田芯瑗，惠玲，鄭雷，張釧，郝勝菊，周秉博，陳雪，王連

人類正常體細胞中含有46（2n）條染色體，而三倍體是指患者的體細胞具有3個染色體組，比正常二倍體多了一套完整的單倍體染色體，有3條性染色體，染色體總數(shù)為69（3n）條，是胚胎期常見的一種胎兒染色體異常疾病[1]，其發(fā)生機制主要有雙雄受精和雙雌受精。三倍體是導致自然流產(chǎn)的常見因素，大多數(shù)純合子三倍體在妊娠5個月內(nèi)自然流產(chǎn)或者胎死宮內(nèi)[2]，偶有持續(xù)妊娠并分娩出畸形兒者，但伴有嚴重的胎兒生長受限，出生后僅能存活數(shù)分鐘至數(shù)天[1]。一般來說，二倍體/三倍體嵌合體的存活時間相對較長。強化對三倍體的了解和認識，加強產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷的力度，對于降低出生缺陷發(fā)生率和指導優(yōu)生優(yōu)育具有重要意義。

1 病例報告

患者 女，24歲，因妊娠18周時行無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測（non-invasive prenatal testing，NIPT）提示性染色體非整倍體高風險，于2021年3月30日妊娠21周時就診于我院?；颊咴?產(chǎn)0，胚胎停育1次，生化妊娠1次，否認近親婚配，無家族遺傳史，于外院行血清學產(chǎn)前篩查，檢測結(jié)果為人絨毛膜促性腺激素β亞單位（β-human chorionic gonadotrophin，β-hCG）和甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）水平均較低，提示胎兒存在18-三體綜合征高風險（風險值為1/152）。四維彩色超聲檢查示：胎兒法洛四聯(lián)癥，有先天性心臟?。òㄊ议g隔缺損型肺動脈閉鎖，主動脈騎跨，迷走右鎖骨下動脈，二、三尖瓣反向血流）；小下頜畸形、鼻骨鈣化不良；永久性右臍靜脈、單臍動脈；各生長徑線均低于同期孕周，有胸腔積液。妊娠18周至我院行NIPT結(jié)果提示性染色體非整倍體高風險，患者經(jīng)產(chǎn)前咨詢并簽署知情同意書后，于妊娠21周時行羊水穿刺進行產(chǎn)前診斷。

抽取患者30 mL羊水后平均分成3份，分別用于低深度高通量全基因組拷貝數(shù)變異測序（copy number variation sequencing，CNV-seq）檢測、羊水細胞染色體核型分析及短串聯(lián)重復序列（short tandem repeat，STR）片段分析。行CNVseq檢測時，先提取羊水基因組DNA，然后構(gòu)建文庫，并使用Next Seq CN500高通量測序平臺進行CNV-seq檢測和測序分析，結(jié)果示未檢出基因組拷貝數(shù)變異，見圖1。將羊水經(jīng)2 000 r/min離心10 min后棄上清，取沉淀細胞分別接種到2瓶羊水細胞培養(yǎng)基中，置于含5%CO2的37 ℃溫箱內(nèi)行開放式培養(yǎng)，持續(xù)培養(yǎng)7 d后加入秋水仙素終止有絲分裂，通過胰酶消化、染色體收獲、制片和G顯帶等步驟實現(xiàn)胎兒染色體核型分析。根據(jù)2016 版《人類細胞遺傳學命名國際體制》（International System for Human Cytogenetic Nomenclature，ISCN）對檢出的染色體核型異常進行準確命名。胎兒羊水細胞染色體核型為69,XXX，表明胎兒是三倍體患者，見圖2。

圖2 胎兒羊水染色體核型69,XXX

采集2管孕婦外周血于肝素抗凝管內(nèi)用于外周血染色體核型分析，結(jié)果示孕婦染色體核型正常。乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗凝管提取基因組DNA后與羊水沉淀細胞一起進行STR 片段分析，配制MicroreaderTM21 Direct ID System標準擴增體系，采用5色熒光標記，經(jīng)過聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增后，使用ABI 3500 DX基因測序儀行電泳檢測，對孕婦和胎兒基因組中的20個STR基因座和1個性別位點進行基因分型，掃描圖譜顯示胎兒是三倍體患者，羊水樣本未見母源污染，其中1套完整的單倍體染色體組遺傳自父親，有2套染色體組源于母親，說明該三倍體胎兒的致病原因是雙雌受精，詳細的等位基因分型結(jié)果見表1。

表1 孕婦和胎兒基因組中20個STR基因座和1個性別位點的等位基因分型結(jié)果

2 討論

2.1 三倍體的超聲特征三倍體是妊娠早期自然流產(chǎn)最重要的遺傳學病因，占8%～18%[1，3]。胎兒因多出1套完整的單倍體染色體而在妊娠中期的超聲檢查中表現(xiàn)出多器官畸形[4]，以肢體畸形最為多見，特征性的表現(xiàn)包括大胎盤樣葡萄樣變，第三、四并指畸形。能夠存活的患兒通常表現(xiàn)為嚴重的胎兒生長受限，頭圍和腹圍不成比例，腹圍極小，顱頂發(fā)育不良；眼距寬，小眼睛，鼻梁低，耳位低且畸形；小下頜，唇腭裂；通貫掌，特征性馬蹄內(nèi)翻足；先天性心臟?。荒行阅虻老铝?，陰莖過小和隱睪等。其中，第三、四并指畸形被認為是三倍體胎兒最具特征性的表現(xiàn)[5]。據(jù)Sneddon等[6]報道，二倍體/三倍體嵌合體具有發(fā)育遲緩、智力障礙、肌無力和手指畸形等與純合子三倍體相似的特征，但沒有生殖器異常。本例患者四維彩色超聲示胎兒法洛四聯(lián)癥，有先天性心臟?。òㄊ议g隔缺損型肺動脈閉鎖，主動脈騎跨，迷走右鎖骨下動脈，二、三尖瓣反向血流）；小下頜畸形、鼻骨鈣化不良；永久性右臍靜脈、單臍動脈；各生長徑線均低于同期孕周，有胸腔積液。這些表現(xiàn)基本符合三倍體患兒主要的超聲指標，沒有發(fā)現(xiàn)特征性的第三、四并指畸形可能是由于胎兒宮內(nèi)活動受限、體位不正，導致超聲觀察困難所致。

2.2 三倍體的發(fā)生機制三倍體是一種嚴重的染色體數(shù)目異常疾病，染色體核型有3種類型：69,XXY（60%）、69,XXX（37%）和69,XYY（3%）[7]。最主要的發(fā)生機制是雙雄受精，即由1個單倍體卵子和1個正在復制的精子或2個精子受精形成，染色體核型為3種類型之一，但實際上雙雄受精更容易在妊娠早期發(fā)生流產(chǎn)，不易成活；部分三倍體妊娠是由于雙雌受精，染色體核型為69,XXX或69,XXY；還有極少數(shù)三倍體是因胚胎細胞內(nèi)復制異常所致。本例患者的三倍體胎兒染色體核型為69,XXX，致病原因是雙雌受精，即卵母細胞在第一次或第二次減數(shù)分裂時發(fā)生錯誤，同源染色體或姐妹染色單體沒有分離，無法形成第一或第二極體，使得卵細胞成為1個異常的二倍體卵子，與1個正常的精子受精后生成1個三倍體合子。一項關(guān)于三倍體發(fā)生原因的研究發(fā)現(xiàn)，22%的三倍體是由于減數(shù)分裂Ⅰ期失敗，67%是由于減數(shù)分裂Ⅱ期失敗，11%是由于融合卵子所致[8]。

本研究在對胎兒基因組20個STR基因座和1個性別位點的等位基因分型時發(fā)現(xiàn)，羊水樣本未見母源污染，每個基因座上的等位基因有1、2或3個，峰高比分別為1、1/2或1/1/1，并且每個基因座上均有2個等位基因與孕婦的等位基因一致，這表明胎兒有3套完整的染色體組，即三倍體，并且有2套染色體組均遺傳自母方，故三倍體的致病機制是雙雌受精。雖然患者抽取羊水后同時進行了CNV-seq檢測，但由于CNV-seq技術(shù)存在局限性，只能檢測出24條染色體的非整倍性變異和致病性CNV，所以無法確診三倍體。Keinath等[9]利用STR標記和染色體單核苷酸多態(tài)性（SNP）微陣列數(shù)據(jù)對異卵三倍體雙胞胎作出診斷，并闡明發(fā)病原因是次級卵母細胞減數(shù)分裂Ⅱ期發(fā)生錯誤或第二極體沒有分離，該文獻是首例報道的三倍體雙胞胎妊娠。

2.3 三倍體的產(chǎn)前診斷技術(shù)三倍體胎兒常在妊娠早期自然流產(chǎn)，無法足月分娩，或者新生兒僅能存活短短數(shù)分鐘，死亡率高，因此盡早確診意義重大，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)立即建議終止妊娠，減少孕婦的身心傷害。妊娠早期或中期進行血清學產(chǎn)前篩查可發(fā)現(xiàn)一定異常，本例患者進行妊娠中期血清學產(chǎn)前篩查時發(fā)現(xiàn)β-hCG和AFP水平均較低，可能與胎盤功能低下和胎兒生長受限有關(guān)。但血清學篩查僅是產(chǎn)前篩查的技術(shù)手段，其結(jié)果提示異常并不能支持三倍體的診斷。隨著二代測序技術(shù)的快速發(fā)展，NIPT和CNV-seq能夠更加準確地檢測染色體非整倍體異常，但不能檢測出三倍體，若結(jié)果陰性但在四維彩色超聲檢查中發(fā)現(xiàn)胎兒宮內(nèi)發(fā)育異常，應建議孕婦進行遺傳咨詢，并完成細胞遺傳學檢查。截至目前，羊水胎兒染色體核型分析仍舊是確診三倍體胎兒的“金標準”。STR位點在人類基因組中分布廣泛，片段短，在個體發(fā)育早期就能被檢測出，分型結(jié)果穩(wěn)定可靠，具有高敏感度和可重復性。以孕婦外周血DNA作為母源性DNA對照，應用20個特異性的STR基因座和1個性別位點，可對三倍體胎兒作出診斷并明確其致病機制。

綜上所述，遺傳咨詢醫(yī)師應該熟悉三倍體的發(fā)生機制、臨床特征和遺傳學特點，了解三倍體產(chǎn)前診斷的技術(shù)手段。若在超聲檢查中發(fā)現(xiàn)胎兒存在多器官畸形、嚴重生長受限和先天性心臟病等特征性表現(xiàn)，可以應用羊水胎兒染色體核型分析這個“金標準”產(chǎn)前診斷三倍體，同時應用STR片段分析技術(shù)可以分析出三倍體的發(fā)生機制，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)立即建議孕婦終止妊娠，以降低缺陷兒的出生率，促進優(yōu)生、優(yōu)育，提高人口質(zhì)量。