鐘 文，李 鈾，2，韓 晨，謝 慧，陳偉基*

（1．西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730030；2．西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心甘肅省動物細胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅蘭州730030）

麻蜥亞屬（Eremias）是為區(qū)分蜥蜴亞屬（Lacerta）而建立的，在指定敏麻蜥（Eremias arguta）為麻蜥屬的模式種后，亞屬被提升為屬，并入Eremiae科[1]。全世界有麻蜥50余種，廣泛分布于亞洲、歐洲、非洲的溫帶和暖溫帶[2]。趙爾宓等[3]在2000年校正過中國兩棲綱（Amphibian）和爬行綱（Reptilia）動物名錄，認為國內(nèi)麻蜥有9種，主要分布于東北、西北和華北。密點麻蜥（Eremias multiocellata）是我國荒漠草原和半荒漠草原最常見的卵胎生蜥蜴，在生態(tài)系統(tǒng)中屬于消費者，保證能量遵循食物鏈和食物網(wǎng)逐級流動，在荒漠化草原生態(tài)系統(tǒng)中起著舉足輕重的作用[4]。因此，對密點麻蜥群體進行系統(tǒng)進化分析，對后續(xù)合理利用及種質(zhì)資源保護工作有重要意義。

遺傳多樣性是生物進化和適應(yīng)環(huán)境的基礎(chǔ)，種群遺傳多樣性的缺乏對該物種的生存是巨大的威脅[5]。線粒體DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）是動物細胞唯一一種核外遺傳物質(zhì)，因分子量小、進化速率快、無重組、母系遺傳等特性，是研究親緣物種遺傳關(guān)系及起源進化的理想分子標記[6]。線粒體基因組中共有37基因，有13個蛋白編碼基因，其中細胞色素b基因（Cytochrome b，Cytb）因結(jié)構(gòu)和功能較為清楚，所以被廣泛應(yīng)用于物種鑒定、分子進化、系統(tǒng)地理學(xué)和遺傳結(jié)構(gòu)研究[5,7]。近年來對密點麻蜥的研究越來越多，如食性[8]、環(huán)境[9-10]、兩性異型及繁殖[1]、分子方面[11-12]等，但在Cytb基因上對于密點麻蜥的研究不多。因此，本研究利用Cytb基因，對密點麻蜥進行系統(tǒng)發(fā)育分析，并探討與國內(nèi)的幾種麻蜥的遺傳關(guān)系，補充和豐富新疆地區(qū)密點麻蜥的基礎(chǔ)遺傳數(shù)據(jù)，為保護該地區(qū)內(nèi)其他物種提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本研究的密點麻蜥樣品采自新疆維吾爾自治區(qū)南部的5個地區(qū)，具體樣品信息及從Genbank上獲取的樣品序列號見表1。

表1 樣品信息及Genbank序列號Tab.1 Sample information and GenBank serial number

1.2 基因組DNA提取

使用通用型基因組DNA提取試劑盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）進行基因組DNA的提取，并放置于-20℃冰柜保存，備用。

1.3 引物設(shè)計與PCR擴增

根據(jù)Genbank公布的密點麻蜥線粒體DNA全序列（序列號為KM257724.1），使用軟件Primer Premier 5.0[13]進行引物設(shè)計，上游引物：CytbF（5'-ACATACGAAAA CAACATCCAATCT-3'），下游引物：CytbR（5'-TTATTTTCTAGGGTGGCGGCT-3'）。引物由寶生物工程（大連）公司合成。

使用設(shè)計的引物對本次密點麻蜥樣本進行線粒體Cytb基因的擴增。通過試驗，建立的最佳PCR擴增體系（25μL）：2×Pro Taq Master Mix（dye plus）12.5μL、5μmol/L上下游引物0.5μL、密點麻蜥基因組DNA 2μL、ddH2O 9.5μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸1 min，共循環(huán)35次；72℃延伸10 min，4℃保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.4%瓊脂糖凝膠電泳進行純度檢測。檢測合格的擴增產(chǎn)物由蘭州天啟基因生物科技有限公司進行測序。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Geneious 2020.2.5（http://www.geneious.com）處理測序結(jié)果原始ABI文件，經(jīng)過人工校對后獲得18條密點麻蜥Cytb基因樣本序列。下載Genbank上已發(fā)表的38條中國麻蜥[荒漠麻蜥（Eremias przewalskii）、天山麻蜥（Eremias stummeri）、麗斑麻蜥（Eremias argus）、蟲紋麻蜥（Eremias vermiculata）、快步麻蜥（Eremias velox）、山地麻蜥（Eremias brenchleyi）]序列及2條南疆沙蜥序列作為外群的物種序列，見表2。

表2 物種名稱及Genbank序列號Tab.2 Species name and GenBank serial number

續(xù)表2 物種名稱及Genbank序列號Tab.2 Species name and GenBank serial number

將所得密點麻蜥Cytb基因序列與下載的40條蜥蜴序列用MEGA-X[14]進行對比，然后采用鄰接和最大似然法分別構(gòu)建系統(tǒng)進化樹進行系統(tǒng)發(fā)育分析。NJ法與ML法構(gòu)建的進化樹Bootstrap置信值均為重復(fù)抽樣1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cytb基因測序結(jié)果

各個樣品最終序列均在1 000～1 200 bp之間，測序結(jié)果經(jīng)軟件Geneious 2020.2.5拼接并人工校對后獲得Cytb基因，長度為989 bp。

2.2 Cytb基因密點麻蜥的系統(tǒng)發(fā)育分析（見圖1、圖2）

圖1 NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Neighbor-joining phylogenetic tree

圖2 ML系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Maximum Likelihood phylogenetic tree

利用MEGA-X軟件，應(yīng)用鄰接法（NJ）構(gòu)建了密點麻蜥與其他麻蜥Cytb基因的NJ進化樹，進化樹Bootstrap置信值為重復(fù)抽樣1 000次。

由圖1可知，從種群間看，5個地區(qū)18個密點麻蜥樣本均在同一分支，每個地區(qū)樣本幾乎均是獨立分支，喀什地區(qū)的密點麻蜥與同市葉城和塔什庫爾干的密點麻蜥親緣關(guān)系最近，但喀什地區(qū)的M13稍有偏離，與烏恰的密點麻蜥屬于同一分支。從品種間看，密點麻蜥與其余6種麻蜥在同一分支上，其中與荒漠麻蜥的親緣關(guān)系最近，天山麻蜥次之，親緣關(guān)系最遠的是山地麻蜥。南疆沙蜥作為外群，獨立于另一分支上。

圖2是基于Cytb基因運用MEGA-X軟件中的MODELS功能，通過計算找到此次最大似然法構(gòu)建進化樹的最佳模型為Hasegawa-Kishino-Yano，而構(gòu)建成的ML進化樹，該進化樹Bootstrap置信值為重復(fù)抽樣1 000次。

由圖2可知，結(jié)果與NJ進化樹的結(jié)果基本一致，南疆沙蜥獨立于1個分支，所有麻蜥在1個分支上，其中與山地麻蜥的親緣關(guān)系最遠，荒漠麻蜥的親緣關(guān)系最近。密點麻蜥種群間每個地區(qū)樣本幾乎都是獨立分支，喀什地區(qū)的密點麻蜥與民豐的密點麻蜥親緣關(guān)系最遠，烏恰次之，與同市葉城和塔什庫爾干的密點麻蜥親緣關(guān)系最近。但是，喀什地區(qū)的M13稍有偏離，與烏恰的密點麻蜥屬于同一分支。

3 討論

遺傳多樣性是物種長期進化或群體持續(xù)生存并適應(yīng)不斷變化環(huán)境而進化的結(jié)果，物種遺傳多樣性或變異性越豐富，表明物種的進化潛力越大，對環(huán)境改變適應(yīng)的進化能力越強[15]。研究物種遺傳多樣性對于評估物種資源狀況，制定野生物種資源保護策略等方面具有重要意義[5]。線粒體Cytb基因具有較高的進化速率，是研究種間遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的主要分子標記之一。

本研究基于Cytb基因采用鄰接法（NJ）和最大似然法（ML）構(gòu)建的兩種進化樹結(jié)果幾乎一致，通過分析可知，首先，在密點麻蜥種群中，5個地區(qū)共計18個樣本均在1個分支上，喀什地區(qū)的密點麻蜥與同市的葉城和塔什庫爾干的密點麻蜥親緣關(guān)系最近，烏恰親緣關(guān)系次之，與民豐地區(qū)的親緣關(guān)系最遠。每個地區(qū)的樣本幾乎單獨在1個小分支上，但是喀什地區(qū)的M13樣本被分到烏恰地區(qū)的分支上，表明這兩個地區(qū)的密點麻蜥可能存在基因交流。第二，從品種間看，密點麻蜥與所有麻蜥在1個大分支上，其中與密點麻蜥親緣關(guān)系最遠的是山地麻蜥，而后依次為快步麻蜥、蟲紋麻蜥、麗斑麻蜥和天山麻蜥，荒漠麻蜥則是與其親緣關(guān)系最近的品種。本研究與前人的研究結(jié)果相似，以往研究表明，雖然兩種蜥蜴的形態(tài)學(xué)差異很大，但密點麻蜥與荒漠麻蜥的遺傳距離很小，甚至低于亞種水平[2,12]。南疆沙蜥區(qū)別于所有麻蜥，單獨占據(jù)1個大分支，雖然其與密點麻蜥不同屬，遺傳距離也最遠，但其之間是否存在基因交流的個例無法確定，有待進一步研究。

4 結(jié)論

本研究對新疆南部5個地區(qū)密點麻蜥的線粒體基因Cytb進行擴增測序，基于Cytb基因與中國6種麻蜥和南疆沙蜥構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，發(fā)現(xiàn)密點麻蜥種群間存在基因交流，密點麻蜥和荒漠麻蜥間可能存在基因流動，即可能存在雜交現(xiàn)象，但目前的數(shù)據(jù)無法證明這一點。本研究補充和豐富了新疆部分地區(qū)密點麻蜥的基礎(chǔ)遺傳數(shù)據(jù)，為后續(xù)合理利用及保護該地區(qū)內(nèi)其他物種的種質(zhì)資源奠定基礎(chǔ)。