烏日漢，陳玉花，麗麗，畢力格，孟香花，寶樂爾，韓曉靜，肖田梅，白梅榮*

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)化學(xué)與材料學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000）

川楝子是楝科植物川楝的干燥成熟果實，蒙藥名為巴茹日，異名為布和·查干·毛敦乃·烏熱，味澀、苦，性涼，效輕、淡、燥、鈍，有小毒，具有清巴達(dá)干、希拉、燥熱性希拉烏素、殺蟲止痛及明目等功效，普遍用于治療熱性希拉烏素病、巴達(dá)干希拉合并癥、脫發(fā)、皮膚瘙癢、濕疹、白癜風(fēng)、陶賴、赫如虎、濁熱、新陳熱等多種疾病［1］?，F(xiàn)代研究證實其具有驅(qū)蟲、抗氧化、抗菌、抗血栓、消炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等作用［2］。但其有毒，使應(yīng)用受限。目前川楝子毒性研究較少，是否與其內(nèi)源性代謝物相關(guān)尚不清楚。

代謝組學(xué)是反映機體狀況的小分子代謝物的變化及其功能之間的關(guān)系［3］，現(xiàn)已普遍應(yīng)用于毒理學(xué)和藥物安全評價，可以發(fā)現(xiàn)損傷的發(fā)生、發(fā)展和消失過程中的生物標(biāo)志物，從而揭示毒性靶器官，闡明毒性機制［4］?？诜幬锉淮x酶代謝后會出現(xiàn)生物活性減少而療效減弱和生物活性增大而放大療效兩種現(xiàn)象。川楝子的毒性成分吸收過多而減弱療效將會產(chǎn)生毒性，以肝臟毒性尤為顯著［5］。在毒性－藥效尚未分辨清楚的前提下，為用藥安全起見，首要明確該藥與內(nèi)源性代謝物之間的相關(guān)性。本研究用LC－MS 技術(shù)，分析蒙藥川楝子對大鼠小分子代謝物的改變情況，探討其亞急性毒性作用和可能機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SD 雄性大鼠，SPF 級，體質(zhì)量（200±20）g，由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供，批號：SCXK（遼）2015－0001。飼養(yǎng)環(huán)境SPF 級，光照12 h；動物房內(nèi)24 h維持溫度（23±1）℃，自由飲水，進(jìn)食。

1.2 藥品與試劑

川楝子（內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院蒙藥制劑室）；血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總蛋白（TP）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（CHO）、尿素氮（UREAL）、肌酐（CREA）試劑盒（上海羅氏診斷產(chǎn)品有限公司）；純化水（屈臣氏集團(tuán)有限公司）；質(zhì)譜乙腈（美國Thermo Fisher Scientific公司）；甲酸（美國Sigma－Aldrich公司）。

1.3 儀器

質(zhì)譜儀MASS（TripleTOF5600+，AB SCIEX?）；臺式高速冷凍離心機（Mikro 220R，Hettich）；羅氏cobas c 311全自動生化分析儀［羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司］；移液器（Eppendorf N13462C，德國Eppendorf公司）；粉碎研磨儀（TL－48R，上海萬柏生物科技有限公司）；色譜UHPLC（Nexera UHPLC LC－30A，島津SHIMADZU）。

2 實驗方法

2.1 動物分組及取材

取大鼠32 只，隨機分為正常組、川楝子高劑量組（川高組）、川楝子中劑量組（川中組）和川楝子低劑量組（川低組），每組8 只。川高組給藥劑量為2.571 4 g/kg（臨床等效劑量2 倍），川中組給藥劑量為1.285 7 g/kg（臨床等效劑量），川低組給藥劑量為0.642 9 g/kg（臨床等效劑量1/2 倍）。自實驗開始，給藥組給予相應(yīng)的藥物溶液灌胃，每日1 次，連續(xù)21 d；正常組灌胃等量生理鹽水。末次給藥后，麻醉動物，取血分離血清，置于－80 ℃保存?zhèn)溆?，待測肝、腎相關(guān)生化指標(biāo)。采集同一部位肝、腎組織置凍存管儲存?zhèn)錂z。

2.2 代謝物提取

血清樣本于4 ℃解凍后，取100 μL 加入300 μL 甲醇，震蕩提取于12 000 rpm，4 ℃下離心10 min，取上清液進(jìn)樣10 μL，用UPLC－MS檢測。

分別稱取腎臟和肝臟組織50 mg 左右，向PE 管中加入1 000 μL 甲醇，研磨器研磨至勻漿，離心15 min（4 ℃，12 000 rpm），取上清液進(jìn)樣10 μL。

2.3 UPLC－MS檢測

采用Waters BEH HILIC 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相為流動相A（0.1%甲酸水，乙酸銨）和B（乙腈），柱溫35 ℃，流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。洗脫梯度：0～16 min，95%～50% B；16～20 min，50% B；20～21 min，50%～95%B；21～22.5 min，95%B。

質(zhì)譜參數(shù)條件：采用電噴霧電離（ESI）正離子和負(fù)離子模式進(jìn)行檢測。ESI 源條件如下，離子源Gas1：50，離子源Gas2：50，氣簾氣壓力（CUR）：25，界面加熱溫度：500 ℃（正離子）和450 ℃（負(fù)離子），離子噴霧電壓浮動（ISVF）：5 500 V（正離子）和4 400 V（負(fù)離子），TOF 質(zhì)量掃描范圍：100～1 200 Da，產(chǎn)物離子掃描范圍：50～1 000 Da，TOF MS 掃描累積時間0.2 s，產(chǎn)物離子掃描累積時間0.01 s，二級質(zhì)譜采用information dependent acquisition（IDA）獲得，并采用high sensitivity模式，去簇電壓（DP）：±60 V，碰撞能量：（35±15）eV。

2.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用t檢驗、秩和檢驗、單因素方差分析分別進(jìn)行組間比較。P< 0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

利用Analysis Base File Converter 軟件將獲得的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成ABF 格式，再導(dǎo)入MS－DIAL 4.10 軟件進(jìn)行預(yù)處理。使用MassBank、Respect、GNPS 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。分析各組樣本采用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析法（OPLS－DA）。篩選VIP≥1和FC> 1.5（或< 0.5）及P≤0.05 作為差異代謝物。再使用MetaboAnalyst 4.0分析代謝通路。

3 結(jié)果

3.1 肝、腎生化指標(biāo)檢測結(jié)果

給藥第7 天，與正常組比較，川高組、川中組的ALT 和AST 呈上升趨勢。給藥第14 天，與正常組比較，川高組ALT 和AST 顯著升高（P< 0.05），川中組、川低組AST顯著升高（P<0.05），川低組UREA、CREA下降（P<0.01）。結(jié)果見圖1。

圖1 給藥第7天、第14天血清肝腎功能生化指標(biāo)結(jié)果比較

給藥第21天，與正常組比較，川高組ALT和AST顯著升高（P<0.05），川低組AST顯著下降（P<0.01）；與正常組比較，川高、川中、川低組CHO、TP顯著下降（P<0.05）；川中組TG顯著升高（P<0.05），CREA下降（P<0.05）。提示，川楝子對肝臟具有一定的毒性。血清TG升高，CHO、TP降低，可能是營養(yǎng)和吸收能力減弱，也提示肝功能受損，腎功能紊亂。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠血清肝、腎功能生化指標(biāo)比較（±s，n=8）

表1 各組大鼠血清肝、腎功能生化指標(biāo)比較（±s，n=8）

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01。

組別正常組川高組川中組川低組TP（g/L）61.25±7.31 49.07±8.12**47.33±4.86**46.73±6.60**ALT（U/L）37.43±7.90 60.46±16.57**44.04±7.74 35.32±10.89 AST（U/L）109.9±13.22 149.58±48.42*124.33±28.44 87.17±16.32**TG（U/L）0.43±0.17 0.39±0.24 0.57±0.15*0.40±0.14 UREA（mmoL/L）6.80±2.40 8.47±3.43 5.48±0.95 4.96±1.47 CREA（umol/L）40.00±7.15 37.57±6.24 32.44±6.69*34.00±8.29 CHO（mmoL/L）1.64±0.30 1.25±0.27*1.27±0.17**1.18±0.23**

3.2 PCA

PCA 通過主要新變量對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行歸類，去除重復(fù)性差和異常樣本，可觀察樣品的聚集、離散程度。根據(jù)圖2～4，正常組（8）與川楝子組（1）的大鼠血清、肝、腎代謝物呈分離趨勢，說明代謝物具有一定的差異。利用Metabo Analyst 軟件進(jìn)行聚類分析，以熱圖的聚類結(jié)果分析組間差異，顏色深淺表示代謝物水平，紅色為升高、藍(lán)色為降低。根據(jù)圖5～7，正常組與川高組的代謝物相對豐度呈有明顯差異。表明川楝子可使大鼠血清、肝、腎代謝物產(chǎn)生一定變化。

圖2 血清代謝物PCA

圖3 肝代謝物PCA

圖4 腎代謝物PCA

圖5 血清代謝物熱圖

圖6 肝代謝物熱圖

圖7 腎代謝物熱圖

3.3 OPLS－DA

OPLS－DA作為一種有監(jiān)督的分析方法，能夠篩選出差異代謝物。根據(jù)圖8～10，正常組大鼠血清、肝、腎代謝物與川楝子組完全分離，說明代謝物譜有顯著差異。通過參數(shù)檢驗進(jìn)行OPLS－DA模型驗證，具有良好的準(zhǔn)確率和預(yù)測率（參數(shù)R2Y和Q2均>0.5）。

圖8 血清OPLS－DA的S－plot圖

圖9 肝OPLS－DA的S－plot圖

圖10 腎OPLS－DA的S－plot圖

3.4 差異代謝物的篩選

3.4.1 血清差異代謝物的篩選

為尋找潛在差異代謝物，采用OPLS－DA 中VIP≥1 和P<0.05，且fold change>1.5（或<0.5）的標(biāo)準(zhǔn)篩選，通過MassBank、Respect、GNPS 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索分析。川楝子組血清樣本中篩出10 個差異代謝物。與正常組（8）比較，川楝子組（1）吡咯－2－羧酸、纈氨酸、膽紅素、LPC 18∶2、LPC 16∶0、LPC 18∶1 明顯上升，肉堿、sn－甘油－3－磷酸膽堿、胸腺嘧啶－β－D－葡萄糖苷、［5－乙酰氧基－3－（羥甲基）－2－氧基－6－丙烷－2－基環(huán)己－3－烯－1－烯基］3－甲基戊酸酯明顯下降，見表2。

表2 血清差異代謝物鑒定

3.4.2 肝臟差異代謝物的篩選

肝臟樣本中鑒定出20 個差異代謝物。與正常組比較，川楝子組賴氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、蛋氨酸亞砜、甲芬那酸、4，5－二氯－2－正辛基－l－3（2H）－異噻唑啉酮（DCOIT）、表沒食子兒茶素、一磷酸腺苷、S－腺苷－L－同型半胱氨酸、S－（5′－腺苷）－L－同型半胱氨酸、LPE 18∶1、谷氨酰胺（D）顯著下降，N－乙酰－D－氨基葡萄糖、胞嘧啶核苷、3－（5－甲氧基－2，2－二甲基鉻－8－甲基）－3－氧丙二酸、黃嘌呤核苷、異麥芽酮糖、蜜二糖、鄰苯二甲酸二（2－乙基己基）酯（DEHP）顯著上升，見表3。

表3 肝臟差異代謝物鑒定

3.4.3 腎臟差異代謝物的篩選

腎臟樣本中發(fā)現(xiàn)了12 個差異代謝物。與正常組比較，川楝子組1－O－十六烷基－2－C－甲基－3－磷脂酰膽堿、谷氨酰胺（D）、果糖、尿嘧啶、亞油酸、黃嘌呤核苷、谷胱甘肽（還原）、胸腺嘧啶－β－D－葡萄糖苷明顯上升，天冬氨酸、4－甲基苯甲酰乙酸酯、LPE 16∶0、LPE 18∶1明顯下降，見表4。

表4 腎臟差異代謝物的篩選

3.5 差異代謝物通路分析

將篩選出的差異代謝物導(dǎo)入MBRole 2.0 進(jìn)行通路富集分析。血清差異代謝物涉及ABC 轉(zhuǎn)運蛋白、蛋白質(zhì)消化吸收、嘧啶代謝、精氨酸生物合成、氨基酸的生物合成、癌癥的中心碳代謝、氨酰－tRNA 合成代謝、嘌呤代謝、FoxO 信號通路，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝等通路，見圖11。肝臟差異代謝物主要與ABC 轉(zhuǎn)運蛋白、維生素消化吸收、膽固醇代謝、嘧啶代謝、嘌呤代謝、膽汁分泌、代謝途徑、精氨酸和脯氨酸的代謝、煙酸和煙酰胺代謝、精氨酸生物合成等通路顯著相關(guān)，見圖12。腎臟差異代謝物與ABC 轉(zhuǎn)運蛋白、嘌呤代謝、精氨酸和脯氨酸的代謝、代謝途徑、蛋白質(zhì)消化吸收、嘧啶代謝、氨酰－tRNA 合成代謝、癌癥的中心碳代謝、酒精中毒、氨基酸的生物合成等通路相關(guān)，見圖13。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清、肝、腎代謝物均與ABC 轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)性最強，其次為氨基酸代謝、嘌呤代謝。

圖11 血清樣品代謝通路氣泡圖

圖12 肝臟樣品代謝通路氣泡圖

圖13 腎臟樣品代謝通路氣泡圖

4 討論

川楝子含小毒，故其在臨床應(yīng)用上備受限制。本研究以大鼠為研究對象，以川楝子為示例藥物，檢測肝腎常規(guī)指標(biāo)對其進(jìn)行評價，并基于代謝組學(xué)方法對大鼠血清、肝、腎組織樣本進(jìn)行代謝輪廓分析，揭示其亞急性毒性作用和作用機制。

本試驗中，川楝子能明顯增加ALT、AST 活性。血清ATL、AST 是評估肝細(xì)胞損傷狀態(tài)的最靈敏指標(biāo)。說明川楝子的毒性已造成大鼠肝臟損傷和功能障礙。

Crea、Urea 能反映腎小球濾過功能的受損程度，是腎功能變化的一項常用指標(biāo)。本試驗中，川楝子從用藥第14天起可降低Crea、Urea水平（P<0.05），可能是由于大鼠各系統(tǒng)處于高代謝狀態(tài)，使腎小球清除率提高所致；同時川楝子可在胃腸道吸附肌酐，增加排泄量，使得血肌酐降低，實驗結(jié)果提示可能與其給藥劑量緊密相關(guān)。血清TG升高常見于腎功能低下，肝實質(zhì)性病變［6］。血清CHO 和TP 降低可能原因是營養(yǎng)及吸收障礙，肝臟合成蛋白能力下降、肝功能受損，腎病綜合征等［7］。TP 含量減少多為腎功能下降，因血中蛋白的丟失，會紊亂肝臟蛋白質(zhì)脂質(zhì)代謝，也增加TG 的合成［8］。本試驗中，川楝子可升高TG 含量（P<0.05），同時降低CHO、TP含量（P<0.05），可能是腎功能下降和肝功能異常所致。結(jié)果提示，不同條件下肝臟對川楝子毒性作用的敏感性比腎臟高。

通過代謝組學(xué)技術(shù)，分別鑒定出血清、肝臟、腎臟差異代謝物10、20、12 種，這些代謝物的變化可能與其毒性密切相關(guān)。代謝通路富集分析顯示，血清、肝、腎差異代謝物均涉及ABC 轉(zhuǎn)運蛋白、嘌呤代謝、氨基酸代謝、嘧啶代謝等代謝通路。

ABC 轉(zhuǎn)運蛋白是體內(nèi)最廣泛存在的蛋白家族之一。需要消耗ATP 而參與氨基酸、葡萄糖、代謝物、肽段、藥物和帶電離子等物質(zhì)的跨膜運輸［9］。ABC 轉(zhuǎn)運蛋白代謝途徑主要與肉堿、N－乙酰－D－氨基葡萄糖、蜜二糖等有關(guān)，這些代謝物的變化可能會導(dǎo)致ABC轉(zhuǎn)運蛋白代謝通路的變化。研究表明，肉堿能增加大鼠肝組織線粒體抗氧化酶活性，降低或維持脂質(zhì)過氧化物水平［10－11］。川楝子能使肉堿含量下降，說明川楝子能促進(jìn)大鼠肝組織的氧化供能，打破脂質(zhì)過氧化平衡，進(jìn)而影響三羧酸循環(huán)。N－乙酰－D－氨基葡萄糖是氨基糖的生化前體，可提高免疫功能，防止纖維細(xì)胞的過度增殖［12］。其水解酶NAG－ase 水平能反映肝實質(zhì)損害程度［13］。由此推斷，代謝物水平失衡是川楝子產(chǎn)生肝臟毒性的主要機制之一。

氨基酸是生物體系代謝和生理作用的重要物質(zhì)。肝臟是機體進(jìn)行氨基酸代謝的關(guān)鍵場所，當(dāng)其損傷會使氨基酸代謝受到影響，減少肝細(xì)胞內(nèi)的氨基酸合成［14］。其中，甲硫氨酸是一種必需氨基酸，參與谷胱甘肽合成、甲基化反應(yīng)過程。甲硫氨酸的異常下降會誘發(fā)肝臟輕微脂肪變性，從而影響肝臟脂質(zhì)代謝［15］。谷氨酸存在于肝腎組織，催化最終生成α－酮戊二酸，這對肝臟內(nèi)的氨基酸代謝至關(guān)重要，也是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵［16］。川楝子組可明顯降低谷氨酸水平，提示肝細(xì)胞受損。賴氨酸參與機體蛋白質(zhì)的合成并影響能量代謝，在乙酰輔酶A 作用下分解成α－酮戊二酸，進(jìn)入三羧酸循環(huán)［17］。三羧酸循環(huán)是體內(nèi)糖、脂、蛋白質(zhì)等能量與物質(zhì)轉(zhuǎn)化代謝的中心環(huán)節(jié)，從而影響糖、脂類及氨基酸的含量。川楝子可引起大鼠體內(nèi)氨酸代謝物的改變，提示氨基酸代謝失衡可能與肝腎毒性息息相關(guān)。

嘌呤和嘧啶代謝與腎病的發(fā)展緊密相關(guān)［18］。嘌呤代謝為生物合成提供能量和輔助因子，在泌尿系結(jié)石、尿酸生成中有著重要影響［19］。嘌呤是生物體內(nèi)一種重要的堿基。黃嘌呤是體內(nèi)嘌呤堿基之一，也是嘌呤代謝后的產(chǎn)物，由嘌呤堿氧化生成黃嘌呤，再進(jìn)一步氧化為尿酸。肝臟和腎臟是嘌呤代謝的主要部位，其中肝臟是嘌呤從頭合成代謝的重要場所。研究表明，肝臟受損時黃嘌呤氧化酶減少，妨礙黃嘌呤轉(zhuǎn)化為尿酸的代謝，使血尿酸形成過少，影響黃嘌呤的排泄［20］。嘌呤代謝途徑中黃嘌呤核苷的升高，可能與腫瘤組織的增殖需求及腫瘤環(huán)境中嘌呤代謝途徑的變化有關(guān)［21］。川楝子能使黃嘌呤核苷上調(diào)，提示嘌呤代謝途徑的改變可能與肝腎毒性密切相關(guān)。嘧啶的從頭合成代謝途徑是癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞主要依賴場所［22］。胞嘧啶和尿嘧啶是嘧啶的主要衍生物。本研究發(fā)現(xiàn)，川楝子組胞嘧啶核苷和尿嘧啶代謝物含量升高，可能會造成嘧啶代謝途徑的變化，引發(fā)肝腎毒性。

綜上所述，川楝子可明顯改變大鼠體內(nèi)代謝物水平，從而導(dǎo)致體內(nèi)一系列代謝途徑失衡，以2.571 4 g/kg（臨床等效劑量2 倍）、1.285 7 g/kg（臨床等效劑量）、0.642 9 g/kg（臨床等效劑量1/2 倍）劑量口服川楝子，從第14 天起均可產(chǎn)生一定的肝毒性和潛在腎毒性，其機制可能與紊亂ABC 轉(zhuǎn)運蛋白、氨基酸代謝、嘌呤和嘧啶代謝等有關(guān)。