曾雅莉,文 雙,熊靜霆,王舒靈,王 萍,劉慧敏

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院:1.檢驗(yàn)科；2.呼吸科；3.兒科，湖北武漢 430077

呼吸道病毒是呼吸道感染最為常見的病原微生物，是導(dǎo)致臨床發(fā)病率與病死率高的主要原因之一[1]。老年人由于呼吸系統(tǒng)形態(tài)學(xué)的變化及身體機(jī)能的退化，成為呼吸道病毒的易感人群[2]。因此快速檢測(cè)鑒別呼吸道病毒，對(duì)于患者疾病的診斷及治療具有重要價(jià)值。目前檢測(cè)呼吸道病毒的方法有病毒培養(yǎng)法、分子生物學(xué)方法、免疫學(xué)方法。病毒培養(yǎng)法耗時(shí)耗力，假陰性多；分子生物學(xué)的方法靈敏度高，但對(duì)工作人員和實(shí)驗(yàn)室要求均較高；免疫學(xué)的方法相對(duì)簡(jiǎn)單，應(yīng)用比較廣泛[3]。本研究分析呼吸道感染老年患者呼吸道病毒抗原、抗體檢測(cè)及其兩者聯(lián)合檢測(cè)的結(jié)果，旨在比較3種檢測(cè)方法的臨床應(yīng)用價(jià)值，為臨床選擇合適的檢測(cè)方法提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年1-12月本院收治的呼吸道感染的老年患者(≥60歲)725例作為研究對(duì)象。其中男394例、女331例，平均年齡(75.36±7.82)歲。研究對(duì)象按照年齡分為60～<80歲542例和≥80歲183例。又依據(jù)研究對(duì)象起病時(shí)長(zhǎng)分為發(fā)病≤2 d 112例、發(fā)病3～4 d 147例、發(fā)病5～6 d 208例、發(fā)病≥7 d 258例。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照人民衛(wèi)生出版社《內(nèi)科學(xué)(第8版)》。

1.2儀器與試劑 抗體檢測(cè)試劑盒為西班牙VIRcell公司呼吸道病原體IgM抗體檢測(cè)試劑盒，抗原檢測(cè)試劑盒為美國(guó)Diagnostic Hybrids公司呼吸道病毒檢測(cè)試劑盒，顯微鏡為德國(guó)徠卡公司Leica DM500熒光顯微鏡。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 研究對(duì)象入院立即采集鼻咽拭子和血清標(biāo)本。鼻咽拭子采集方法：將帶有聚丙烯纖維頭的拭子輕輕伸入患者的鼻咽部，停留片刻緩慢旋轉(zhuǎn)取出，將拭子頭進(jìn)入到含2 mL生理鹽水的無(wú)菌容器中，立即送檢，用于檢測(cè)流感病毒A(IFA)、流感病毒B(IFB)、腺病毒(ADV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒(包括1、2、3型，PIV-1、2、3)抗原。血清標(biāo)本采集方法：抽取患者靜脈血2～3 mL于黃色真空促凝管中，3 000 r/min離心10 min，分離血清用于檢測(cè)呼吸道病毒抗體IgM。

1.3.2呼吸道病毒抗原的檢測(cè) (1)標(biāo)本準(zhǔn)備:將標(biāo)本放在漩渦混勻器上充分混勻10～15 s，3 000 r/min離心5 min，棄上清液，在沉淀中加2 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)，充分振蕩混勻10 s再次離心棄上清液，在沉淀中加1 mL PBS，吹打混勻形成細(xì)胞懸液。(2)標(biāo)本檢測(cè):在8孔載玻片的每孔內(nèi)滴加25 μL的細(xì)胞懸液，待完全風(fēng)干，于室溫用預(yù)冷的100%丙酮固定細(xì)胞約5～10 mL后取出風(fēng)干，在固定并風(fēng)干好的細(xì)胞及抗原對(duì)照板上滴加1滴DFA染色試劑，使其完全覆蓋細(xì)胞并置于濕盒，放入37 ℃恒溫箱孵育30 min，用預(yù)先稀釋好的洗滌液反復(fù)清洗已染玻片2～3次，晾干后在固定有細(xì)胞的每個(gè)孔內(nèi)加1滴封閉液，最后蓋上蓋玻片在熒光顯微鏡下觀察，若細(xì)胞呈現(xiàn)蘋果綠熒光為陽(yáng)性，無(wú)綠色熒光為陰性。

1.3.3呼吸道病毒抗體IgM檢測(cè) (1)標(biāo)本準(zhǔn)備:先將血清用預(yù)先配置好的PBS按1∶1稀釋，即15 μL血清加入15 μL PBS，再加入150 μL抗人IgG吸附劑，混勻后，12 000 r/min離心10 min，留上清備用。(2)標(biāo)本檢測(cè):在載玻片的每孔中加入15 μL上述處理好的血清后放入濕盒，37 ℃溫育90 min，用PBS沖洗載玻片，然后將載玻片浸泡在PBS中10 min，再用去離子水沖洗載玻片晾干后，每孔加入15 μL抗人IgM FITC結(jié)合物溶液，將載玻片放入濕盒37 ℃溫育30 min，重復(fù)上述洗滌步驟，待載玻片晾干后，每孔加1滴封閉介質(zhì)，蓋好蓋玻片在熒光顯微鏡下觀察，若細(xì)胞有果綠色熒光為陽(yáng)性，無(wú)綠色熒光為陰性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料用百分?jǐn)?shù)(%)表示，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.13種方法檢測(cè)呼吸道病毒的陽(yáng)性情況 725例老年患者中，抗原檢測(cè)方法檢出261例至少1種病毒陽(yáng)性，陽(yáng)性率為36.0%，其中檢出2種及以上病毒陽(yáng)性24例，混合感染率9.20%；抗體檢測(cè)方法檢出196例至少1種病毒陽(yáng)性，陽(yáng)性率為27.0%，其中檢出2種及以上病毒陽(yáng)性29例，混合感染率14.8%；抗原聯(lián)合抗體檢測(cè)方法檢出311例至少1種病毒陽(yáng)性，陽(yáng)性率為42.9%,其中檢出2種及以上病毒陽(yáng)性35例，混合感染率11.3%。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.5、7.22、40.1，P<0.05)?？乖瓩z測(cè)陽(yáng)性率最高為IFB，其次為IFA、PIV、RSV、ADV，另外兩種檢測(cè)方法也顯示同樣的趨勢(shì)，見表1。

表1 3種方法檢測(cè)各呼吸道病毒陽(yáng)性率[n(%)]

2.2不同性別、年齡患者3種檢測(cè)方法陽(yáng)性率比較 男、女患者抗原檢測(cè)陽(yáng)性率、抗體檢測(cè)陽(yáng)性率、聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.48、0.85、1.46，P>0.05)。兩個(gè)年齡段間抗體檢測(cè)陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.25，P<0.05)，抗原檢測(cè)陽(yáng)性率、聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.61、0.01，P>0.05)，見表2。

表2 不同性別、年齡患者3種檢測(cè)方法陽(yáng)性率比較[n(%)]

2.3不同病程患者3種檢測(cè)方法陽(yáng)性率比較 不同病程患者抗原檢測(cè)陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，隨著病程的延長(zhǎng)抗原檢測(cè)陽(yáng)性率呈降低趨勢(shì)。不同病程患者抗體檢測(cè)陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，隨著病程的延長(zhǎng)抗體檢測(cè)陽(yáng)性率呈下降趨勢(shì)。不同病程患者聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。發(fā)病≤2 d、發(fā)病3～4 d、發(fā)病5～6 d患者3種檢測(cè)方法陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=31.39、15.20、6.89，P<0.05)，進(jìn)一步分析結(jié)果顯示發(fā)病≤2 d、發(fā)病3～4 d、發(fā)病5～6 d患者抗原檢測(cè)陽(yáng)性率均高于抗體檢測(cè)陽(yáng)性率(χ2=23.60、9.72、4.31，P<0.05)，聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性率亦均明顯高于抗體檢測(cè)陽(yáng)性率(χ2=27.37、15.67、6.54，P<0.05)，聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性率與抗原檢測(cè)陽(yáng)性率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.16、0.35、0.49，P>0.05)。發(fā)病≥7 d患者3種檢測(cè)方法陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.80，P<0.05)，其聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性率明顯高于抗原、抗體檢測(cè)陽(yáng)性率(χ2=10.47、4.01，P<0.05)，但其抗原檢測(cè)陽(yáng)性率與抗體檢測(cè)陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.55，P>0.05)，見表3。

表3 不同病程患者3種檢測(cè)方法陽(yáng)性率比較[n(%)]

3 討 論

目前，抗原或抗體檢測(cè)是臨床上常用的呼吸道病毒檢測(cè)方法，其中直接免疫熒光法是經(jīng)世界衛(wèi)生組織評(píng)審結(jié)果良好，是穩(wěn)定可靠的抗原檢測(cè)方法[4]，間接免疫熒光測(cè)抗體的方法也有著較高的特異度和靈敏度等優(yōu)點(diǎn)[5]。本研究比較這兩種檢測(cè)方法的陽(yáng)性率結(jié)果，分析是否有必要聯(lián)合檢測(cè)來(lái)提高病原體檢出陽(yáng)性率。這對(duì)于指導(dǎo)臨床更加快速、合理地明確診斷，減少住院周期及不必要的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，節(jié)約醫(yī)療資源有著重要意義。

本研究結(jié)果顯示，抗原檢測(cè)、抗體檢測(cè)、抗原及抗體聯(lián)合檢測(cè)總陽(yáng)性率分別為36.0%、27.0%、42.9%。從總陽(yáng)性率來(lái)看，聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性率高于抗原、抗體單獨(dú)檢測(cè)，抗原檢測(cè)陽(yáng)性率高于抗體檢測(cè)陽(yáng)性率，提示總體上抗原、抗體聯(lián)合檢測(cè)有助于提高陽(yáng)性率，具體還需進(jìn)一步分析。老年人群呼吸道病毒感染以IFB為主，其次為IFA、PIV、RSV、ADV，這與潘婧等[6]報(bào)道結(jié)果不同，可能與地域、年份不同有關(guān)[7-9]。3種方法檢測(cè)混合感染率約10%，高于高巍[10]報(bào)道結(jié)果，提示老年人更容易發(fā)生呼吸道病毒的混合感染。

本研究結(jié)果顯示，男、女患者抗原陽(yáng)性率、抗體陽(yáng)性率、聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。60～<80歲患者抗體檢測(cè)陽(yáng)性率明顯高于≥80歲患者，可能跟≥80歲老年人的免疫反應(yīng)明顯降低有關(guān)[11]。發(fā)病≤2 d、發(fā)病3～4 d和發(fā)病5～6 d患者抗原檢測(cè)、聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性率均明顯高于抗體檢測(cè)陽(yáng)性率，但其聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性率與抗原檢測(cè)陽(yáng)性率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，進(jìn)一步提示在發(fā)病早期抗原檢測(cè)優(yōu)于抗體檢測(cè)，這可能與抗體產(chǎn)生的窗口期有關(guān)[12]；與抗原檢測(cè)相比，聯(lián)合檢測(cè)并沒(méi)有顯著提高病原體檢出陽(yáng)性率。發(fā)病≥7 d患者聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性率明顯高于抗原、抗體檢測(cè)陽(yáng)性率，而其抗原檢測(cè)陽(yáng)性率與抗體檢測(cè)陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示發(fā)病≥7 d患者聯(lián)合檢測(cè)有助于提高呼吸道病毒檢出陽(yáng)性率。

綜上所述，建議臨床醫(yī)生依據(jù)患者的特點(diǎn)，科學(xué)地選擇檢測(cè)手段。對(duì)于發(fā)病早期的呼吸道感染老年患者，建議優(yōu)先選擇呼吸道病毒抗原檢測(cè)，對(duì)于發(fā)病≥7 d患者，建議抗原、抗體同時(shí)檢測(cè)，這對(duì)于節(jié)約患者醫(yī)療費(fèi)用，提高臨床診斷效率有重要意義。