劉永華,王秀君,閻 峰,許文元,付運(yùn)星*
(1.漯河立蓓生物科技有限公司,河南 漯河 462300;2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院;3.鄭州市農(nóng)業(yè)行政綜合執(zhí)法支隊(duì))
試驗(yàn)飼料黃粉蟲蛋白飼料購自鄭州立蓓有限公司;D-半乳糖購自天津市凱通化學(xué)試劑有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒及Trizol試劑均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司;SuperReal熒光定量預(yù)混試劑購自天根生化科技有限公司。
75只30日齡的昆明小鼠。飼養(yǎng)環(huán)境:室溫(22±2)℃,濕度50%±10%,光照明暗各12 h,每日早8點(diǎn)晚6點(diǎn)投食換水,確保小鼠可以自由攝食和飲水,墊料每周更換兩次,保持衛(wèi)生狀態(tài),防止因衛(wèi)生狀況出現(xiàn)疾病。
為防止小鼠出現(xiàn)應(yīng)激,在適應(yīng)性喂養(yǎng)小鼠3 d后,將75只昆明小鼠分為A、B、C、D、E五組。其中A組為對照組,B組為模型組,C、D、E組為試驗(yàn)組,具體試驗(yàn)方法見表1試驗(yàn)小鼠的飼喂方案。分組后進(jìn)行造模即每日對試驗(yàn)組和模型組小鼠進(jìn)行皮下注射濃度為0.15 g/ml的D-半乳糖溶液(生理鹽水溶解)0.05 ml,在造模一周時間后觀察小鼠無應(yīng)激反應(yīng)則加大D-半乳糖溶液注射量,由最初的每天每只0.05 ml每周遞加0.02 ml注射量,連續(xù)8周。
表1 試驗(yàn)小鼠的飼喂方案
試驗(yàn)中使用到的設(shè)備與器材見表2。
表2 試驗(yàn)中使用到的設(shè)備
造模給藥后,取各組小鼠的腦、肝組織,提取腦、肝組織中的總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,試劑盒擴(kuò)增,qPCR法檢測小鼠肝臟組織中Nrf2、HO-1、GCLC和NQO1的mRNA相對表達(dá)水平,GAPDH為內(nèi)參。具體引物序列見表3。
表3 檢測基因所用引物序列
1.5.1 Trizol法提取RNA
Trizol是一種總RNA抽提試劑,含有異硫氰酸胍等物質(zhì),能夠迅速破碎細(xì)胞,抑制細(xì)胞釋放出核酸酶。
①剪取1 mg冰凍組織放入1.5 ml離心管并加入300 ul Trizol試劑靜置1h。
②使用研磨棒將組織研碎后加入100 ul氯仿和500 ul Trizol試劑后搖勻并靜置5 min后放入離心機(jī)離心,以徹底分離核蛋白復(fù)合體。離心機(jī)設(shè)定條件為12,000×g,15 minutes,4℃。
③吸取離心后的上清液400 ul加入1.5 ml離心管中后再加入400 ul異丙醇搖勻后放入離心機(jī)離心設(shè)定條件為12,000×g,15 minutes,4℃。注意全程轉(zhuǎn)移樣品時應(yīng)使用無RNA酶試驗(yàn)器材。
④除去上清液留下離心管底部沉淀,加入1 000 ul濃度為75%乙醇(無RNA酶水配置)后放入冰箱-20℃保存。
1.5.2 RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA
①存有RNA的離心管離心(12,000×g,5 minutes,4℃)后除去上清液并靜置5 min使酒精揮發(fā),再向其中加入無RNA酶水20~100 ul(視沉淀數(shù)量酌情添加),吹打混合均勻,要求一樣品一個槍頭,防止樣品污染。
②根據(jù)表格4配制反應(yīng)體系以除去樣品中的基因組DNA(gDNA)污染,混合均勻37℃孵育2 min,為預(yù)混樣1。
表4 預(yù)混樣1反應(yīng)體系
③根據(jù)表5配制反應(yīng)體系以進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄,為預(yù)混樣2。之后將預(yù)混樣1和預(yù)混樣2進(jìn)行混合。吹打混勻后進(jìn)行水浴加熱。要求42℃加熱1 h接著80℃加熱10 min,-20℃保存。
表5 預(yù)混樣2反應(yīng)體系
1.5.3 熒光定量PCR步驟
①配制反應(yīng)液20 ul規(guī)格加入八聯(lián)管中,離心后放入ABI 7500 PCR儀器檢測。配制所需溶液如表6。
表6 檢測反應(yīng)體系
②ABI 7500 PCR儀器程序的設(shè)定,如表7。
表7 儀器程序的設(shè)定
黃粉蟲蛋白對小鼠腦組織相關(guān)基因表達(dá)的影響結(jié)果見圖1,在檢測了各組小鼠腦組織中Nrf2、HO-1、GCLC和NQO1基因的mRNA表達(dá)水平后結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組小鼠Nrf2、HO-1、GCLC和NQO1的mRNA表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較,除黃粉蟲蛋白低劑量組Nrf2、HO-1和黃粉蟲蛋白中劑量組HO-1 mRNA表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)意義外,其余黃粉蟲蛋白低、中、高劑量組Nrf2、HO-1、GCLC和NQO1的表達(dá)均上調(diào)(P<0.05或P<0.01)。
圖1 小鼠腦組織Nrf2、HO-1、GCLC、NQO1基因表達(dá)量
黃粉蟲蛋白對小鼠肝組織相關(guān)基因表達(dá)的影響結(jié)果見圖2,在檢測了各組小鼠肝組織中Nrf2、HO-1、GCLC和NQO1基因的mRNA表達(dá)水平后結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組小鼠Nrf2、HO-1、Gclc和NQO1的mRNA表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較,除黃粉蟲蛋白低劑量組HO-1、Nrf2、NQO1表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)意義外,其余黃粉蟲蛋白低、中、高劑量組Nrf2、HO-1、Gclc和NQO1的表達(dá)均上調(diào)(P<0.05或P<0.01)。
圖2 小鼠肝組織Nrf2、HO-1、GCLC、NQO1基因表達(dá)量
氧化應(yīng)激指機(jī)體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)與抗氧化成分平衡發(fā)生崩壞后而引起的一系列適應(yīng)性反應(yīng)。ROS是在正常的生理過程中產(chǎn)生的,如果在無外界刺激源的條件下,機(jī)體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和消除是處于一種動態(tài)平衡的狀態(tài)下的。但是如果機(jī)體內(nèi)的ROS含量相對升高而機(jī)體無法及時將其清除,這就會使得機(jī)體組織中的過氧化水平明顯升高引發(fā)一系列反應(yīng)后導(dǎo)致機(jī)體受到損害。肝、腦的氧化應(yīng)激是其發(fā)生損傷、發(fā)展為疾病的重要機(jī)制之一,因此,抑制氧化應(yīng)激就成為防止肝腦損傷、疾病發(fā)生的一個有效途徑。
在對抗氧化的研究中,人們普遍認(rèn)為最為重要的內(nèi)源性抗氧化通路之一就是Nrf2-ARE信號通路。其中Nrf2是調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子,其靶基因編碼的蛋白具有抗氧化、解毒和抗炎等廣泛的細(xì)胞保護(hù)作用。而ARE是一種能編碼啟動子區(qū)域的多種解毒酶和細(xì)胞保護(hù)蛋白基因的增強(qiáng)子序列。正常生理狀態(tài)下,Nrf2通過與ECH聯(lián)合蛋白1(Keap1)特異性結(jié)合于細(xì)胞質(zhì)中,此時Nrf2的活性受到抑制,Nrf2蛋白是處于低水平的,這是因?yàn)镵eap1是一個Nrf2的E3泛素連接酶底物接頭,可導(dǎo)致蛋白酶體的快速降解。更重要的是,Keap1是含有高活性的半胱氨酸,一旦被活性氧(ROS)或其他親電試劑刺激時,就會阻止對Nrf2進(jìn)行蛋白酶體降解,從而導(dǎo)致Nrf2蛋白在氧化應(yīng)激下迅速積累,激活后的Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核,并與小肌肉腱膜纖維肉瘤癌基因同源物(s MAF)蛋白結(jié)合形成二聚體,并與順式作用元件ARE相結(jié)合,啟動下游抗氧化保護(hù)性基因和Ⅱ相解毒酶基因的轉(zhuǎn)錄,包括血紅素氧化酶(HO-1)、NAD(P)H醌氧化還原酶(NQO1)、谷氨酸半胱氨酸連接酶(GCL)等。這些抗氧化物質(zhì)能夠保護(hù)機(jī)體和細(xì)胞免受ROS及一些毒性物質(zhì)(如致癌物、藥物活性代謝產(chǎn)物等)的侵害。
在對試驗(yàn)數(shù)據(jù)及試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理分析后,從圖1中的四組柱狀圖里組A對照組和組B模型組的基因表達(dá)量對比中可以得出結(jié)論:GAL誘導(dǎo)小鼠成功建立衰老模型。并且,在與模型組的對照中可見Nrf2、HO-1低濃度黃粉蟲蛋白組和HO-1中濃度黃粉蟲蛋白組表達(dá)量水平無明顯差異。由此結(jié)合四組柱狀圖及結(jié)果可得出:低濃度黃粉蟲蛋白組對于腦Nrf2、HO-1、NQO1基因表達(dá)無明顯積極影響,對GCLC基因表達(dá)卻有明顯的積極影響,中濃度黃粉蟲蛋白組對腦HO-1基因表達(dá)無明顯積極影響,對腦Nrf2、NQO1、GCLC基因表達(dá)卻有著較為明顯的積極影響。高濃度黃粉蟲蛋白組則對腦Nrf2、HO-1、NQO1、GCLC基因表達(dá)均有著明顯的積極作用,其基因表達(dá)量均較大幅上調(diào)。
同理,在對試驗(yàn)數(shù)據(jù)及試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理分析后,從圖2中的四組柱狀圖里組A對照組和組B模型組的基因表達(dá)量對比中可以得出結(jié)論:GAL誘導(dǎo)小鼠成功建立衰老模型。并且,在與模型組的對照中可見Nrf2、HO-1低濃度黃粉蟲蛋白組和HO-1中濃度黃粉蟲蛋白組表達(dá)量水平無明顯差異。由此結(jié)合四組柱狀圖及結(jié)果可得出:低濃度黃粉蟲蛋白組對于腦Nrf2、HO-1、NQO1基因表達(dá)無明顯積極影響,對GCLC基因表達(dá)卻有明顯的積極影響,中濃度黃粉蟲蛋白組和高濃度黃粉蟲蛋白組則對腦Nrf2、HO-1、NQO1、GCLC基因表達(dá)均有著明顯的積極作用,其基因表達(dá)量均較大幅上調(diào)。
該試驗(yàn)結(jié)果說明,一定濃度的黃粉蟲蛋白或許能提高Nrf2、HO-1、NQO1及GCLC基因表達(dá)量,從而緩解、抑制氧化應(yīng)激反應(yīng),提示黃粉蟲蛋白可能是通過激活Nrf2-ARE信號通路來緩解D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老模型小鼠的肝、腦衰老受損,可能為臨床黃粉蟲蛋白應(yīng)用于緩解慢性肝腦損傷提供理論依據(jù)?!?/p>