王霖，孫增濤，張召楊，劉偉，郭思佳，張虹

1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300250

腫瘤已成為目前威脅人類健康的主要?dú)⑹种?，其中肺癌是全球癌癥引起死亡最常見的原因之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)城市居民惡性腫瘤的發(fā)病率及死亡率，肺癌位于首位［1］。順鉑是臨床最常用的含鉑類抗腫瘤藥物之一，主要通過抑制DNA合成、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)殺傷腫瘤細(xì)胞［2］。然而，順鉑的免疫抑制作用也不容忽視。研究表明，順鉑可以抑制T細(xì)胞等免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，進(jìn)一步引發(fā)腫瘤微環(huán)境中Th1／Th2失衡，破壞人體免疫調(diào)節(jié)功能［3］。Th1／Th2失衡是腫瘤免疫的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要作用［4］。

中醫(yī)藥治療疾病本著“治病求本”的原則，強(qiáng)調(diào)“整體觀念”和“辨證論治”［5］。治療肺癌的過程中更注重患者的主觀感受，始終以“癥狀”為靶標(biāo)。雖然消瘤作用較弱，但通過調(diào)節(jié)機(jī)體，可穩(wěn)定瘤體、緩解癥狀、增強(qiáng)體質(zhì)、提高患者的生存質(zhì)量、延長(zhǎng)生存期，達(dá)到長(zhǎng)期“帶瘤生存”的目的［6］。在中醫(yī)整體觀思想指導(dǎo)下，探討中藥復(fù)方對(duì)機(jī)體免疫功能的影響。研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥可以通過逆轉(zhuǎn)Th1／Th2失衡狀態(tài)，達(dá)到抗腫瘤［7－8］的作用。本研究以益氣溫陽(yáng)方聯(lián)合順鉑干預(yù)Lewis肺癌荷瘤小鼠，觀察其對(duì)腫瘤的抑制作用及對(duì)Th1、Th2相關(guān)細(xì)胞因子的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物及細(xì)胞SPF級(jí)雄性C57BL／6小鼠32只，體質(zhì)量（18.0±2.0）g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SYXK（津）：2019－0002。飼養(yǎng)于室溫（25±2）℃，濕度50%～60%的條件下，給予無(wú)菌飼料及無(wú)菌水。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和操作經(jīng)過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核，倫理批號(hào)：IRMDWLL－2019140。小鼠Lewis肺癌瘤株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。

1.2 藥物與試劑益氣溫陽(yáng)方（由黃芪、肉蓯蓉、淫羊藿、黨參、薏苡仁、莪術(shù)、虎杖、雞內(nèi)金、桔梗、甘草組成，天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥房提供）；順鉑注射液（齊魯制藥有限公司，批號(hào)：8K029A89）；白細(xì)胞介素－2（interleukin－2，IL－2）、白細(xì)胞介素－4（interleukin－4，IL－4）、白細(xì)胞介素－10（interleukin－10，IL－10）、干擾素－γ（interferon－γ，IFN－γ）ELISA試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，貨號(hào)分別為：CSB－E04627m、CSB－E04634m、CSB－E04594m、CSB－E04578m）；胎牛血清（武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號(hào)：164210）；RPMI 1640培 養(yǎng) 基（Thermo Fisher Scientific，貨 號(hào)：11875101）。

1.3 儀器MCO－175型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司）；MP502型電子天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；ECLIPSE TS100型光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司）。

2 方法

2.1 藥物的制備益氣溫陽(yáng)方由天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥房將藥物制成顆粒劑，用蒸餾水配置成含生藥2 g·mL－1的藥液，4℃保存；順鉑注射液經(jīng)生理鹽水配置含順鉑0.4 g·L－1的藥液。

2.2 小鼠Lewis肺癌細(xì)胞體外培養(yǎng)細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)取液氮保存的小鼠Lewis肺癌瘤株37℃水浴融化，加入完全培養(yǎng)液（89%1640培養(yǎng)液＋10%胎牛血清＋1%青霉素／鏈霉素），于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日換液，融合至80%左右時(shí)用胰酶消化傳代，3 d傳代1次。

2.3 小鼠分組及模型建立將培養(yǎng)后的Lewis細(xì)胞用胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度至約1×107mL－1。每只小鼠接種前，充分搖勻瘤細(xì)胞懸液，于小鼠右腋窩皮下接種瘤細(xì)胞懸液0.2 mL，30 min內(nèi)接種完畢。

造模結(jié)束后給藥，將32只小鼠分為4組，即模型組、益氣溫陽(yáng)方組（20 g·kg－1）、順鉑組（4 mg·kg－1）及聯(lián)合用藥組（益氣溫陽(yáng)方＋順鉑），每組8只，連續(xù)給予相應(yīng)的藥物12 d。模型組給予同體積的生理鹽水模型組：每天灌胃生理鹽水0.4 mL，連續(xù)12 d；順鉑組：第1天、第3天、第5天每只小鼠腹腔注射順鉑注射液0.2 mL。

2.4 檢測(cè)小鼠血清IL－2、IL－4、IL－10及IFN－γ水平采用摘眼球法取小鼠血液，靜置后，離心，取上清，ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠血清中IL－2、IL－4、IL－10及IFN－γ水平。

2.5 計(jì)算抑瘤率、胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)小鼠取血后將其頸椎脫臼處死。取材時(shí)，將瘤組織取出后，先進(jìn)行拍照，后置于生理鹽水中稍稍漂洗殘血，稱重并記錄數(shù)據(jù)。收集小鼠胸腺及脾臟，置于生理鹽水中稍稍漂洗殘血，稱重并記錄數(shù)據(jù)。按以下公式計(jì)算抑瘤率、胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)。

抑瘤率＝［模型組平均瘤質(zhì)量（g）－實(shí)驗(yàn)組平均瘤質(zhì)量（g）］／模型組平均瘤質(zhì)量（g）×100%

胸腺指數(shù)＝胸腺質(zhì)量（mg）／體質(zhì)量（g）；脾臟指數(shù)＝脾臟質(zhì)量（mg）／體質(zhì)量（g）。

2.6 對(duì)小鼠腫瘤組織形態(tài)學(xué)變化的影響將腫瘤組織于10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋、切片，按HE染色的步驟進(jìn)行操作。置于光鏡下觀察腫瘤組織形態(tài)變化。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One－Way ANOVA），方差齊時(shí)選用LSD法，方差不齊時(shí)選Dunnett′s法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)小鼠瘤質(zhì)量及抑瘤率的影響與模型組比較，益氣溫陽(yáng)方組、順鉑組、聯(lián)合用藥組小鼠瘤質(zhì)量均顯著降低（P＜0.01）；與順鉑組比較，聯(lián)合用藥組小鼠瘤質(zhì)量顯著降低（P＜0.01），抑瘤效果最佳。益氣溫陽(yáng)方組，順鉑組及聯(lián)合用藥組抑瘤率分別為39.52%、61.23%、74.51%。見表1、圖1。

圖1 小鼠的移植瘤

表1 對(duì)小鼠瘤質(zhì)量及抑瘤率的影響 （±s）

表1 對(duì)小鼠瘤質(zhì)量及抑瘤率的影響 （±s）

注：與模型組比較，**P＜0.01；與順鉑組比較，△△P＜0.01

組別 n 瘤質(zhì)量（m／g） 抑瘤率／%模型組8 1.56±0.17－益氣溫陽(yáng)方組 8 0.70±0.18** 39.52順鉑組 8 0.44±0.09** 61.23聯(lián)合用藥組 8 0.29±0.08**△△74.51

3.2 對(duì)小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的影響與模型組比較，順鉑組小鼠胸腺指數(shù)顯著降低（P＜0.01）；與順鉑組比較，聯(lián)合用藥組小鼠胸腺指數(shù)顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，順鉑組小鼠脾臟指數(shù)顯著降低（P＜0.01），聯(lián)合用藥組小鼠脾臟指數(shù)明顯降低（P＜0.05）；與順鉑組比較，聯(lián)合用藥組小鼠脾臟指數(shù)顯著升高（P＜0.01）。見表2。

表2 對(duì)小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的影響（±s）

表2 對(duì)小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的影響（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與順鉑組比較，△P＜0.01，△△P＜0.01

組別 n 胸腺指數(shù) 脾臟指數(shù)模型組8 1.98±0.25 4.51±0.88益氣溫陽(yáng)方組 8 2.08±0.15 5.21±0.78順鉑組 8 1.28±0.43** 3.09±0.23**聯(lián)合用藥組 8 2.27±0.34△△ 3.78±0.36*△△

3.3 對(duì)小鼠腫瘤組織病理學(xué)變化的影響模型組小鼠腫瘤組織未見明顯壞死區(qū)域，免疫細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯，益氣溫陽(yáng)方組、西藥組、聯(lián)合用藥組小鼠腫瘤組織均可見明顯壞死區(qū)域，免疫細(xì)胞浸潤(rùn)增多。見圖2。

圖2 小鼠腫瘤組織病理學(xué)變化（HE）

3.4 對(duì)小鼠Th1相關(guān)細(xì)胞因子IL－2、IFN－γ水平的影響與模型組比較，益氣溫陽(yáng)方組、聯(lián)合用藥組小鼠血清IL－2、IFN－γ水平均明顯升高（P＜0.05）；與順鉑組比較，聯(lián)合用藥組小鼠血清IL－2、IFN－γ水平均顯著升高（P＜0.01）。見表3。

表3 對(duì)小鼠Th1相關(guān)細(xì)胞因子IL－2、IFN－γ水平的影響 （xˉ±s，ng·L－1）

3.5 對(duì)小鼠Th2相關(guān)細(xì)胞因子IL－4、IL－10水平的影響與模型組比較，益氣溫陽(yáng)方組小鼠血清IL－4、IL－10小鼠血清水平均明顯降低（P＜0.05），聯(lián)合用藥組小鼠血清IL－4、IL－10水平均顯著降低（P＜0.01）；與順鉑組比較，聯(lián)合用藥組小鼠血清IL－4、IL－10水平均顯著降低（P＜0.01）。見表4。

表4 對(duì)小鼠Th2相關(guān)細(xì)胞因子IL－4、IL－10表達(dá)水平的影響 （xˉ±s，ng·L－1）

4 討論

中國(guó)惡性腫瘤新發(fā)病例約430萬(wàn)例，死亡病例約300萬(wàn)例，分別約占全球的23.7%和30%，發(fā)病率和死亡率均高于全球平均水平［9］。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的一個(gè)重要原因就是人口老齡化。我國(guó)是目前世界上老齡化進(jìn)程較快，老年人口數(shù)量最多的國(guó)家［10］。2015年我國(guó)分地區(qū)惡性腫瘤發(fā)病和死亡數(shù)據(jù)顯示，惡性腫瘤的發(fā)病率從40歲以后均呈指數(shù)增長(zhǎng)，其中肺癌的發(fā)病率和死亡率最高［11］。隨著人口老齡化的加劇，惡性腫瘤逐漸變成人類衛(wèi)生健康的一個(gè)重要負(fù)擔(dān)。因此，腫瘤既是一種“慢性病”，也是一種“老年病”。晚期肺癌患者常接受化療，化療藥物多寒涼、毒性大，亦損傷人體正氣，造成機(jī)體虛寒，陽(yáng)氣虛弱［12］。中醫(yī)治療腫瘤也多以“清熱解毒”“以毒攻毒”“活血化瘀”為主，易損傷人體正氣且療效有限。老年體虛，本不耐攻伐。因此，在治療肺癌過程中，應(yīng)以益氣溫陽(yáng)扶助正氣，增強(qiáng)機(jī)體自身免疫功能以達(dá)到抗腫瘤的目的。

近些年腫瘤的研究熱點(diǎn)“免疫療法”逐漸認(rèn)識(shí)到腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體的免疫功能失調(diào)密切相關(guān)，強(qiáng)調(diào)惡性腫瘤不應(yīng)完全以消除瘤體為目的，調(diào)動(dòng)機(jī)體自身的免疫機(jī)能對(duì)抗腫瘤是治療腫瘤的關(guān)鍵［13］。《黃帝內(nèi)經(jīng)》有云“正氣存內(nèi)，邪不可干，邪之所湊，其氣必虛”，主張“養(yǎng)正積自除”“衰其大半而止”，二者理論不謀而合。研究表明，扶正類中藥可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等重要免疫細(xì)胞活化、調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，防止腫瘤細(xì)胞免疫逃逸，從而發(fā)揮抗腫瘤作用［14－18］。

益氣溫陽(yáng)方是天津中醫(yī)藥大學(xué)孫增濤教授基于多年的臨床經(jīng)驗(yàn)和本課題組前期的證候調(diào)查結(jié)果擬定的成方。益氣溫陽(yáng)方以黃芪、淫羊藿、肉蓯蓉三者共為君藥，具有溫陽(yáng)散寒、補(bǔ)氣健脾、益衛(wèi)固表的功效；臣藥以黨參、薏苡仁，二者共奏培土生金、補(bǔ)益肺脾之效；佐以莪術(shù)行氣破血、消癥止痛，虎杖祛風(fēng)利濕、散瘀定痛、止咳化痰，二者寓意攻補(bǔ)兼施，起到補(bǔ)益、消瘤的雙重作用；雞內(nèi)金健胃消食、固護(hù)脾胃，以防滋膩礙胃，并助化源；桔梗引諸藥上行肺經(jīng)，以助藥力，與甘草共為使藥。全方溫而不燥、補(bǔ)而不峻、寓攻于補(bǔ)。本研究結(jié)果顯示，順鉑聯(lián)合益氣溫陽(yáng)方可增強(qiáng)順鉑抑制腫瘤的作用，還可改善Lewis荷瘤小鼠因化療出現(xiàn)的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)等免疫指標(biāo)的下降。提示益氣溫陽(yáng)方可以抑制腫瘤生長(zhǎng)，提高小鼠的免疫功能，聯(lián)合順鉑可以起到協(xié)同作用。

在機(jī)體抗腫瘤的免疫反應(yīng)中，輔助性T細(xì)胞在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著重要角色［19］，而Th1和Th2是輔助性T細(xì)胞最重要的兩個(gè)亞群［20］。Th1細(xì)胞分泌IL－2、IFN－γ等細(xì)胞因子，主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)和遲發(fā)型超敏反應(yīng)，對(duì)外源性病原體和腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起到免疫防御作用。Th2細(xì)胞分泌IL－4、IL－10等細(xì)胞因子，主要參與體液免疫及變態(tài)反應(yīng)等，與Th1細(xì)胞存在著拮抗作用，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)［21］。正常生理狀況下，Th1、Th2細(xì)胞存在著動(dòng)態(tài)平衡，維持正常的機(jī)體的免疫功能。一旦Th1／Th2平衡狀態(tài)發(fā)生紊亂，當(dāng)Th1型細(xì)胞因子分泌減少，而Th2型細(xì)胞因子分泌增多，惡性腫瘤的免疫逃逸就很可能會(huì)發(fā)生［22］。研究表明，Th1型細(xì)胞因子水平降低和或Th2型細(xì)胞因子水平升高與腫瘤惡性程度、預(yù)后不良密切相關(guān)［23］。

研究表明，中醫(yī)藥可以改善Th1／Th2偏移，增加Th1型細(xì)胞或者減少Th2細(xì)胞，參與抗腫瘤免疫［24］。研究發(fā)現(xiàn)，芪玉三龍湯可以升高荷瘤小鼠血清中IL－2、IFN－γ水平，降低IL－4、IL－10水平，調(diào)控Th1／Th2動(dòng)態(tài)平衡，改善免疫功能［25］。通過臨床收集中藥聯(lián)合化療治療肺癌合并惡性胸腔積液患者，檢驗(yàn)血清發(fā)現(xiàn)，葶藶澤漆湯可以同時(shí)影響Th1、Th2型細(xì)胞因子的變化，通過升高IL－2水平、降低IL－4水平，改善Th1／Th2平衡狀態(tài)［26］。人參提取物人參皂苷Rg3可以抑制腫瘤血管生成，改善腫瘤患者血清Th1／Th2細(xì)胞失衡，輔助放療起到增效減毒的作用［27］。本研究結(jié)果顯示，益氣溫陽(yáng)方可顯著升高Lewis荷瘤小鼠血清IL－2、IFN－γ水平，降低IL－4、IL－10水平，增強(qiáng)Th1細(xì)胞功能并降低Th2功能，改善Th1／Th2的動(dòng)態(tài)平衡。

綜上所述，益氣溫陽(yáng)方對(duì)腫瘤生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，聯(lián)用順鉑可以提高療效、減輕順鉑不良反應(yīng)，效果優(yōu)于單用順鉑。益氣溫陽(yáng)方聯(lián)合順鉑可以升高小鼠血清IL－2、IFN－γ水平，降低IL－4、IL－10水平，提示益氣溫陽(yáng)方聯(lián)合順鉑可以調(diào)節(jié)Th1、Th2相關(guān)細(xì)胞因子，從而逆轉(zhuǎn)Th1／Th2偏移，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的功能，以達(dá)到抗腫瘤的目的。