張艷麗，劉在瓊，朱振宇，王紅斌，龐鵬飛，楊文榮

(1.云南民族大學(xué) 生物基材料綠色制備技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，云南 昆明 650500；2.迪肯大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，澳大利亞 吉朗 3217)

洋薊素(Cynarin, 1,3-二咖啡酰奎寧酸)，也稱為洋薊酸、朝鮮薊酸、朝薊素、菜薊素等，廣泛存在于菊科植物朝鮮薊(CynarascolymusL.)和林蔭千里光(SenecionemorensisL.)全草中，也可化學(xué)合成.因其具有抗氧化、抗菌、抗自由基、抗膽堿能、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗HIV、抗癌、利膽保肝和降低膽固醇等多種潛在藥理活性而受到廣泛關(guān)注[1-6].由于洋薊素較高的藥用價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，開發(fā)快速、簡(jiǎn)便、可靠、靈敏的檢測(cè)洋薊素的方法具有重要的意義.目前已有一些相關(guān)的分析技術(shù)用于洋薊素的檢測(cè)，如高效液相色譜法(HPLC)[7-11].然而，該技術(shù)易受常見干擾物的影響，儀器價(jià)格昂貴，需要使用有毒的有機(jī)試劑，并且較低的靈敏度限制了其實(shí)際應(yīng)用.電化學(xué)傳感器具有儀器設(shè)備和操作簡(jiǎn)單，響應(yīng)速度快，重現(xiàn)性好和靈敏度高等特點(diǎn)，已成為一種可替代的分析方法而受到廣泛關(guān)注[12-15].

石墨烯(Graphene)是一種由sp2雜化碳原子組成的二維(2D)單層薄膜材料，具有緊密排列的六角形晶格結(jié)構(gòu)[16-17].石墨烯作為一種新興的碳納米材料，由于其獨(dú)特的物理和電化學(xué)性質(zhì)，在電化學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用.石墨烯是一種零帶隙的半導(dǎo)體，表現(xiàn)出明顯的雙極電場(chǎng)效應(yīng)，具有較大的比表面積(2 630 m2/g)和較高的電導(dǎo)率(64 mS/cm)，是一種理想的電極材料.此外，石墨烯還具有顯著的電化學(xué)性能，如大的電位窗口、低的電荷轉(zhuǎn)移電阻、優(yōu)異的電化學(xué)活性、快的電子轉(zhuǎn)移速率等，這些優(yōu)異的物理和電化學(xué)性能使得石墨烯在電化學(xué)傳感領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用[18-19].石墨烯大的比表面積和優(yōu)異的導(dǎo)電性保證了目標(biāo)物分子的有效附著，從而導(dǎo)致石墨烯電化學(xué)傳感器的高靈敏度和信噪比[20-21].Fe3O4是一種重要的功能材料，具有良好的磁性和強(qiáng)的自旋極化等物理性質(zhì).TiO2具有化學(xué)穩(wěn)定性、光活性、無毒性、抗菌性和良好的親和力.二者結(jié)合構(gòu)成的Fe3O4@TiO2核殼結(jié)構(gòu)納米粒子可產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，提高其催化活性和吸附性能[22-23].文中利用石墨烯和Fe3O4@TiO2@AuNPs三元磁性核殼納米粒子復(fù)合材料修飾金電極，構(gòu)建了一種電化學(xué)傳感器，用于洋薊素檢測(cè)分析.由于復(fù)合材料的協(xié)同效應(yīng)，基于增大的響應(yīng)電流實(shí)現(xiàn)對(duì)洋薊素的高靈敏和定量測(cè)定.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

CHI660D電化學(xué)工作站(上海辰華)；Nova Nano 450場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(美國(guó)FEI公司)；JEM-2100透射電子顯微鏡(日本JEOL公司)；三電極體系(工作電極為金電極，參比電極為飽和甘汞電極，輔助電極為鉑電極).

洋薊素購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，石墨粉(光譜純)、氯金酸(HAuCl4·4H2O)、氯化鐵(FeCl3·6H2O)、鈦酸丁酯(TBOT)、檸檬酸鈉、Al2O3粉均購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.其它試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)室用水為二次去離子水.測(cè)試底液 20 mmol/L PBS(pH 7.5，0.1 mol/L KCl)，本實(shí)驗(yàn)所有電化學(xué)測(cè)試工作均在室溫下進(jìn)行.

1.2 石墨烯的制備

石墨烯的制備采用改進(jìn)的Hummer法[20-21,24-25].首先，制備氧化石墨烯(GO)，取 2.5 g 天然石墨粉加入 60 mL 濃H2SO4中，冰水浴冷卻，加入 1.5 g NaNO2和 7.5 g KMnO4，逐漸升溫至 95 ℃ 并加入 500 mL 水稀釋，再加入 100 mL 6% H2O2，趁熱過濾，用 1 mol/L HCl洗滌沉淀，50 ℃ 真空干燥 20 h，得到氧化石墨烯.其次，利用水合肼還原GO制備石墨烯，取 150 mg GO加入盛150 mL 水的三頸瓶中，超聲溶解，加入 3 mL 水合肼溶液，95 ℃ 回流 24 h，用水和甲醇洗滌沉淀，50 ℃ 真空干燥 24 h，得到石墨烯.

1.3 Fe3O4@TiO2@AuNPs的制備

根據(jù)文獻(xiàn)[26-27]報(bào)道方法改進(jìn)后制備Fe3O4@TiO2磁性核殼納米粒子.取 0.6 g FeCl3·6H2O、1.8 g NaAc和 0.5 g 聚乙二醇(PEG)溶解于 20 mL 乙二醇中，混合液轉(zhuǎn)移至 100 mL 聚四氟乙烯襯里不銹鋼高壓反應(yīng)釜中，200 ℃ 反應(yīng) 8 h，冷卻至室溫，磁性分離，用乙醇洗滌數(shù)次，60 ℃ 干燥 10 h，得到Fe3O4磁性納米粒子.取 9.6 mL 冰醋酸和 6.8 mL 鈦酸丁酯(TBOT)溶于 60 mL 乙醇中，加入 0.4 g Fe3O4磁性納米粒子，超聲分散 15 min，加入 2.4 g 聚乙二醇和 3.6 g 尿素，電動(dòng)攪拌 1 h，然后將混合物轉(zhuǎn)移至高壓反應(yīng)釜，180 ℃ 反應(yīng) 8 h，冷卻至室溫，用乙醇洗滌沉淀數(shù)次，80 ℃ 干燥 12 h，得到Fe3O4@TiO2磁性核殼納米粒子.取 0.5 g Fe3O4@TiO2溶于 1.5 mL 0.2 mol/L 檸檬酸鈉溶液，將混合液加入沸騰的HAuCl4溶液(25 mL, 0.02 %)，攪拌反應(yīng) 2 h，冷卻至室溫，磁性分離，乙醇洗滌多次，得到Fe3O4@TiO2@AuNPs核殼納米粒子.

1.4 電化學(xué)傳感器的制備

工作電極為金電極(Au,d= 3 mm)，使用之前用粒徑為 0.3 μm 和 0.05 μm 的Al2O3粉打磨拋光，依次用水、無水乙醇和水超聲清洗.將金電極浸泡于piranha溶液(H2SO4∶H2O2=3∶1，V/V)1 h，去離子水沖洗.在 0.5 mol/L H2SO4溶液中，-0.2～1.6 V 電位范圍內(nèi)，采用循環(huán)伏安掃描30圈以活化電極，去離水沖洗，N2吹干備用.

取 5 μL 石墨烯懸濁液(1 mg/mL)滴涂于處理好的金電極表面，自然干燥，再滴涂 10 μL Fe3O4@TiO2@AuNPs懸濁液(1 mg/mL)，紅外燈下干燥，制得電化學(xué)傳感器(Fe3O4@TiO2@ AuNPs/GR/Au).

1.5 洋薊素的電化學(xué)檢測(cè)

電化學(xué)檢測(cè)利用三電極系統(tǒng)，底液為 20 mmol/L PBS緩沖液(pH 7.5)，采用循環(huán)伏安法(CV) 和微分脈沖伏安法(DPV)研究洋薊素的電化學(xué)行為和傳感器性能.CV的掃描速率為 100 mV/s，電位范圍為-0.2～0.6 V.DPV的電位范圍為0～0.4 V，脈沖幅度為 5 mV，脈沖寬度為 0.1 s.選用保肝草片(Mariendistel Kapsel)為實(shí)際樣品，研磨成粉，無水乙醇溶解，索氏提取器提取，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn).

2 結(jié)果與討論

2.1 Fe3O4@TiO2@AuNPs的表征

采用SEM和TEM對(duì)制備的Fe3O4@TiO2和Fe3O4@TiO2@AuNPs磁性核殼納米材料進(jìn)行了形貌和結(jié)構(gòu)表征(見圖1).制備的Fe3O4@TiO2和Fe3O4@TiO2@AuNPs具有球形結(jié)構(gòu)，且大小尺寸均勻，平均粒徑約為 400 nm.由TEM圖可見，AuNPs附著于Fe3O4@TiO2表面，且分散均勻，平均粒徑約 5 nm.以上結(jié)果，表明成功制備了Fe3O4@TiO2@AuNPs復(fù)合納米粒子.

圖1 SEM圖(右上角插圖分別為其對(duì)應(yīng)的TEM圖)

2.2 洋薊素的電化學(xué)行為

采用循環(huán)伏安法(CV)研究了洋薊素在不同修飾電極上的電化學(xué)行為.以 20 mmol/L PBS (pH 7.5) 緩沖液為測(cè)試底液，洋薊素濃度為 0.1 mmol/L，分別測(cè)試了裸金電極(Au)、石墨烯修飾電極(GR/Au)、Fe3O4@TiO2修飾電極(Fe3O4@TiO2/Au)和Fe3O4@TiO2@AuNPs和石墨烯復(fù)合材料修飾電極(Fe3O4@TiO2@AuNPs/GR/Au)的CV響應(yīng)曲線，如圖2所示.由圖2可見，裸Au電極對(duì)洋薊素幾乎無電流響應(yīng)，修飾不同納米材料后，CV響應(yīng)電流逐漸增大，其中Fe3O4@TiO2@AuNPs/GR復(fù)合納米材料修飾電極具有最大的電流響應(yīng).石墨烯具有較大的比表面積和良好的導(dǎo)電性，F(xiàn)e3O4@TiO2@AuNPs的加入改進(jìn)了石墨烯的分散性，增強(qiáng)了復(fù)合材料的電催化性能，具有協(xié)同效應(yīng).因而，F(xiàn)e3O4@TiO2@AuNPs/GR復(fù)合納米材料修飾電極對(duì)洋薊素呈現(xiàn)出最大的電流響應(yīng)，構(gòu)建的電化學(xué)傳感器可對(duì)洋薊素進(jìn)行定量分析.

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

為了提高傳感器對(duì)洋薊素的分析性能，對(duì)修飾電極的制備條件和測(cè)試條件進(jìn)行了優(yōu)化.首先，考察了修飾電極制備過程中，納米材料的滴涂量對(duì)傳感器響應(yīng)電流的影響.由圖3a可見，隨著Fe3O4@TiO2@AuNPs和GR比例的增大，響應(yīng)電流逐漸增大，當(dāng)二者比例為2∶1時(shí)，響應(yīng)電流達(dá)到最大值.其次，底液pH對(duì)傳感器檢測(cè)洋薊素響應(yīng)電流的影響如圖3b所示，隨著緩沖液pH增加，響應(yīng)電流逐漸增大，當(dāng)緩沖液pH為7.5時(shí)，響應(yīng)電流達(dá)到極大值.因此，本實(shí)驗(yàn)制備傳感器選擇Fe3O4@TiO2@AuNPs和GR比例為2∶1，測(cè)試緩沖液pH選擇7.5.

圖2 不同修飾電極的CV圖

圖3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.4 洋薊素的檢測(cè)

電化學(xué)傳感器對(duì)洋薊素的定量響應(yīng)曲線如圖4所示.在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，測(cè)試了Fe3O4@TiO2@AuNPs/GR/Au對(duì)不同濃度洋薊素的DPV響應(yīng)曲線，如圖4a所示.隨著洋薊素濃度的增加(50 nmol/L～0.3 mmol/L)，DPV響應(yīng)峰電流增大.DPV峰電流與洋薊素的對(duì)數(shù)濃度成正比(圖4b插圖)，線性方程為I(μA) = 5.14 lgc(μmol/L) +1.37 (R2=0.997 0)，檢出限為17 nmol/L (信噪比S/N=3).表明制備的電化學(xué)傳感器對(duì)洋薊素的檢測(cè)具有較寬的線性范圍和較低的檢測(cè)限.

圖4 傳感器對(duì)不同濃度洋薊素的定量響應(yīng)曲線

2.4 傳感器的選擇性、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

為了滿足傳感器的實(shí)際應(yīng)用性，考察了修飾電極的選擇性、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性.如圖5a所示，測(cè)試了傳感器對(duì) 1 mmol/L 洋薊素和10倍過量不同干擾物(尿酸UA，NaCl，KNO3，KCl，檸檬酸鈉CA，L-谷氨酸鈉L-GA，葡萄糖glucose)混合液的DPV響應(yīng)峰電流.由圖可見，傳感器對(duì)洋薊素表現(xiàn)出較大的電流響應(yīng)，而對(duì)洋薊素與其它可能干擾物的混合液，響應(yīng)電流未明顯增加，說明制備的修飾電極對(duì)洋薊素的檢測(cè)具有較高的選擇性.傳感器的穩(wěn)定性如圖5b所示，連續(xù)多次測(cè)試修飾電極對(duì)1 mmol/L洋薊素的CV響應(yīng)曲線，由圖5b可見，第1次測(cè)試CV曲線響應(yīng)電流與第30次測(cè)試值基本相當(dāng)(99%)，且制備的傳感器在室溫條件下放置1周后，再進(jìn)行相同條件下的測(cè)試，響應(yīng)電流基本穩(wěn)定(>90%)，未發(fā)生明顯變化.以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明制備的電化學(xué)傳感器具有較高的選擇性、良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性.

圖5 傳感器的特性

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

為了評(píng)價(jià)傳感器的實(shí)際應(yīng)用性，選用保肝草片(Mariendistel Kapsel)為實(shí)際樣品，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn).稱取一定量的保肝草片，研磨成粉，無水乙醇溶解，索氏提取器加熱回流提取，乙醇配制為樣品溶液.標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定結(jié)果，列于表1.由表中數(shù)據(jù)可見，測(cè)定結(jié)果的回收率為96.4%～102.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.6%～2.1%，說明制備的電化學(xué)傳感器可用于實(shí)際樣品中洋薊素的定量測(cè)定.

表1 實(shí)際樣品中洋薊素的測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 結(jié)語

本文基于石墨烯和Fe3O4@TiO2@AuNPs磁性核殼納米粒子復(fù)合材料修飾金電極，構(gòu)建了一種檢測(cè)洋薊素的電化學(xué)傳感器.由于石墨烯大的比表面積和良好的導(dǎo)電性，結(jié)合Fe3O4@TiO2@AuNPs核殼納米粒子，改善了石墨烯的分散性，產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，導(dǎo)致傳感器對(duì)洋薊素具有顯著的電流響應(yīng).該電化學(xué)傳感器具有線性范圍寬、檢測(cè)限低、選擇性和穩(wěn)定性高等特點(diǎn)，可用于實(shí)際樣品中洋薊素定量測(cè)定.