王付啟，李文濤，王媛，秦合偉*

（1.駐馬店市中醫(yī)院，河南 駐馬店 463000；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000）

動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是缺血性心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，目前，西醫(yī)藥治療AS 的療效不甚理想［1］，中醫(yī)藥防治AS 取得了一定的成果，但作用機(jī)制尚不明確。新近發(fā)現(xiàn)微小RNA（microRNA，miRNA）在AS 形成中具有重要的作用，miR－17－5p能夠通過抑制血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）和極低密度脂蛋白受體（very low density lipoprotein receptor，VLDLR）的表達(dá)，影響前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9（proprotein convertase subtillisin/kexin type 9，PCSK9）參與負(fù)調(diào)控VLDLR 的表達(dá)，緩解內(nèi)膜增生、管腔狹窄，影響AS 的發(fā)生發(fā)展［2］。因此筆者推測中醫(yī)藥防治AS 的作用機(jī)制可能與調(diào)控miR－17－5p、靶向調(diào)控VLDLR 或靶向調(diào)控PCSK9 間接調(diào)控VLDLR 有關(guān)。鑒于前期化痰祛瘀法抗AS 的研究基礎(chǔ)［3］，本研究旨在進(jìn)一步觀察化痰祛瘀法抗AS 的作用機(jī)制是否與靶向調(diào)控miR－17－5p、靶向調(diào)控VLDLR或靶向調(diào)控PCSK9 間接調(diào)控VLDLR，抑制血管炎性反應(yīng)有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

ApoE-/-小鼠60只，SPF級(jí)，8周齡，體質(zhì)量（20±2）g，雄性，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2016－0006；C57BL/6 小鼠15 只，體質(zhì)量（20±2）g，雄性，購自南京大學(xué)－南京生物研究所，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（蘇）2015－0001；SD 大鼠60只，體質(zhì)量（300±20）g，雄性，購自鄭州市惠濟(jì)區(qū)華興實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（豫）2019－0002。所有動(dòng)物飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，試驗(yàn)單位使用動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（豫）2016－0009；飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（22±1）℃，濕度為60%～75%，12 h循環(huán)照明，動(dòng)物自由攝食、飲水。人血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）購自上海滬震生物科技有限公司。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審核通過，符合安全性和公平性原則，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物符合國家對(duì)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的有關(guān)要求［4］，倫理審核批準(zhǔn)標(biāo)號(hào)：20190622。

1.2 藥物與試劑

本研究所用化痰祛瘀法藥物為血管軟化丸（組方：黃芪30 g，山楂20 g，萊菔子15 g，丹參、三七、陳皮各12 g，清半夏10 g，甘草6 g）。按照“人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比率表”換算低、高2 個(gè)劑量分別為21.6、86.4 g/kg，分別相當(dāng)于60 kg 成人臨床用量等效劑量的5.8、23.3 倍，醫(yī)院煎藥房按照要求制備生藥含量分別為0.864、3.456 g/mL的水煎液。

PCR 試劑盒（TaKaRa 公司，批號(hào)：A8203－6）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天公司，批號(hào)：P0029）；VLDLR 抗體（英國Abcam 公司，批號(hào)：ab203271）；PCSK9 抗體（Bioss 公司，批號(hào)：bs－6060R）；脂質(zhì)體2000 轉(zhuǎn)染試劑盒（美國Invitrogen 公司，批號(hào)：1734976）；微小RNA－17－5p 抑制物（廣州銳博生物科技有限公司合成）；其他化學(xué)試劑均由河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.3 動(dòng)物造模與分組給藥

所有小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。C57BL/6 小鼠給予全程普通飼料喂養(yǎng)，作為對(duì)照組；ApoE?/?小鼠隨機(jī)分為模型組、miR-17-5p inhibitor 組、化痰祛瘀法高劑量組（高劑量組）和化痰祛瘀法低劑量組（低劑量組）4 組，每組15 只，全程均給予高脂飼料（含脂肪21%、膽固醇0.15%）喂養(yǎng)。飼養(yǎng)8 周后每組隨機(jī)抽取1 只小鼠，檢視其主動(dòng)脈壁可見明顯的斑塊形成則視為造模成功，造模成功后開始進(jìn)行干預(yù)，連續(xù)干預(yù)8 周后取材進(jìn)行檢測。

對(duì)照組C57BL/6 小鼠給予尾靜脈注射生理鹽水處理；模型組ApoE-/-小鼠給予尾靜脈注射生理鹽水處理；miR－17－5p inhibitor組ApoE-/-小鼠給予尾靜脈注射miR－17－5p 抑制劑，劑量為30 mg/（kg·d），每周1 次；高劑量組ApoE-/-小鼠采用中藥灌胃，劑量為86.4 g/（kg·d），每日1 次；低劑量組ApoE-/-小鼠采用中藥灌胃，劑量為21.6 g/（kg·d），每日1次。

1.4 標(biāo)本采集和病理形態(tài)學(xué)觀察

藥物干預(yù)8 周后，頸椎脫臼法處死小鼠，沿主動(dòng)脈瓣至髂動(dòng)脈分支處剝離全長主動(dòng)脈。選取近主動(dòng)脈瓣附近主動(dòng)脈壁，一部分固定于4%甲醛溶液中，用于HE 染色；一部分置于?80 ℃冰箱凍存，用于分子生物學(xué)等檢測。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 ELISA 法測定外周血清中IL－6、IL－10 和TNF－α等炎癥因子水平

采集小鼠血漿，嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說明的操作方法檢測血清中TNF－α、IL－6 和IL－10水平。

1.5.2 RT－PCR 法檢測主動(dòng)脈miR－17－5p、VLDLR和PCSK9基因表達(dá)水平

將小鼠主動(dòng)脈組織稱取質(zhì)量后，加入適量的Trizol，提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄，采用SYBR Green 進(jìn)行qRTPCR 反應(yīng)。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃30 s，1 個(gè)循環(huán)；95 ℃5 s，55 ℃10 s，40個(gè)循環(huán)［4］。樣本中目的基因的計(jì)算方法為2－ΔΔCT，GAPDH為內(nèi)參。引物序列：miR－17－5p正向引物為5′－CCAGCCAAAGTGCTTACAGTGC－3′，反向引物為5′－GTGCAGGGTCCGAGGTATTC－3′；VLDLR正向引物為5′－CCCGTTCTACTCAGTGTATCCC－3′，反向引物為5′－CTGCCATCGTCACAGTCATCC－3′；PCSK9正向引物為5′－GCGTCGTGGTGATTGGATTG－3′，反向引物為5′－CAGGGGTGTTGTGGATGCT－3′；GAPDH正向引物為5′－AGTGTGACGATTAATCGCAAG－3′，反向引物為5′－ATCCACATCTCTCGTTGTGGC－3′。

1.5.3 Western Blot 法檢測細(xì)胞中VLDLR 和PCSK9蛋白的表達(dá)

將主動(dòng)脈稱量后，提取蛋白，采用BCA 蛋白定量法，蛋白電泳，分離，轉(zhuǎn)膜，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，用相應(yīng)的一抗（VLDLR 和PCSK9）分別按照1∶200和1∶500孵育，4 ℃過夜，洗滌后標(biāo)記二抗（滴度1∶200）雜交。采用化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測，使用Image Lab 4.1圖像分析軟件檢測VLDLR 和PCSK9 印跡條帶凈吸光度值，以β－actin 為內(nèi)參照，結(jié)果以樣本灰度值/內(nèi)參照灰度值表示［4］。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)采用LSD法檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Tamhanés 法檢驗(yàn)，P< 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

動(dòng)物造模鑒定時(shí)每組各處死1 只，飼養(yǎng)和給藥過程中各組小鼠因發(fā)生撕咬致死5 只，因灌胃致死2 只，由于個(gè)別數(shù)據(jù)明顯偏離樣本主體，采用偏度-峰度檢驗(yàn)法判斷離群值后剔除3 只，各組小鼠進(jìn)入統(tǒng)計(jì)的數(shù)量均為10只。

2.2 各組小鼠主動(dòng)脈病理形態(tài)觀察

經(jīng)HE 染色后，光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠主動(dòng)脈管徑厚薄不均勻，內(nèi)膜不光滑，管腔內(nèi)可見明顯的條狀或片狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成，斑塊內(nèi)可見淺染無定形物和鈣化顆粒物，部分動(dòng)脈粥樣硬化斑塊截面積大于主動(dòng)脈截面積。miR－17－5p inhibitor組、高劑量組、低劑量組小鼠主動(dòng)脈管徑厚薄雖然不均勻，但主動(dòng)脈各層結(jié)構(gòu)清晰，血管細(xì)胞排列較整齊，AS 病變程度明顯輕于模型組。結(jié)果見圖1。

圖1 各組小鼠主動(dòng)脈病理形態(tài)影響觀察（HE染色，×200）

2.3 各組小鼠外周血IL－6、IL－10 和TNF－α 水平比較

與對(duì)照組相比，模型組小鼠外周血清IL－6、IL－10 和TNF－α 水平均明顯較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）；與模型組相比，miR－17－5p inhibitor組、高劑量組、低劑量組小鼠外周血清中IL－6、IL－10和TNF－α 水平均明顯降低（P< 0.05），高劑量組、低劑量組小鼠之間各項(xiàng)血清指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05）。這表明miR－17－5p 與TNF－α、IL－6、IL－10 水平呈正相關(guān)，化痰祛瘀法能夠通過調(diào)控miR－17－5p 影響外周血清中IL－6、IL－10 和TNFα等血管炎癥因子水平。結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠外周血IL－6、IL－10和TNF－α水平比較（±s，n=10，pg/mL）

表1 各組小鼠外周血IL－6、IL－10和TNF－α水平比較（±s，n=10，pg/mL）

注：與對(duì)照組比較，△P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

組別對(duì)照組模型組miR－17－5p inhibitor組高劑量組低劑量組TNF－α 10.14±1.84 33.47±4.61△18.19±7.15*19.26±2.59*19.89±1.78*IL－6 20.14±4.53 65.47±9.36△48.47±6.32*51.26±12.27*52.89±7.15*IL－10 165.50±28.24 392.14±31.21△191.25±26.15*231.98±34.67*235.01±36.83*

2.4 各組小鼠主動(dòng)脈miR－17－5p、VLDLR 和PCSK9 mRNA表達(dá)水平比較

與對(duì)照組相比，模型組小鼠主動(dòng)脈miR－17－5p和VLDLR mRNA 表達(dá)水平均明顯較高（P< 0.05），PCSK9 mRNA 表達(dá)水平明顯較低（P<0.05）。與模型組相比，miR－17－5p inhibitor組、高劑量組、低劑量組小鼠主動(dòng)脈miR－17－5p 和VLDLR mRNA 表達(dá)均明顯下調(diào)（P< 0.05），PCSK9 mRNA 表達(dá)水平明顯上調(diào)（P< 0.05）；高劑量組、低劑量組小鼠之間miR－17－5p、VLDLR 和PCSK9 mRNA 表達(dá)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組小鼠主動(dòng)脈miR－17－5p、VLDLR和PCSK9 mRNA表達(dá)水平比較（±s，n=10）

表2 各組小鼠主動(dòng)脈miR－17－5p、VLDLR和PCSK9 mRNA表達(dá)水平比較（±s，n=10）

注：與對(duì)照組比較，△P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

組別對(duì)照組模型組miR－17－5p inhibitor組高劑量組低劑量組PCSK9 1.57±0.21 0.27±0.06△1.36±0.32*0.84±0.19*0.83±0.15*miR－17－5p 1.05±0.11 2.05±0.16△0.86±0.19*1.48±0.54*1.50±0.61*VLDLR 1.12±0.19 2.14±0.28△0.94±0.33*1.54±0.24*1.61±0.28*

2.5 各組小鼠主動(dòng)脈VLDLR 和PCSK9的蛋白表達(dá)水平比較

與對(duì)照組相比，模型組小鼠主動(dòng)脈VLDLR 蛋白表達(dá)明顯升高（P< 0.05），小鼠主動(dòng)脈PCSK9 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P< 0.05）。與模型組相比，miR－17－5p inhibitor 組、高劑量組、低劑量組小鼠主動(dòng)脈VLDLR 蛋白表達(dá)均明顯降低（P< 0.05），主動(dòng)脈PCSK9 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（P< 0.05）；高劑量組、低劑量組小鼠之間VLDLR 和PCSK9 表達(dá)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05）。結(jié)果見表3和圖2。

表3 各組小鼠主動(dòng)脈VLDLR和PCSK9的蛋白表達(dá)水平比較（±s，n=10）

表3 各組小鼠主動(dòng)脈VLDLR和PCSK9的蛋白表達(dá)水平比較（±s，n=10）

注：與對(duì)照組比較，△P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

組別對(duì)照組模型組miR－17－5p inhibitor組高劑量組低劑量組PCSK9 1.13±0.18 1.06±0.17△2.32±0.45*1.84±0.26*1.77±0.33*VLDLR 1.06±0.12 2.14±0.24△0.95±0.36*1.53±0.26*1.63±0.26*

圖2 各組VSMC中VLDLR和PCSK9蛋白表達(dá)情況

3 討論

miRNA 在疾病診斷和治療中發(fā)揮了重要的作用，研究者發(fā)現(xiàn)miR－17－5p 參與了AS 的發(fā)生發(fā)展過程［5］。有研究發(fā)現(xiàn)，低密度脂蛋白受體（LDLR）通過結(jié)合并內(nèi)吞LDL 調(diào)節(jié)膽固醇代謝。VLDLR 主要分布在心肌、骨骼肌以及脂肪組織中，參與脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)，病理?xiàng)l件下，能夠促進(jìn)甘油三酯在細(xì)胞中的沉積，影響泡沫細(xì)胞的形成，導(dǎo)致AS 的發(fā)生、發(fā)展［6］。研究發(fā)現(xiàn)，在粥樣斑塊存在下，通過高表達(dá)VLDLR，結(jié)合低脂飲食，能夠降低血漿中VLDL及低密度脂蛋白（LDL）水平，促進(jìn)AS斑塊消退［7］。

研究發(fā)現(xiàn)，PCSK9 表達(dá)于多種細(xì)胞，通過影響VLDLR 的表達(dá)［8］，可增強(qiáng)肝臟LDLR 的溶酶體和內(nèi)涵體降解，提高血清LDL－C水平［9］。有研究者通過轉(zhuǎn)染PCSK9 進(jìn)入VSMC，發(fā)現(xiàn)降低了VSMC 細(xì)胞VLDLR 水平［10］。新近研究發(fā)現(xiàn)，AS 發(fā)病與miR－17－5p 表達(dá)呈正相關(guān)，與VLDLR 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；miR－17－5p 能夠通過靶向調(diào)控VLDLR，直接抑制VSMC 細(xì)胞VLDLR表達(dá)，miR－17－5p 通過影響PCSK9 參與負(fù)調(diào)控VLDLR的表達(dá)，抑制AS的發(fā)生發(fā)展［3］。

高脂血癥可歸屬于“血濁”范疇，血濁可致痰、瘀、毒等病理產(chǎn)物產(chǎn)生，壅塞脈道，沉積管壁，形成AS。本課題組結(jié)合中醫(yī)基礎(chǔ)理論和臨床實(shí)踐，確定痰阻血瘀是AS 的主要證型。本研究所用化痰祛瘀法的藥物為中成藥血管軟化丸，該方中山楂消食導(dǎo)滯，為君藥；黃芪補(bǔ)氣健脾，半夏健脾燥濕化痰，三七和丹參活血化瘀，共為臣藥；萊菔子下氣消食除脹，陳皮理氣和中，共為佐藥；甘草健脾和中，調(diào)和諸藥，為使藥。諸藥合用，共奏消積化痰、活血化瘀之功［11］。

本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，化痰祛瘀法能夠降低血清炎性反應(yīng)，調(diào)節(jié)血脂，抑制AS斑塊發(fā)展［12－13］。此外，化痰祛瘀法抗AS 作用機(jī)制可能與介導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化效應(yīng)，調(diào)控miRNA－467b 靶向LPL 調(diào)控巨噬細(xì)胞，減少炎癥因子分泌和巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積有關(guān)［14－16］?；奠铕龇軌蛲ㄟ^調(diào)控miRNA－126，影響其下游GRS16、CXCL12、CXCR4、VCAM－1 等細(xì)胞炎性因子表達(dá)，參與VEC 損傷與修復(fù)，抑制AS 發(fā)生發(fā)展［3］。新近研究發(fā)現(xiàn)，化痰祛瘀法能夠通過靶向調(diào)控miR－181影響輸入蛋白α3/NF－κB 信號(hào)通路，降低炎性因子水平，減輕血管內(nèi)皮損傷，抑制AS發(fā)生發(fā)展［4］。

鑒于miRNA－17－5p能夠通過抑制血管平滑肌細(xì)胞VLDLR表達(dá)，影響AS的發(fā)生發(fā)展［2］，本研究旨在通過化痰祛瘀法抗AS 的作用機(jī)制是否與靶向調(diào)控miR－17－5p，靶向調(diào)控VLDLR 或靶向調(diào)控PCSK9間接調(diào)控VLDLR，抑制血管炎性反應(yīng)，進(jìn)而揭示化痰祛瘀法防治AS的分子機(jī)制。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過化痰祛瘀法干預(yù)后，miR－17－5p inhibitor 組、高劑量組、低劑量組小鼠外周血清中IL－6、IL－10 和TNF－α 水平明顯下調(diào)，主動(dòng)脈中miR－17－5p 和VLDLR mRNA 表達(dá)水平均明顯降低，PCSK9 mRNA 表達(dá)水平明顯升高?；奠铕龇ú煌瑒┝拷M之間各項(xiàng)指標(biāo)比較差異不明顯，不存在量效差異。病理學(xué)檢測也證實(shí)，化痰祛瘀法和miR－17－5p inhibitor 均能夠抑制AS 的發(fā)生發(fā)展?？梢?，化痰祛瘀法抗AS 的作用機(jī)制可能與靶向調(diào)控microRNA－17－5p，靶向調(diào)控VLDLR 或靶向調(diào)控PCSK9 間接調(diào)控VLDLR，抑制血管炎性反應(yīng)，減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷有關(guān)。