吳鴻，高海霞，高水波，王新洲，韓麗華，王振濤

河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院／河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450002

益氣活血方（yiqi huoxue decoction，YHD）是復(fù)方制劑，由黃芪、人參、赤芍、紅花等藥組成，臨床廣泛用于冠心病等心血管疾病的治療［1］。前期研究發(fā)現(xiàn)，YHD具有抗血小板聚集［2－3］、抑制左室重構(gòu)［4－5］、促進血管新生［6－7］等作用，提示YHD具有良好的心肌保護功能。研究發(fā)現(xiàn)，缺氧可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡［8－9］，抗凋亡蛋白Bcl－2表達(dá)下調(diào)，促凋亡蛋白Bax表達(dá)上調(diào)［10－11］，而半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase－3）的激活被認(rèn)為是細(xì)胞發(fā)生凋亡重要的標(biāo)志［12－13］。YHD對缺氧心肌的保護作用是否涉及到細(xì)胞凋亡尚未見報道。本實驗通過過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)體外培養(yǎng)大鼠H9c2心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，觀察YHD對心肌細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料

1.1 細(xì)胞大鼠心肌細(xì)胞H9c2購自中科院上海細(xì)胞庫，批號：GNR 5。

1.2 藥物與試劑YHD（由黃芪、人參、紅花、赤芍組成，四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司，批號：0029912783）；辛伐他?。╯imvastation，ST）（美國Sigma公司，批號：S6196）。DMEM高糖培養(yǎng)基（以色列BI公司，批號：06－1055－57－1ACS）；胰蛋白酶（以色列BI公司，批號：03－050－1ACS）；胎牛血清（美國Gibco公司，批號：16000－044）；H2O2（美國Sigma公司，批號：88597）；四氮唑藍(lán)（MTT）（美國Sigma公司，批號：N6876）；二甲基亞砜（DMSO）（美國Sigma公司，批號：D2650）；AnnexinV－FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自蘇州碧云天生物技術(shù)有限公司（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：C1062M）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，P0012）；SDS－PAGE凝膠試劑盒（西安晶彩生物公司，批號：JC－PE022）；ECL發(fā)光液（西安晶彩生物公司，批號：JC－PC022）；Bcl－2抗體（武漢三鷹生物公司，批號：12789－1－AP）；Bax抗體（武漢三鷹生物公司，批號：50599－2－Ig）；Caspase－3抗體（武漢三鷹生物公司，批號：66470－2－Ig）；β－actin抗體（武漢三鷹生物公司，批號：66009－1－Ig）；羊抗鼠二抗（武漢三鷹生物公司，批號：SA00001－1）；羊抗兔二抗（武漢三鷹生物公司，批號：SA00001－2）。

1.3 儀器生物安全柜（美國賽默飛公司，型號：1384－A2）；二氧化碳培養(yǎng)箱（美國賽默飛公司，型號：3111）；酶標(biāo)儀（美國賽默飛公司，型號：MULTISKAN FC）；SDS－PAGE凝膠系統(tǒng)（美國Bio－Rad公司，型號：Mini－PROTEAN）；半干轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio－Rad公司，型號：Trans－Blot SD）；Western blot成像系統(tǒng)（美國Bio－Rad公司，型號：ChemiDoc XRS＋）；Incu Cyte Zoom活細(xì)胞成像及分析系統(tǒng)（美國Essen Bio Science公司，型號：40733）。

2 方法

2.1 YHD的制備將YHD顆粒研磨至粉末狀，實驗前加PBS緩沖液，加熱超聲溶解，用0.22μm濾膜過濾后制成200 g·L－1YHD藥液（相當(dāng)于3 g生藥·mL－1），4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實驗分組H9c2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃含5%CO2培養(yǎng)箱中。將狀態(tài)良好的H9c2細(xì)胞以每孔1×106個接種于6孔板中分為4組，并做如下干預(yù)：①空白對照組（Ctrl）：H9c2細(xì)胞正常培養(yǎng)；②模型組（H2O2）：H9c2細(xì)胞培養(yǎng)液中加H2O2（200μmol·L－1）作用6 h；③YHD組：H9c2細(xì)胞用YHD（0.75 g·L－1）培養(yǎng)16 h后加H2O2（200μmol·L－1）繼續(xù)作用6 h；④ST組：H9c2細(xì)胞用ST（5μmol·L－1）培養(yǎng)16 h后加H2O2（200μmol·L－1）繼續(xù)作用6 h。以下實驗分組及藥物干預(yù)同此方法，且每次實驗重復(fù)3次。

2.3 MTT法測定H9c2細(xì)胞活力將H9c2細(xì)胞以每孔1×104個接種在96孔板中，每組3個復(fù)孔，經(jīng)上述不同處理后，每孔加MTT液10μL（5 g·L－1），37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸除培養(yǎng)液，每孔加入150μL DMSO，振蕩10 min，于490 nm波長檢測各孔吸光度（A）值。對照組不加處理因素，細(xì)胞活力以100%計算；空白對照不加細(xì)胞，僅加相同體積細(xì)胞培養(yǎng)液。

細(xì)胞存活率＝（實驗組A值－空白對照A值）／（對照組A值－空白對照A值）×100%

2.4 AnnexinV－FITC檢測H9c2細(xì)胞凋亡率將各組H9c2細(xì)胞以每孔1×104個接種在96孔板中，按照方法2.2分為Ctrl組、H2O2組、YHD組及ST組，每組3個復(fù)孔，并做相應(yīng)干預(yù)。干預(yù)結(jié)束后，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗3次，每孔加入195μL AnnexinV－FITC結(jié)合液，5μL AnnexinV－FITC，輕輕混勻，再加入10μL碘化丙啶染液（PI），混勻，37℃避光孵育15 min，在實時熒光顯微鏡下觀察，AnnexinV－FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

2.5 Western Blot法檢測凋亡蛋白Bcl－2、Bax及Caspase－3蛋白表達(dá)將狀態(tài)良好的H9c2細(xì)胞以每孔1×106個接種于6孔板中，按照方法2.2分為Ctrl組、H2O2組、YHD組及ST組，并做相應(yīng)干預(yù)。干預(yù)結(jié)束后，收集各組H9c2細(xì)胞于1.5 mL EP管中，離心，棄上清，PBS洗3次，每管中加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，離心取上液，BCA法測蛋白濃度，用裂解液調(diào)整蛋白濃度，加蛋白loading buffer加熱進行變性，每孔上樣10μL。電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入相應(yīng)的一抗、二抗、ECL顯色。采用Image Lab 3.0軟件對免疫印跡圖的灰度值分析。本實驗重復(fù)3次。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對H 2 O2處理后H9c2細(xì)胞活力的影響與空白對照組比較，模型組H9c2細(xì)胞活力明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，YHD組與ST組H9c2細(xì)胞活力明顯增加（P＜0.05）。提示YHD對缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷有一定的保護作用。見圖1。

圖1 YHD對H2 O2處理后H9c2細(xì)胞活力的影響

3.2 對H 2O2誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞凋亡的影響與空白對照組比較，模型組H9c2細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞偽足收縮，細(xì)胞膜破裂。與空白對照組比較，模型組凋亡顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，YHD組及ST組凋亡明顯減少（P＜0.05），見表1、圖2。

表1 對H 2 O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡的影響 （xˉ±s）

圖2 對H 2 O2誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞凋亡的影響

3.3 對H 2 O2誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞Bcl－2、Bax及Caspase－3表達(dá)的影響與空白對照組比較，模型組H9c2細(xì)胞Bcl－2／Bax水平明顯降低（P＜0.05），Caspase－3蛋白表達(dá)明顯（P＜0.05）；與模型組比較，YHD組及ST組H9c2細(xì)胞Bcl－2／Bax水平明顯升高（P＜0.05），Caspase－3蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05）。見圖3。

圖3 對H 2 O2誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞Bcl－2、Bax及Caspase－3表達(dá)的影響

4 討論

YHD是本研究團隊治療心血管疾病的經(jīng)驗方，臨床上對于胸痹心痛氣虛血瘀型患者有較好的治療效果［1］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，YHD具有抗炎［16－17］、抗血小板聚集［18－19］和促進血管新生［6－7］的作用。研究表明，方中黃芪、紅花、人參、赤芍均具有抗氧化的作用［20－23］。本實驗采用H2O2刺激H9c2心肌細(xì)胞，構(gòu)建心肌細(xì)胞凋亡模型，以探究YHD抗氧化損傷的保護心肌作用。

心肌細(xì)胞缺血缺氧后，造成高水平氧化應(yīng)激，進而引發(fā)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致心肌壞死，發(fā)生嚴(yán)重的心血管事件。細(xì)胞凋亡是由多種基因控制參與的主動過程，其中Bcl－2、Bax是重要的調(diào)控因子，當(dāng)Bcl－2／Bax水平降低時，觸發(fā)下游凋亡信號，激活Caspase－3。Caspase－3是細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者，引起DNA降解、細(xì)胞核碎裂等，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生［24］。研究表明，YHD提取物黃芪多糖可以提高缺血性心肌病患者心功能［25］，黃芪甲苷可以抑制心力衰竭大鼠心肌纖維化［26］；人參活性成分可以抑制糖尿病心肌病心肌細(xì)胞凋亡保護心臟功能［27］；紅花提取物對病毒性心肌炎小鼠具有保護作用［28］。另外，YHD類似的益氣活血中藥可以抑制糖尿病心肌病大鼠心肌細(xì)胞凋亡［29］。以上研究結(jié)果表明，YHD提取物及類似組方具有抑制缺血性心肌病、病毒性心肌炎、糖尿病心肌病心肌細(xì)胞凋亡的保護作用。本研究用一定濃度（200μmol·L－1）的H2O2處理H9c2心肌細(xì)胞，得到心肌細(xì)胞凋亡模型。ST對缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷有保護作用［14－15］，選用ST作為陽性對照組。

本研究發(fā)現(xiàn)，YHD能夠?qū)笻2O2引起的H9c2心肌細(xì)胞活力降低，明顯降低心肌細(xì)胞凋亡率。同時能明顯升高Bcl－2／Bax水平，下調(diào)Caspase－3蛋白表達(dá)。因此，YHD預(yù)處理可明顯抑制H2O2誘導(dǎo)的大鼠H9c2心肌細(xì)胞凋亡，今后將進一步來闡明YHD抗心肌細(xì)胞凋亡的作用機制。