的氧化損傷, 病菌借機(jī)侵入, 造成大規(guī)模的爛菜。眾所周知, 條斑紫菜幼苗的生長適溫為12—17 °C, 隨著藻體生長, 其適溫有所降低, 適宜鹽度約21—29 (朱建一等, 2016)。為此, 我們采用不同鹽度、不同溫度處理?xiàng)l斑紫菜, 通過測定其光合作用參數(shù)、抗氧化酶活性, 以及相關(guān)基因的表達(dá), 研究了溫度升高及鹽度降低對條斑紫菜抗氧化系統(tǒng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

2020 年12 月初, 從啟東市連濤水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè)合作社青島即墨紫菜栽培海區(qū)剪取附有健康條斑紫菜(Pyropia yezoensis)葉狀體網(wǎng)簾, 帶回實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng), 培養(yǎng)條件為: 溫度15 °C; 光照強(qiáng)度50 μE/(m2·s); 光周期12L︰12D。海水中添加PES 營養(yǎng)鹽, 通氣培養(yǎng), 期間每天換水一次。

1.2 方法

1.2.1 不同鹽度海水處理 在滅菌海水中添加去離子水, 分別配制鹽度為20、25 的稀釋海水。新鮮條斑紫菜分別置于相應(yīng)鹽度海水中適應(yīng)24 h, 其他條件同對照(鹽度30)。分別對不同鹽度(20, 25, 30)條件下的條斑紫菜進(jìn)行高溫、強(qiáng)光處理。本實(shí)驗(yàn)以鹵素?zé)籼峁? 000 μE/(m2·s)的強(qiáng)光照條件, 溫度通過水浴的方法加以控制。各樣本脅迫處理4 h 后, 測定光合作用參數(shù), 收集材料, 吸水紙吸干, 液氮速凍, –80 °C保存待用。

1.2.2 光合參數(shù)測定 藻體在不同鹽度、溫度條件處理后暗適應(yīng) 10 min, 使用調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨xDual-PAM-100 (Heinz Walz, Effeltrich)測定其光合作用參數(shù)(Pfündelet al, 2008)。具體測定程序包括: 初始熒光(Fo), 以12 μE/(m2·s)的測量光測定獲得; 最大熒光參數(shù)(Fm), 使用飽和脈沖[SP, 強(qiáng)度6 000 μE/(m2·s)],持續(xù)時(shí)間300 ms 測定; 可變熒光(Fv)由Fm和F0的差值獲得。測定過程中光化光強(qiáng)度設(shè)定為57 μE/(m2·s),通過運(yùn)行飽和脈沖的方法, 獲得光合作用各參數(shù), 并在Microsoft Office Excel 2003 中進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并作圖,P<0.05 時(shí)認(rèn)為差異顯著。

1.2.3 過氧化氫(H2O2)含量測定 取適量–80 °C凍存的條斑紫菜樣品, 放入2 mL 離心管, 液氮預(yù)凍,于研磨儀(JX-FSTPRP-24, 凈信科技, 中國上海)粉碎成粉, 加適量提取液(南京建成)充分混勻, 12 000g,4 °C 離心10 min, 小心吸取上清, 得粗提液。使用多功能微孔板檢測儀(M1000Pro, Tecan Ifinite,Switzerland), 按試劑盒操作步驟, 測定吸光值, 計(jì)算H2O2含量。

1.2.4 丙二醛(MDA)含量測定 通過植物MDA 試劑盒(南京建成)測定。材料粉碎研磨及粗提液的獲得方法同前。按照說明書步驟, 以無水乙醇為空白對照,以10 nmol/mL 的MDA 標(biāo)準(zhǔn)品作為標(biāo)準(zhǔn)管對樣本中MDA 含量的標(biāo)定, 不同樣本作為測定管, 使用多功能微孔板檢測儀(M1000Pro, Tecan Ifinite, Switzerland)在340 nm 波長下測定吸光度, 計(jì)算MDA 含量。

1.2.5 抗氧化酶活性測定 材料粉碎研磨及粗提液的獲得方法同前。超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成)基于WST-8 的顯色反應(yīng), 通過比色對組織樣品中的酶活進(jìn)行測定; 抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性通過APX 試劑盒(南京建成)測定, 根據(jù)單位時(shí)間內(nèi)A290吸光度的減少值計(jì)算。過氧化氫酶(CAT)活性通過CAT 試劑盒(南京建成)測定, 根據(jù)單位時(shí)間內(nèi)A405吸光度的變化量測定獲得。過氧化物酶(POD)活性通過POD 試劑盒(南京建成)測定, 根據(jù)單位時(shí)間內(nèi)A420吸光度的變化量測定獲得。

1.2.6 抗氧化酶系統(tǒng)關(guān)鍵分子實(shí)時(shí)熒光定量(qRT-PCR)檢測

(1) RNA 提取 各取適量不同條件處理后的樣品, 依據(jù)RNAprep pure 試劑盒說明書進(jìn)行總RNA提取。提取得到的 RNA 濃度通過 Nanodrop Photometer 分光光度計(jì)(IMPLEN, CA, 美國)測定。每個樣品提取3 次。

(2) 反轉(zhuǎn)錄 反轉(zhuǎn)錄操作依據(jù)TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說明書進(jìn)行, 每個反應(yīng)含總RNA 200 ng,具體操作步驟包括: (1) 去除基因組 DNA 反應(yīng)。5×gDNA Eraser Buffer 2 μL, gDNA Eraser 1 μL, Total RNA (200 ng), 添加RNase Free dH2O 至10 μL; 42 °C 2 min; (2) 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。向步驟(1)的反應(yīng)液中加入以下試劑: PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL, RT Primer Mix 1 μL, 5×Primescript Buffer 4 μL, RNase Free dH2O 4 μL; 37 °C 15 min, 85 °C 5 s, 4 °C 保存。所獲cDNA 模板置于–20 °C 暫存。

(3) 引物設(shè)計(jì) 選擇eEF-1a(Elongation factor1-α)為內(nèi)參基因, 基因序列從本實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得。利用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)引物, 基因名稱及引物序列見表1。

表1 目標(biāo)基因引物序列及PCR 產(chǎn)物長度Tab.1 Primer sequences and the PCR product sizes of target genes

(4) qRT-PCR 條件優(yōu)化及基因表達(dá)量測定 通過調(diào)整PCR 各參數(shù), 分別對各引物擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化。將獲得的純化片段插入PMD19-T 載體, 轉(zhuǎn)化E.coil感受態(tài)細(xì)胞。菌落 PCR 及測序驗(yàn)證后, 利用EZNA TM plasmid mini kit 提取試劑盒提取質(zhì)粒, 并對質(zhì)粒進(jìn)行10 倍梯度稀釋, 進(jìn)行引物擴(kuò)增效率檢測。如擴(kuò)增效率達(dá)到90%—110%, 則進(jìn)行qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)。

借助于StepOne Plus 多色實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(ABI, Foster, CA, USA), 使用2 × SYBR Green Master Mix (Roche, 德國), 每組處理樣品設(shè)3 個重復(fù), 進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄水平的測定。qRT-PCR 反應(yīng)體系20 μL, 包括1 μL cDNA 模板, 10 μL 2 × SYBR Green Master Mix, 上下游引物各0.5 μL (濃度為10 μmol/μL), 8 μL RNase-free 水。qRT-PCR 反應(yīng)程序: 預(yù)變性: 95 °C 10 min; 變性: 95 °C 10 s、退火: 不同引物有不同退火溫度15 s、延伸: 72 °C 25 s, 40 個循環(huán); 65 °C 30 s,61 個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后, 通過2–ΔΔCt的方法計(jì)算相對基因表達(dá)值(Livaket al, 2001)。

2 結(jié)果

2.1 不同脅迫處理?xiàng)l件下光合參數(shù)的變化

脅迫處理 4 h 后, 各樣本潛在最大量子產(chǎn)額(Fv/Fm)及非光化學(xué)淬滅(Y(NO))結(jié)果如下圖所示(圖1)。在15 °C 下, 不同鹽度處理組的Fv/Fm無顯著性差異;而在20 °C 處理后,Fv/Fm明顯降低(圖1a), 各樣本的潛在光合作用均受到了影響, 尤其是20 低鹽處理的樣本, 其活性不僅顯著低于15 °C 處理的樣本, 而且也明顯低于鹽度25 及鹽度30 在20 °C 高溫條件下的Fv/Fm。

非光化學(xué)淬滅Y(NO)值則顯示, 在15 °C 條件下,隨著鹽度降低,Y(NO)值存在上調(diào)趨勢。而20 °C 高溫脅迫下, 30 鹽度下藻體Y(NO)值相較于15 °C 顯著上調(diào), 且隨鹽度降低Y(NO)值持續(xù)上調(diào)(圖1b)。

圖1 不同鹽度、溫度條件下條斑紫菜Fv/Fm 及Y(NO)的變化Fig.1 Changes in Fv/Fm and Y(NO) of P. yezoensis under different salinity and temperature conditions

2.2 過氧化氫及丙二醛含量變化

測定結(jié)果顯示, 在30 鹽度下, 20 °C 高溫脅迫會導(dǎo)致H2O2含量顯著增加, 而在較低的25 及20 鹽度條件下, H2O2含量與15 °C 低溫條件下相當(dāng), 未見明顯變化(圖2)。

圖2 條斑紫菜葉狀體不同處理?xiàng)l件下H2O2 含量Fig.2 H2O2 content of P. yezoensis under different treatment conditions

機(jī)體MDA 含量可間接反應(yīng)細(xì)胞受損傷的程度。本實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果如圖3 所示, 在15 °C 低鹽(20)條件下, MDA 含量相對低于鹽度25 及30 樣本中的含量,但當(dāng)溫度上升到20 °C 時(shí), MDA 含量顯著上升。在20 °C 條件下, 鹽度25 和20 處理的樣本中, MDA 含量亦出現(xiàn)輕微上調(diào), 且顯著高于鹽度 30 條件下的MDA 含量。

圖3 條斑紫菜葉狀體不同處理?xiàng)l件下MDA 含量Fig.3 MDA content of P. yezoensis under different treatment conditions

2.3 抗氧化酶活性測定

前期研究表明, 抗氧化系統(tǒng)在條斑紫菜應(yīng)對環(huán)境脅迫的過程中發(fā)揮了重要作用(Yuet al, 2020)。因此, 本文測定了超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)在不同條件下的活性變化(圖4)。

圖4 條斑紫菜葉狀體不同處理?xiàng)l件下抗氧化酶活性變化Fig.4 Changes of antioxidant enzyme activities in P. yezoensis under different treatment conditions

SOD 酶活檢測結(jié)果顯示(圖4a), 鹽度降低, SOD酶活性增加, 尤其在鹽度20 條件下, 其活性較相同溫度下30 鹽度處理組樣本顯著上調(diào)。升高的溫度也會引起SOD 酶活性的上調(diào), 在鹽度30 和20 處理組中, 20 °C 條件下樣本SOD 活性均顯著高于15 °C 培養(yǎng)樣本的SOD 活性。

在15 °C條件下, CAT活性隨鹽度的降低而呈現(xiàn)降低的趨勢。當(dāng)溫度升高至20 °C后, 無論在高鹽還是低鹽條件下, CAT活性均明顯低于15 °C (圖4b), 同時(shí)發(fā)現(xiàn), CAT活性在鹽度20條件下下調(diào)最為明顯。

抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性(圖4c)在15 °C 條件下, 隨著鹽度的降低呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢; 鹽度25 條件下, APX 活性顯著降低; 在鹽度20 下, 又出現(xiàn)明顯的上調(diào)。而鹽度不變, 溫度升至20 °C 時(shí)后APX酶活出現(xiàn)顯著下調(diào)。尤其在鹽度20 的樣本中, APX 活性受到明顯的影響, 降至15 °C 條件下的三分之一。

過氧化物酶(POD)活性測定結(jié)果顯示(圖4d), 在15 °C, 不同的鹽度條件下處理4 h 后其活性無明顯變化, 當(dāng)溫度升高至20 °C 時(shí), 鹽度30 和25 培養(yǎng)下的POD 活性略有下降, 但不顯著, 而在鹽度20 處理的藻體中, POD 活性出現(xiàn)顯著上調(diào)。

2.4 抗氧化酶系統(tǒng)關(guān)鍵基因的實(shí)時(shí)熒光定量分析

熒光定量檢測結(jié)果顯示SOD 表達(dá)量(圖5a)在不同鹽度條件下無明顯差別, 除鹽度20 處理的樣本外,較高溫度的脅迫使得SOD 表達(dá)均明顯上調(diào)。因此, 推測SOD 的表達(dá)受鹽度影響較小, 而溫度對SOD 的表達(dá)影響較大。但在高溫低鹽(20 °C, 鹽度20)條件下,SOD 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)受到了抑制。

藻體中H2O2可被CAT 直接還原為H2O 和O2。熒光定量結(jié)果顯示15 °C 下, 與30 鹽度條件下的對照相比, 25 條件下CAT 表達(dá)顯著下調(diào), 而20 的低鹽可誘導(dǎo)CAT 上調(diào)表達(dá)。相反地, 在溫度升高至20 °C 后,CAT 的表達(dá)在鹽度30 和25 下與對照相比顯著上調(diào),但20 的低鹽條件則抑制了其轉(zhuǎn)錄活性(圖5b)。

與SOD 的轉(zhuǎn)錄變化趨勢類似, APX 轉(zhuǎn)錄水平(圖5c)在溫度15 °C 條件下亦呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢,值得注意的是在20 的低鹽脅迫下, APX 轉(zhuǎn)錄水平與其他鹽度處理組相比, 出現(xiàn)顯著的上調(diào)。高溫脅迫使得APX 在鹽度25 與30 條件下, 表達(dá)量均明顯上調(diào),而在鹽度20 條件下, APX 表達(dá)則出現(xiàn)明顯的下調(diào)。

圖5 不同培養(yǎng)條件下抗氧化酶關(guān)鍵基因的表達(dá)變化Fig.5 Changes of the expression of key antioxidant enzyme genes under different conditions

POD 的表達(dá)在鹽度25 及20 條件下顯著下調(diào)。在20 °C 高溫條件下, 鹽度30 處理的樣本POD 轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào), 低鹽條件下的轉(zhuǎn)錄隨鹽度降低而呈下調(diào)趨勢(圖5d)。

谷胱甘肽還原酶(GR)熒光定量的結(jié)果顯示(圖5e), 15 °C 條件下不同鹽度對其表達(dá)量影響甚微, 而20 °C 時(shí)出現(xiàn)高溫脅迫, 使得GR 在不同鹽度下的表達(dá)出現(xiàn)明顯變化。在鹽度25 時(shí), 表達(dá)顯著上調(diào), 而在鹽度20 的條件下, 則顯著下調(diào)。

NAD(P)H 氧化酶(NOX)熒光定量結(jié)果顯示(圖5f),NOX 的表達(dá)在15 °C 條件下隨鹽度的降低呈現(xiàn)上調(diào)趨勢, 在鹽度 20 下顯著高于對照。另一方面, 在20 °C 下, NOX 的轉(zhuǎn)錄水平與對照相比均呈顯著變化,在鹽度25 和30 條件下, 其表達(dá)活性比低溫條件下(15 °C)明顯上調(diào), 而在鹽度20 條件下, NOX 轉(zhuǎn)錄活性與低溫條件下(15 °C)相比, 呈明顯下調(diào)表達(dá)。

3 討論

3.1 高溫脅迫對條斑紫菜的影響

光合作用是對溫度變化非常敏感的一個生理生化過程, 高溫等逆境脅迫條件下, 通常是光合作用先受到影響(Berryet al, 1980), 反映在光合作用參數(shù)上則為, 指示光能轉(zhuǎn)換效率參數(shù)的Fv/Fm值首先下降,光合電子傳遞速率降低, 以及非光化學(xué)淬滅的增加(Davisonet al, 1996; 張守仁, 1999)。本研究中, 我們發(fā)現(xiàn)高溫(20 °C)導(dǎo)致條斑紫菜Fv/Fm出現(xiàn)下調(diào), 尤其在高溫和低鹽(鹽度20)復(fù)合脅迫下, 藻體光合作用受到明顯抑制。同時(shí), 指示藻體光合系統(tǒng)受損的非光化學(xué)淬滅Y(NO)值均上升, 且這種損傷在鹽度降低時(shí)更加明顯。因此, 高溫逆境會影響條斑紫菜的光合作用系統(tǒng), 而鹽度的降低則加劇了對光合作用的抑制效果。

正常的植物生長發(fā)育過程中, 其機(jī)體內(nèi)會維持一個相對穩(wěn)定的氧自由基代謝平衡狀態(tài), 而這種相對穩(wěn)定的狀態(tài)在脅迫發(fā)生時(shí)會遭到破壞(Mittleret al,2006)。高能態(tài)電子與氧分子結(jié)合形成活性氧(reactive oxygen species, ROS) (Mittler, 2002), 包括單線態(tài)氧(singlet oxygen,1O2)、過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)、超氧陰離子(superoxide anion free radical, O2–)和羥自由基(hydroxyl radical, HO·)。構(gòu)成細(xì)胞的蛋白質(zhì)、DNA、脂質(zhì)等可能受到氧化損傷而導(dǎo)致正常的細(xì)胞功能受到影響(Apelet al, 2004)。若藻體內(nèi)生物膜的多不飽和脂肪酸與氧自由基發(fā)生過氧化反應(yīng), 生成丙二醛(MDA), 會引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合, 加劇細(xì)胞膜的損傷, 因而MDA 的含量可反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化的程度, 間接反映出細(xì)胞受損傷的程度。我們的測定結(jié)果顯示不同處理?xiàng)l件下,H2O2含量的變化不大, 說明條斑紫菜中存在有效的氧自由基清除機(jī)制。而值得注意的是, 溫度升高的條件下, 鹽度25 或20 條件下的樣本中, MDA 含量出現(xiàn)顯著增加。因此推測, 在高溫(20 °C)條件下, 藻體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)作用的發(fā)揮可能受到了抑制, 尤其在鹽度降低的情況下, 會導(dǎo)致藻體MDA 含量增加, 最終可能引起藻體膜系統(tǒng)受到損傷。

3.2 抗氧化酶活化是條斑紫菜抵御高溫脅迫的重要機(jī)制之一

植物在長期的進(jìn)化過程中, 發(fā)展出了多種應(yīng)對環(huán)境脅迫的保護(hù)機(jī)制。而抗氧化防御系統(tǒng)的活性變化被認(rèn)為是植物細(xì)胞耐高溫的主要機(jī)制之一, 依賴抗氧化系統(tǒng)的作用, 生物體內(nèi)的氧化脅迫得到緩解(Sies, 1993; 臧曉南等, 2008)。本文測定發(fā)現(xiàn), 條斑紫菜葉狀體在高溫處理4 h后, 無論SOD酶活(圖4a), 還是其轉(zhuǎn)錄水平(圖5a)均出現(xiàn)上調(diào)。然而, 在25及20的低鹽度條件下, H2O2的含量卻沒有出現(xiàn)與SOD酶活相對應(yīng)的上調(diào)趨勢。尤其是20低鹽條件下, 20 °C處理4 h后, 其酶活顯著上調(diào), 而H2O2的含量卻保持在較低水平, 說明H2O2的清除效率相對較高。同時(shí), 高溫條件下, 低鹽(20)脅迫導(dǎo)致SOD轉(zhuǎn)錄水平略微下調(diào), 暗示SOD的轉(zhuǎn)錄已經(jīng)受到了影響。

CAT 可以將H2O2轉(zhuǎn)化為水和分子氧, 從而減少對細(xì)胞造成的氧化損傷。高溫脅迫下, CAT 活性的降低說明其對溫度較敏感, 而且, 15 °C 下, CAT 活性隨海水鹽度降低而下降, 說明其活性對鹽度也較為敏感。在轉(zhuǎn)錄水平, 20 °C 的高溫脅迫導(dǎo)致CAT 表達(dá)在鹽度25 和30 樣本中均顯著上調(diào), 這與CAT 被認(rèn)為是植物熱激下ROS 主要清除劑的報(bào)道相一致(Gillet al,2010)。然而, 無論在酶活水平還是在基因轉(zhuǎn)錄水平,CAT 在高溫低鹽(20 °C, 鹽度20)條件下均被抑制。暗示此條件下產(chǎn)生的H2O2不能被CAT 及時(shí)分解, 會對細(xì)胞造成一定的損傷。

POD 以H2O2為電子受體, 催化H2O2直接氧化酚類或胺類化合物, 據(jù)報(bào)道, POD 活性在條斑紫菜應(yīng)對高溫脅迫的過程中呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(侯和勝等, 2008), 本實(shí)驗(yàn)中, 我們僅測定了高溫脅迫4 h 后的酶活變化, 發(fā)現(xiàn)在鹽度25 與30 的條件下, 其活性變化同文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果類似(圖4d), 而鹽度20 條件下高溫處理樣本POD 酶活則顯著升高, 說明低鹽高溫脅迫可能已經(jīng)造成了條斑紫菜體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的失衡, POD 活性的顯著上調(diào), 也解釋了CAT (圖4b)在此條件下下調(diào)而H2O2含量卻略微下調(diào)的原因。而在轉(zhuǎn)錄水平, 除鹽度30 外, 藻體在低鹽高溫度條件下的轉(zhuǎn)錄受到了顯著抑制(圖5d), 因此, 隨著脅迫時(shí)間的推移, POD 酶在低鹽高溫條件下的表達(dá)將受到抑制,酶活不可避免地出現(xiàn)下調(diào), 最終導(dǎo)致氧自由基對細(xì)胞造成更為嚴(yán)重的損傷。

抗壞血酸過氧化物酶(APX)是葉綠體和過氧化物酶體中主要的H2O2清除酶, 以還原型抗氧壞血酸(AsA)作為電子供體將H2O2還原, 與過氧化氫酶(CAT)相比具有更高的H2O2親和性, 很多情況下是一種更高效的H2O2清除劑(閻成士等, 1999)。其酶活與轉(zhuǎn)錄在在整個低鹽、高溫脅迫過程中顯著變化, 暗示APX對于環(huán)境脅迫具有較強(qiáng)烈的響應(yīng), 且高溫條件明顯抑制了其活性, 而鹽度的降低, 使得這種抑制作用更為明顯(圖4c)。APX的轉(zhuǎn)錄在鹽度20, 溫度15 °C時(shí)表達(dá)出現(xiàn)明顯上調(diào)(圖5c), 則可能暗示在較低的溫度下,低鹽已經(jīng)造成了藻體的脅迫, 而在溫度升高的條件下, APX的表達(dá)受到了抑制, 故而導(dǎo)致APX的表達(dá)顯著下調(diào)。同時(shí)發(fā)現(xiàn), 鹽度25和30下培養(yǎng)的藻體, 其APX活性雖然在高溫脅迫下降低, 但其表達(dá)量則呈現(xiàn)明顯的上調(diào)(圖4c), 說明, 高溫條件下APX迅速發(fā)揮功能而失活, 轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)則為其合成奠定基礎(chǔ), 隨著脅迫時(shí)間的延長, APX酶活可能出現(xiàn)上調(diào),這與其他報(bào)道中抗氧化酶活性在脅迫條件下出現(xiàn)先降低后升高的趨勢相同(王潤豪等, 2020)。另據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道, 高等植物中, APX在熱激條件下常被作為一種代表性的ROS清除酶被激活(Hanet al, 2019)。但在鹽度20的條件下培養(yǎng)的藻體, 其表達(dá)受到了抑制, 因而,藻體對高溫脅迫的響應(yīng)受到了抑制。

谷胱甘肽還原酶(GR)以NADPH 為電子供體將氧化型谷胱甘肽(GSSG)還原為還原型谷胱甘肽(GSH), 是維持谷胱甘肽還原性的重要酶, 而GSH 是抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)(AsA-GSH 循環(huán))的電子供體,將脫氫型抗壞血酸(DHA)還原為AsA, 被認(rèn)為是葉綠體中清除超氧陰離子和 H2O2的主要途徑。相對于CAT, 在15 °C 的低溫條件下, 鹽度變化對GR 轉(zhuǎn)錄水平無明顯影響, 而在20 °C 高溫脅迫下, 不同鹽度條件下GR 的轉(zhuǎn)錄存在較大區(qū)別, 30 的鹽度條件下與對照相比無明顯變化, 25 鹽度條件下, 其轉(zhuǎn)錄顯著上調(diào),在20 鹽度條件下顯著下調(diào)(圖5e)。說明細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)及AsA-GSH 循環(huán)在低鹽條件下可能受到了抑制, 導(dǎo)致藻體更易受到氧化損傷。

3.3 海水鹽度與高溫誘發(fā)的條斑紫菜病爛發(fā)生密切相關(guān)

綜上所述, 條斑紫菜葉狀體在鹽度25與30的條件下, 短時(shí)經(jīng)歷高溫、強(qiáng)光等環(huán)境因子脅迫時(shí), 藻體內(nèi)部分抗氧化酶活性及抗氧化系統(tǒng)關(guān)鍵基因的表達(dá)均呈現(xiàn)上調(diào)趨勢, 抗氧化系統(tǒng)對藻體細(xì)胞起到了有效地保護(hù)作用。但當(dāng)鹽度降低到20時(shí), 藻體利用NAD(P)H提供電子而生成超氧陰離子自由基的反應(yīng)受到了抑制, 同時(shí), 抗氧化系統(tǒng)相關(guān)酶的表達(dá)也不同程度地受到了影響, 因而不可避免地造成了MDA含量上升, 最終導(dǎo)致藻體細(xì)胞受到了嚴(yán)重的氧化損傷。另據(jù)報(bào)道, 較高的抗氧化酶的表達(dá), 對于壇紫菜應(yīng)對水體升溫導(dǎo)致的環(huán)境脅迫具有積極意義(楊銳,2007; 張?jiān)? 2011)。這是因?yàn)橹参矬w內(nèi)存在交叉適應(yīng)現(xiàn)象, 即一種脅迫處理會誘導(dǎo)出植物體對另外一種或多種逆境的抗性, 因而可以通過多種脅迫預(yù)處理來增強(qiáng)植物對某種逆境的抵抗力(Valladareset al,1997; Sabehatet al, 1998; Ladjalet al, 2000; 康建宏等,2008; 張永福等, 2015)。事實(shí)上, 在紫菜人工栽培生產(chǎn)過程中, 人們也正是利用干出脅迫處理來提高紫菜的品質(zhì)和預(yù)防病爛發(fā)生。分布于江蘇南通長江入?？诒辈康膯|、如東等沿海地區(qū), 是我國高品質(zhì)條斑紫菜主產(chǎn)區(qū), 由于長江沖淡水的影響, 海區(qū)鹽度一般在24—26之間(何小燕等, 2010)。栽培期間, 如遇高溫降水, 很容易導(dǎo)致爛菜現(xiàn)象的發(fā)生。

4 結(jié)論

在溫度升高及鹽度降低的雙重脅迫下, 條斑紫菜藻體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)酶活及相關(guān)基因的表達(dá)受到抑制, 并由此導(dǎo)致藻體MDA 含量增加, 膜系統(tǒng)受到損傷, 這可能是紫菜病爛發(fā)生的重要誘因之一。故在海水鹽度較低的南通海區(qū), 溫度升高很容易導(dǎo)致紫菜病爛的發(fā)生, 而山東青島、威海等北方海區(qū)海水鹽度通常維持在30 左右, 即使在遭遇高溫、降雨天氣時(shí),藻體抗氧化系統(tǒng)的表達(dá)受影響程度仍然較小。因此,在同樣的海水溫度條件下, 山東栽培的條斑紫菜在抵御高溫誘發(fā)的病爛方面, 比南通沿岸栽培的同品系條斑紫菜具有更大的優(yōu)勢。