湯 慶,李 松,鐘元鋒,李 晨,劉 沛,田學文,劉為勇,孫自鏞,李輝軍

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院檢驗科，湖北武漢 430030

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)傳播迅速，當前國內外防治形勢異常嚴峻[1-3]。機體感染SARS-CoV-2后可引起適應性體液免疫應答，約7 d會產生針對性IgM抗體，約14 d產生IgG抗體[1]。然而，有報道稱2.0%～8.5%患者在感染SARS-CoV-2后沒有出現(xiàn)SARS-CoV-2抗體[4]。目前國內關于新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)患者不產生抗體的報道較少，本研究對SARS-CoV-2抗體陰性及抗體陽性患者的炎癥因子表達水平進行比較分析，旨在為COVID-19的臨床治療及疫苗研發(fā)提供一些參考依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年1—2月華中科技大學同濟醫(yī)院中法新城院區(qū)定點收治住院確診的COVID-19患者212例為研究對象，按照患者自檢出核酸陽性起2周后是否產生SARS-CoV-2抗體將其分為抗體陰性組44例，其中男性22例、女性22例，平均年齡(52.8±17.9)歲；以及抗體陽性組168例，其中男性80例、女性88例，平均年齡(59.4±13.8)歲；抗體陽性組中含SARS-CoV-2 IgM抗體陽性137例，SARS-CoV-2 IgG抗體陽性168例。納入標準：(1)有流行病學接觸史；(2)有發(fā)熱、咳嗽等癥狀，實驗室檢查發(fā)現(xiàn)白細胞或淋巴細胞水平降低，胸部CT檢查顯示病毒性肺炎改變，且按國家衛(wèi)生健康委員會新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第八版)[5]臨床診斷為COVID-19。排除標準：年齡<18歲，急診入院診斷不明確或資料缺失。收集患者的年齡、性別、住院天數(shù)、臨床分型、臨床結局、基礎性疾病及呼吸輔助情況等一般臨床資料進行研究分析。本研究通過華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院倫理委員會審核批準。本文屬于回顧性研究免除患者知情同意書。

1.2儀器與試劑 SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體采用深圳市亞輝龍生物科技股份有限公司iFlash3000 全自動化學發(fā)光免疫分析儀進行檢測，試劑及定標品為原裝配套；全血細胞計數(shù)采用日本SYSMEX XN3000全自動生化分析儀進行檢測，試劑為其配套試劑。超敏C反應蛋白(hs-CRP)采用德國羅氏COMBAS 8000全自動生化分析儀進行檢測，試劑及定標品購自日本生研，乳酸脫氫酶(LDH)采用德國羅氏COMBAS 8000全自動生化分析儀進行檢測，試劑及定標品為原裝配套。白細胞介素(IL)-1β、IL-2R、IL-8、IL-10、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)采用SIEMENSIMMULITE 1000免疫分析儀進行檢測，試劑及定標品為原裝配套。IL-6采用Roche e602電化學發(fā)光法檢測儀進行檢測，試劑及定標品為原裝配套。檢測標本均按照實驗室標準操作規(guī)程進行，保證所有檢測系統(tǒng)平穩(wěn)無故障且待測項目室內質控均為在控狀態(tài)。

1.3方法

1.3.1標本采集及處理 所有患者均于入院24 h內完成靜脈血標本采集，全血細胞計數(shù)采用乙二胺四乙酸抗凝劑、hs-CRP采用肝素鋰抗凝劑、D-二聚體及纖維蛋白原(FIB)采用枸櫞酸鈉抗凝劑、細胞因子及SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體采用二氧化硅/分離膠的采血管采集。需離心標本采用3 500 r/m離心10 min，不能立即檢測的標本暫存于4 ℃冰箱中，需長期保存的血清/血漿標本放置于-70 ℃保存。

1.3.2SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體檢測 患者于入院當日及擇期進行SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體檢測，保證所有患者在10～<20 d及20～<30 d均能獲得抗體數(shù)據(jù)。IgM 和 IgG 濃度<10.0 AU/mL時，為無反應性(陰性)；標本IgM和IgG濃度≥10.0 AU/mL時認為有反應性(陽性)。

1.3.3細胞因子檢測 收到標本時立即對細胞因子進行離心上機檢測，避免放置較長時間。IL-1β、IL-2R、IL-8、IL-10、IL-6、TNF-α參考范圍分別為<5.0 pg/mL、223.0～710.0 U/mL、<62.0 pg/mL、<9.1 pg/mL、<8.1 pg/mL、<7.0 pg/mL。

2 結 果

2.1兩組臨床資料比較 抗體陰性組年齡、住院天數(shù)小于抗體陽性組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 COVID-19住院患者一般臨床資料

2.2兩組SARS-CoV-2 IgG、IgM抗體滴度變化 抗體陰性組自檢出COVID-19核酸陽性后10～<20 d及20～<30 d血清中均未檢測出SARS-CoV-2 IgG、IgM抗體?？贵w陽性組自檢出COVID-19核酸陽性后10～<20 d及20～<30 d血清中檢出SARS-CoV-2 IgG、IgM抗體?？贵w陽性組自檢出COVID-19核酸陽性后20～<30 d SARS-CoV-2 IgG抗體滴度較自檢出COVID-19核酸陽性后10～<20 d升高，而抗體陽性組自檢出COVID-19核酸陽性后20～<30 d SARS-CoV-2 IgM抗體滴度較自檢出COVID-19核酸陽性后10～<20 d降低。見表2。

表2 兩組SARS-CoV-2 IgG、IgM抗體滴度變化[S/CO，M(P25,P75)]

續(xù)表2 兩組SARS-CoV-2 IgG、IgM抗體滴度變化[S/CO，M(P25,P75)]

2.3抗體陽性組與抗體陰性組患者入院時實驗室指標之間的差異分析 抗體陽性組WBC、中性粒細胞計數(shù)(NEUT)、單核細胞計數(shù)(MONO)、RBC、血小板計數(shù)(PLT)、IL-2R、IL-10、TNF-α與抗體陰性組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而抗體陽性組hs-CRP、LDH、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、D-二聚體及FIB高于抗體陰性組，淋巴細胞計數(shù)(LYMPH)、血紅蛋白濃度(HGB)及血細胞比容(Hct)低于抗體陰性組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 SARS-CoV-2 IgM、IgG抗體陽性組與抗體陰性組患者入院時實驗室指標分析

3 討 論

目前由于缺乏COVID-19有效的治療藥物，該病給全球公共衛(wèi)生系統(tǒng)帶來了巨大挑戰(zhàn)[6]。機體細胞免疫和體液免疫在抗病毒感染中起著至關重要的作用[7]。有研究報道，機體在感染SARS-CoV-2 1周后血清中可檢測到SARS-CoV-2 IgM抗體，發(fā)病2周后上升到峰值，3～4周后開始下降，SARS-CoV-2 IgG抗體轉陽的中位數(shù)時間為12～14 d[8]。本研究發(fā)現(xiàn)抗體陰性組血清中未檢測到SARS-CoV-2 IgG抗體、SARS-CoV-2 IgM抗體，與抗體陽性組相比，抗體陰性組年齡較小，且住院天數(shù)較短?？贵w陰性組患者年齡較小、恢復較快，可能體內存在其他方式的免疫反應，比如細胞免疫，特異性IgA抗體、細胞因子等促進患者恢復[9]。兩組臨床分型、臨床結局、呼吸機輔助通氣治療方面比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，可能是由于收治患者病情偏重，同時患者合并基礎疾病較重，如急性腦梗死、急性冠心病、惡性腫瘤等。然而，具體原因還需要后續(xù)繼續(xù)進行更大樣本及更深入的研究。

SARS-CoV-2感染后，引起機體免疫應答的同時，也活化了各種細胞信號，導致炎癥因子大量釋放，引起細胞因子風暴。炎癥因子的釋放是一種應激反應，一方面有利于病毒清除，然而失控的炎性反應和免疫紊亂會引起多器官免疫病理損傷[10]，有研究表明，COVID-19患者可出現(xiàn)細胞因子水平升高，并與疾病嚴重程度呈正相關[11-12]，可能與患者存在免疫失衡及其導致的細胞因子釋放綜合征(CRS)有關[13]。IL-6 是誘發(fā)CRS 的重要因子，可通過上調血管內皮生長因子的表達來破壞血管屏障穩(wěn)定性，從而刺激單核細胞表達更多的組織因子，加劇外源性凝血系統(tǒng)活化，生成的凝血酶反過來又可誘導血管內皮產生更多的IL-6 及其他細胞因子，這樣“細胞因子風暴”與凝血系統(tǒng)紊亂形成了惡性循環(huán)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)抗體陽性組體內血清hs-CRP、LDH、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、D-二聚體及FIB水平高于抗體陰性組，表明未檢測到SARS-CoV-2 IgG、IgM抗體的COVID-19患者體內的炎性反應水平較輕。這類患者感染可能局限于呼吸道黏膜細胞，或者感染的病毒載量較小，抗體反應主要由分泌性免疫系統(tǒng)控制，故引起全身性的炎性反應較小。由于抗體陰性組樣本量較少，故本研究中無法在年齡與住院天數(shù)進行匹配，關于年齡及住院天數(shù)對細胞因子水平是否有影響還需進一步的研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，未檢測到SARS-CoV-2 IgG、IgM抗體的COVID-19患者相對于抗體陽性患者其體內炎性反應較輕，病程較短，其為臨床治療及疫苗的研發(fā)提供一些參考依據(jù)。