唐健波，呂 都，彭 梅，范建新，潘 牧，陳朝軍，王 輝，楊 娟,

（1.貴州省農(nóng)科院食品加工研究所，貴州貴陽 550025；2.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550014；3.貴州醫(yī)科大學(xué)藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550014；4.貴州省農(nóng)科院亞熱帶作物研究所，貴州貴陽 550025）

刺梨（Rosa roxbunghiiTratt，RRT），為薔薇科薔薇屬落葉灌木植物，主要分布于我國西南省份海拔1000~1600 m的山區(qū)[1]。2019年初，刺梨被貴州省列為12個(gè)農(nóng)業(yè)特色優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)之一，并得到快速發(fā)展，種植面積和加工能力逐年上升。據(jù)統(tǒng)計(jì)，至2020年底，貴州省刺梨種植面積突破200萬畝，全省刺梨鮮果產(chǎn)量超10萬噸，同比增長51%，全省35家刺梨重點(diǎn)加工企業(yè)年鮮果加工能力達(dá)14萬噸，刺梨產(chǎn)業(yè)在貴州省呈現(xiàn)出蓬勃生機(jī)。

現(xiàn)代研究表明，刺梨富含多種營養(yǎng)元素和功能成分，包括多糖、多酚、維生素C、超氧化物歧化酶、黃酮、維生素B以及多種礦物質(zhì)元素[2?6]，具有抗氧化[2,7]、抗腫瘤[8]、抗炎[9]、防輻射[9?10]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[11]、促進(jìn)胃腸道消化[12]等多種藥用功效，在功能性食品及藥品的開發(fā)上均具有廣闊的應(yīng)用前景。

天然植物多糖由于具有抗氧化、抗腫瘤、乳化、增稠、起泡、膠凝等多種特性，且相較于人工合成藥物或添加劑，具有作用效果好、毒副作用小和安全系數(shù)高等優(yōu)點(diǎn)，一直以來都是研究的熱點(diǎn)[13?14]。其中，刺梨多糖（Rosa roxbunghiiTratt polysaccharide，RRTP）作為刺梨中的主要功能性成分，對刺梨產(chǎn)品的開發(fā)和研究均具有重要影響。因此，對刺梨多糖的提取方法及其功能特性進(jìn)行系統(tǒng)研究將具有重要理論和現(xiàn)實(shí)意義。

本研究考慮到傳統(tǒng)溶劑或熱水提取刺梨多糖需要大量的化學(xué)溶劑，萃取時(shí)間長，提取效率低、加工溫度高，會(huì)對刺梨多糖的生物活性和安全性產(chǎn)生不利影響，擬從追求綠色提取工藝的角度出發(fā)，建立一種新的酶法輔助熱水浸提刺梨多糖工藝并對其抗腫瘤活性進(jìn)行評價(jià)，獲得一種提高刺梨多糖的提取效率和生物活性的綠色提取工藝，以期為刺梨多糖的進(jìn)一步開發(fā)和綜合應(yīng)用奠定良好的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

刺梨干果 貴州省貴陽市萬東橋藥材市場；昆明種小鼠（雌雄各半，共60只，體重20±2 g） 由貴州醫(yī)科大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心提供；S180瘤株 由貴州大學(xué)楊再昌教授惠贈(zèng)并由貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室妥善傳代并保存；無水乙醇、濃硫酸

重慶川東化工有限公司；纖維素酶（≥15000 U/g）、苯酚、冰醋酸、亞甲藍(lán)、羧甲基纖維素鈉、生理鹽水

國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；環(huán)磷酰胺 江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。

DK-98-11型水浴鍋 天津泰斯特儀器有限公司；MD spectra MAX-190型連續(xù)波長酶標(biāo)儀 美國MD公司；HP-8435型紫外可見分光光度計(jì) 美國惠普公司；AL204型梅特勒電子分析天平 梅特勒·托利多儀器（上海）有限公司；DZF-6021型真空干燥箱

上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FW型高速萬能粉碎

天津泰斯特儀器有限公司；PH100生物顯微鏡鳳凰光學(xué)集團(tuán)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 刺梨多糖提取工藝優(yōu)化

1.2.1.1 刺梨干果預(yù)處理 采用60 ℃真空干燥刺梨干果至恒重，高速萬能粉碎機(jī)粉碎（1 min），過40目篩，用80%乙醇加熱回流提取8次，初步除去生物堿、甙類等醇溶性物質(zhì)（每次2 h），抽濾得刺梨粉末，于60 ℃真空干燥至恒重后制得預(yù)處理樣品。

1.2.1.2 刺梨多糖酶法輔助熱水浸提工藝 取預(yù)處理樣品5 g，加入500 mL圓底燒瓶中，按照設(shè)定液料比添加0.1 mol/L的提前配制的固定pH檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，并按設(shè)定酶添加濃度添加纖維素酶，混勻后放入水浴鍋中，在設(shè)置的提取溫度和提取時(shí)間條件下進(jìn)行酶解，酶解反應(yīng)結(jié)束后，將溫度提升至90 ℃進(jìn)行滅酶并浸提3 h，抽濾后得濾液。濾液進(jìn)行減壓濃縮后，置于截留分子量>14000 Da的透析袋中，以流動(dòng)蒸餾水進(jìn)行透析除去小分子雜質(zhì)后，減壓濃縮至一定體積，并根據(jù)體積計(jì)算加入適量無水乙醇，使樣品中乙醇濃度達(dá)到80%，樣品攪拌均勻后，置于4 ℃冰箱中靜置12 h。將樣品取出，抽濾并用無水乙醇洗滌析出絮凝物2~3次，將絮凝物在60 ℃真空干燥至恒重后得刺梨粗多糖。

1.2.1.3 刺梨多糖酶法輔助熱水浸提單因素實(shí)驗(yàn)本研究選用酶解pH、酶解時(shí)間、酶解溫度以及酶添加濃度四個(gè)影響因素，考察影響因素對酶法輔助熱水浸提刺梨多糖得率的影響。固定液料比30:1 mL/g，酶解pH5.8，酶解時(shí)間4 h，酶解溫度50 ℃，酶添加濃度1.5%，提取1次的基本條件，分別改變酶解pH（4.2、4.6、5.0、5.4、5.8、6.2）、酶解時(shí)間（1、2、3、4、5、6、7 h）、酶解溫度（30、40、50、60、70、80 ℃）、酶添加濃度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%）四個(gè)因素的條件，考察其對酶法輔助熱水浸提刺梨多糖得率的影響。

1.2.1.4 刺梨多糖酶法輔助熱水浸提響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)（BBD）設(shè)計(jì)原理，在液料比30 mL/g，提取1次的原則下，選取酶解pH、酶解時(shí)間、酶解溫度和酶添加濃度作為自變量，刺梨多糖得率為響應(yīng)值，利用軟件Design-Expert.V8.0.6進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析。試驗(yàn)因素及水平如表1所示。

表 1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.1.5 刺梨多糖含量測定和多糖得率的計(jì)算 參考唐健波等[15]的方法，采用苯酚-硫酸法進(jìn)行刺梨多糖含量測定。以蒸餾水為空白對照，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，吸光度為橫坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.0057X+0.0202，R2=0.9981。根據(jù)多糖含量計(jì)算刺梨多糖得率。

式中：m為刺梨粗多糖的質(zhì)量（g）；ω為粗多糖中多糖的含量（%）；M為預(yù)處理樣品的質(zhì)量（g）。

1.2.2 刺梨多糖抗腫瘤試驗(yàn)

1.2.2.1 S180實(shí)體瘤模型的建立 參考Zong等[16]的方法并適當(dāng)進(jìn)行修改。將保存于液氮罐中的S180瘤株進(jìn)行復(fù)蘇，用醫(yī)用酒精對小鼠腹部進(jìn)行消毒后，取0.2 mL復(fù)蘇的腫瘤液接種于小鼠腹腔中，然后讓接種后的小鼠在標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物試驗(yàn)室（溫度為23±2 ℃，濕度為55%±5%，白天黑夜各為12 h）中進(jìn)行自由飲水和進(jìn)食。接種7 d后，用無菌注射器從小鼠腹腔抽取腫瘤液，按照以上方法進(jìn)行第二次傳代，經(jīng)臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，活細(xì)胞數(shù)目>95%時(shí)，方可進(jìn)行下步腫瘤接種。采用無菌注射器抽取第二次傳代小鼠腹腔中的腫瘤液，用生理鹽水稀釋3倍制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液按每只小鼠0.2 mL的劑量皮下接種于小鼠右腋下。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，如果出現(xiàn)空白組小鼠腫瘤平均瘤重<1 g、20%小鼠瘤重<0.49 g或小鼠死亡數(shù)>20%中的任意情況，則判定試驗(yàn)失敗。

1.2.2.2 動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)過程 參考并部分修改Cai等[17]的方法。將昆明種小鼠在標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物試驗(yàn)室進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d，挑選生長狀態(tài)良好的健康小鼠60只，雌雄各半，按照1.2.2.1中的方法進(jìn)行腫瘤接種，建立S180實(shí)體瘤模型。小鼠接種24 h后，將小鼠隨機(jī)分為5組（n=12）：空白對照組（CT），環(huán)磷酰胺組（CTX），多糖高劑量組（H-PS）、中劑量組（M-PS）、低劑量組（L-PS），每組小鼠12只，雌雄各半。用生理鹽水配制3.5 mg/mL的環(huán)磷酰胺溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用）作為CTX組藥劑，用0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液配制不同劑量的多糖藥劑，以0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液作為空白組藥劑。其中：CT組，灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉0.1 mL/10 g，1 d 1次；CTX組，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，選擇腹腔注射環(huán)磷酰胺溶液0.1 mL/kg（即劑量為35 mg/kg），第1次注射后，間隔3 d注射一次，一共注射3次；H-PS組，灌胃刺梨多糖400 mg/kg，1 d 1次；M-PS組，灌胃刺梨多糖200 mg/kg，1 d 1次；L-PS組，灌胃刺梨多糖100 mg/kg，1 d 1次。連續(xù)10 d。

1.2.2.3 抑瘤率的計(jì)算 參考賈福懷等[18]的方法，在最后一次灌胃后，小鼠禁食12 h，將小鼠以脊椎脫臼法處死，剝離出小鼠右腋下腫瘤，稱重，計(jì)算抑瘤率。

式中：m為給藥組平均腫瘤質(zhì)量（g），M為空白組平均腫瘤質(zhì)量（g）。

1.2.2.4 外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù) 參考姚佳等[19]的方法。在最后一次灌胃后，小鼠禁食12 h后，用毛細(xì)管（0.9 mm×100 mm）進(jìn)行眼眶取血，然后進(jìn)行外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)。具體方法為：在試管中加入白細(xì)胞稀釋液（冰醋酸2 mL、蒸餾水98 mL、10 g/mL的亞甲藍(lán)溶液3~5滴）0.38 mL，然后加入小鼠眼眶新鮮血液20 μL，將試管輕微震蕩2 min混勻后立即吸取10 μL懸液充入血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)池內(nèi)，靜置2~3 min后在顯微鏡低倍鏡下對四角的4個(gè)大方格內(nèi)白細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)，并計(jì)算白細(xì)胞總數(shù)。

1.2.2.5 胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的測定 參考姚佳等[19]的方法。在最后一次灌胃后，小鼠禁食12 h后，小鼠稱重后以脊椎脫臼法處死，分別去除小鼠的胸腺和脾臟，擦干周邊血跡后進(jìn)行稱重，并按下列公式計(jì)算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 20.0進(jìn)行單因素方差分析和多重比較（P<0.05為顯著差異），數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示（±s）；采用Design-Expert V 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)及參數(shù)優(yōu)化和統(tǒng)計(jì)分析；采用OriginPro 2018對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖，圖或表中的小寫字母表示差異顯著（P<0.05）；所有工藝優(yōu)化試驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶法輔助熱水浸提刺梨多糖單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶解pH對刺梨多糖得率的影響 如圖1所示，隨著酶解pH的升高，刺梨多糖得率呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，當(dāng)pH達(dá)到5.4時(shí)，多糖得率上升趨勢明顯變緩。其中pH在5.4和5.8時(shí)，多糖得率不存在顯著差異（P>0.05）；pH在5.8和6.2之間時(shí)，同樣不存在顯著差異（P>0.05）。這可能是因?yàn)橐源汤骖A(yù)處理樣品作為反應(yīng)底物時(shí)，纖維素酶在pH5.8附近時(shí)呈現(xiàn)出較好的酶解反應(yīng)活性，促進(jìn)了刺梨多糖的溶出。同時(shí)考慮到，pH是通過酶活性中心上必需基團(tuán)的解離水平調(diào)節(jié)影響酶分子對底物的結(jié)合及催化，酶反應(yīng)速度直接受到適宜pH的調(diào)控，且酶的空間結(jié)構(gòu)在不同的pH下會(huì)發(fā)生變化，從而改變酶的構(gòu)象和活性，影響到刺梨多糖的得率，這與高濤等[20]的研究結(jié)果基本一致。因此，綜合考慮，選擇酶解pH5.4、5.8、6.2這三個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖 1 酶解pH對刺梨多糖得率的影響Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis pH on the yield of RRTP

圖 2 酶解時(shí)間對刺梨多糖得率的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of RRTP

2.1.2 酶解時(shí)間對刺梨多糖得率的影響 由圖2所示，隨著酶解時(shí)間的增加，刺梨多糖得率呈現(xiàn)先上升后下降的拋物線形式呈現(xiàn)。在1~4 h內(nèi)，隨著酶解時(shí)間的延長，刺梨多糖得率顯著性升高（P<0.05），在酶解時(shí)間達(dá)到4 h時(shí)，刺梨多糖得率達(dá)到最高點(diǎn)。之后，隨著酶解時(shí)間的繼續(xù)延長，刺梨多糖得率開始顯著性降低（P<0.05），這可能是由于隨著酶解時(shí)間的延長，刺梨多糖受酶作用的影響發(fā)生部分水解從而導(dǎo)致得率降低，這與Guo等[21]的研究結(jié)果一致。因此，綜合考慮后選擇采用酶解時(shí)間為3、4、5 h三個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.3 酶解溫度對刺梨多糖得率的影響 由圖3所示，隨著酶解溫度的上升，刺梨多糖得率先逐步上升，當(dāng)溫度達(dá)到40 ℃時(shí)，刺梨多糖得率達(dá)到最高點(diǎn)，然后隨著溫度的繼續(xù)上升（40~70 ℃），多糖得率呈顯著性降低（P<0.05）。這一研究結(jié)果與呂長鑫[22]等一致，這說明試驗(yàn)所選用的纖維素酶在40 ℃左右時(shí)具有最佳的作用溫度，此時(shí)酶的活性最大，有利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行。當(dāng)溫度過高時(shí)，纖維素酶中心位點(diǎn)因?yàn)槭軣崾ピ械幕钚远鴮?dǎo)致催化能力下降；溫度過低時(shí)，酶活性同樣也會(huì)因?yàn)槭艿揭种贫茈y發(fā)揮較好的水解作用。其中，當(dāng)溫度由70 ℃上升到80 ℃時(shí)，刺梨多糖得率有一個(gè)顯著性的提高過程，這可能是由于80 ℃是熱水浸提工藝中較適宜的一個(gè)浸提溫度的原因，這也與我們前期的試驗(yàn)結(jié)果吻合。因此，在接下來的響應(yīng)面試驗(yàn)中，選擇酶解溫度30、40、50 ℃三個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)。

圖 3 酶解溫度對刺梨多糖得率的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the yield of RRTP

圖 4 酶添加濃度對刺梨多糖得率的影響Fig.4 Effect of enzyme dosage on the yield of RRTP

2.1.4 酶添加濃度對刺梨多糖得率的影響 由圖4所示。隨著酶用量的增加，刺梨多糖得率先顯著提高（P<0.05），后略有下降，在酶添加濃度為1.5%時(shí)，刺梨多糖得率達(dá)到最高5.84%。這可能是因?yàn)殡S著纖維素酶用量的增加，酶接觸底物的機(jī)會(huì)相應(yīng)地增加，酶對細(xì)胞壁的水解作用促進(jìn)了多糖的溶出，從而提高多糖的產(chǎn)量，這與Hu等[23]的研究一致。當(dāng)酶用量足夠與底物進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，進(jìn)一步增加酶用量不僅不能提高多糖得率，反而過量的酶會(huì)在造成提取成本升高的同時(shí)可能造成多糖的部分水解，進(jìn)而導(dǎo)致刺梨多糖得率降低。因此，在接下來的響應(yīng)面試驗(yàn)中，選擇酶添加濃度1.0%、1.5%、2.0%三個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2 酶法輔助熱水浸提刺梨多糖響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 刺梨多糖得率預(yù)測模型及方差分析 根據(jù)前面的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按照表1中的設(shè)計(jì)因素和水平，利用Design-Expert V8.0.6軟件，根據(jù)BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。BBD試驗(yàn)的變量值與相應(yīng)的刺梨多糖得率試驗(yàn)結(jié)果見表2。經(jīng)回歸擬合，四個(gè)提取變量（A、B、C、D）與刺梨多糖得率的關(guān)系可表示為如下的二次多項(xiàng)式方程：

表 2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Benhnken experiment

Y=6.10+0.31A?0.061B+8.333E?004C+0.027D+0.043AB+0.080AC+0.098AD?0.16BC+0.045BD?0.047CD?0.055A2?0.33B2?0.40C2?0.24D2

表3 為對上述方程進(jìn)行方差分析的結(jié)果。

由表3的分析結(jié)果可知，模型具有較大的F值（F=45.32），同時(shí)具有非常低的P值（P<0.0001），說明該預(yù)測模型差異極顯著，以上二次多項(xiàng)式方程與實(shí)際情況擬合很好，能夠較好的反應(yīng)刺梨多糖得率與所選實(shí)驗(yàn)因素之間的相互關(guān)系。失擬項(xiàng)的F=1.25，P=0.4479>0.05，差異不顯著，說明模型與所選試驗(yàn)因素之間具有很好的擬合度。同時(shí)，模型決定系數(shù)R2=0.9784，變異系數(shù)C.V.=1.22%，精密度=21.988>4，表明此模型能夠預(yù)測97.84%的刺梨多糖得率的變化，僅存在1.22%的變異，模型精密度高，試驗(yàn)結(jié)果可靠性較好，可以用此模型來分析和預(yù)測酶法輔助熱水浸提刺梨多糖的提取工藝。模型結(jié)果顯示，試驗(yàn)因素酶解pH對刺梨多糖得率影響極其顯著（P<0.001），酶解時(shí)間高度顯著（P<0.01），影響酶法輔助熱水浸提刺梨多糖得率的因素大小順序?yàn)椋好附鈖H（A）>酶解時(shí)間（B）>酶添加濃度（D）>酶解溫度（C）。交互項(xiàng)AC、AD對刺梨多糖得率影響均顯著（P<0.05），BC高度顯著（P<0.01），二次項(xiàng)B2、C2、D2極其顯著（P<0.001），表明各影響因素之間存在著明顯的共同作用，影響著刺梨多糖的最終得率。

表 3 響應(yīng)面模型方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

2.2.2 響應(yīng)面曲面及因素交互作用分析 如圖5所示，三維響應(yīng)面圖可以非常直觀的反映酶解pH、酶解時(shí)間、酶解溫度和酶添加濃度等影響因素及其相互作用對于響應(yīng)值刺梨多糖得率的影響，即當(dāng)其中兩個(gè)影響因素在試驗(yàn)范圍內(nèi)逐步變化時(shí)，將另外兩個(gè)因素固定在中心點(diǎn)，刺梨多糖得率將隨著這兩個(gè)影響因素的變化而變化將直觀地展示在三維立體圖中。從圖5中三維立體圖可以看出，圖5b、圖5c、圖5f的三維曲面圖相對于其他幾個(gè)圖更為陡峭，且圖中的等高線形狀為橢圓形，表明圖形對應(yīng)的兩組影響因子交互作用更為明顯，其對刺梨多糖得率的影響更顯著，而圖5a、圖5d、圖5f投影的等高線形狀為圓形，說明圖中對應(yīng)的兩組影響因子交互作用不顯著，這一結(jié)果與表3中的方差分析結(jié)果一致。

圖 5 不同因素交互作用對刺梨多糖得率影響的三維響應(yīng)面圖Fig.5 3D-response surface plots of the interaction of different variables on the yield of RRTP

2.2.3 回歸模型優(yōu)化 根據(jù)回歸模型計(jì)算，在酶解pH6.2，酶解時(shí)間3.97 h，酶解溫度40.93 ℃，酶添加濃度1.62%，酶解反應(yīng)完成后90 ℃熱水浸提3 h的工藝條件下，預(yù)測刺梨多糖得率為6.37%。為驗(yàn)證預(yù)測模型可信度，同時(shí)考慮便于實(shí)際操作的需要，將提取工藝參數(shù)設(shè)置為：酶解pH6.2，酶解時(shí)間4 h，酶解溫度41 ℃，酶添加濃度1.62%。經(jīng)信度符合性檢驗(yàn)，驗(yàn)證試驗(yàn)中刺梨多糖得率為6.32%±0.12%（n=3），與模型預(yù)測的刺梨多糖得率契合度為99.22%，這一結(jié)果中，刺梨多糖得率幾乎達(dá)到超聲提取[15]的3倍。因此，確定該回歸模型可用于預(yù)測刺梨多糖的提取，同時(shí)該提取方法對刺梨多糖的提取具有提取效率高、環(huán)保綠色等優(yōu)點(diǎn)。

2.3 刺梨多糖抗腫瘤試驗(yàn)結(jié)果

由表4的試驗(yàn)結(jié)果可知，酶法輔助熱水浸提的刺梨多糖在一定劑量下具有較好的抗腫瘤效果，當(dāng)采用中等劑量治療時(shí)，對腫瘤小鼠的抑瘤效果最好。其中，刺梨多糖試驗(yàn)組與CTX組相比，白細(xì)胞、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著升高（P<0.01），表現(xiàn)出更優(yōu)的腫瘤小鼠免疫能力提升作用。前人研究表明，CTX是在臨床上廣泛應(yīng)用的廣譜抗腫瘤藥物，可對腫瘤產(chǎn)生細(xì)胞毒素作用，對抑制腫瘤生長具有較好的效果[24]。然而，CTX在應(yīng)用過程中同時(shí)也存在著諸多毒副作用，如導(dǎo)致白細(xì)胞減少[25]，肝功能障礙[26]以及尿血或排尿困難[27]等。從CTX組與CT組的對比數(shù)據(jù)可知，CTX組的白細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P<0.01），胸腺指數(shù)（P<0.05）和脾臟指數(shù)（P<0.01）也顯著下降，這一結(jié)果與前人的研究基本一致。從抑制腫瘤的效果來看，MPS組的抑瘤率達(dá)52.13%，達(dá)到了CTX組的83.65%，同時(shí)M-PS組的白細(xì)胞數(shù)相對于CT顯著升高（P<0.01），而胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)基本接近，分析原因可能是M-PS組在提升腫瘤小鼠免疫能力的同時(shí)，對胸腺和脾臟等免疫器官的毒副作用相對較小，而L-PS組的藥力效果相對較小，從而最終造成M-PS組的抑瘤率大于H-PS組和L-PS組。

表 4 刺梨多糖對荷S180小鼠抑瘤作用、外周血白細(xì)胞及其臟器的影響Table 4 Effect of PPRT on tumor inhibition, peripheral blood leucocyte and viscera index on S180 tumor-bearing mice

3 結(jié)論

本文采用響應(yīng)面法對酶法輔助熱水浸提刺梨多糖提取工藝進(jìn)行研究，得到最優(yōu)工藝參數(shù)：酶解pH6.2，酶解時(shí)間4 h，酶解溫度41 ℃，酶添加濃度1.62%，液料比30:1 mL/g，酶解反應(yīng)完成后90 ℃熱水浸提3 h。此工藝條件下，預(yù)測刺梨多糖得率為6.37%。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證刺梨多糖得率為6.32%±0.12%，與模型預(yù)測得率契合度為99.22%，結(jié)果表明回歸模型準(zhǔn)確可靠?？鼓[瘤活性研究表明，在灌胃劑量為200 mg/kg時(shí)，酶法輔助熱水浸提刺梨多糖對S180腫瘤小鼠的抑瘤率為52.13%±1.84%，具有明顯的抗腫瘤活性和一定提升腫瘤小鼠免疫能力的作用，具有作為功能性食品添加或天然抗腫瘤藥物來源的潛力。同時(shí)，該工藝尚存在著后期處理過程中浸提時(shí)間過長的問題，以微波或超聲輔助提取來改進(jìn)提取工藝將是未來的研究方向，但也應(yīng)關(guān)注工藝的變化對多糖活性造成的影響。