付雪媛 孫呈浩 王長偉 杜芬 李八方

摘要 [目的]篩選單環(huán)刺螠體壁制備海鮮調(diào)味基料的最佳工藝。[方法]以單環(huán)刺螠體壁為原料，將物理抽提法與酶解法相結(jié)合制備海鮮調(diào)味基料，分析單環(huán)刺螠體壁的基本營養(yǎng)成分、氨基酸組成，并采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝。[結(jié)果]采用風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行酶解，最優(yōu)酶解工藝條件為酶解溫度50 ℃、料液比1∶4、加酶量7 000 U/g、酶解時(shí)間5 h。在該條件下蛋白水解度為38.23%，所得酶解液風(fēng)味較好、分子量較低。[結(jié)論]將酶解液過濾后與蒸煮所得上清液復(fù)合即得到鮮味濃郁、營養(yǎng)豐富的單環(huán)刺螠海鮮調(diào)味基料，可用于進(jìn)一步復(fù)配加工成相關(guān)海鮮調(diào)味料。

關(guān)鍵詞 單環(huán)刺螠;營養(yǎng)評價(jià);酶解;水解度;海鮮調(diào)味基料

中圖分類號 TS 254? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）18-0168-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.18.041

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Technology Research of Preparation of Seafood Flavor Condiment Base from Urechis unicinctus Body Wall

FU Xue-yuan1，SUN Cheng-hao2，WANG Chang-wei1 et al （1.Marine Biomedical Research Institute of Qingdao，Qingdao，Shandong 266071;2.PONY （Qingdao） Testing International Group Co.，Ltd，Qingdao，Shandong 266061）

Abstract [Objective]To select the best process for preparing seafood flavouring base from single Unicinctus unicinctus body walls.[Method] The physical extraction and enzymatic hydrolysis was combined to prepare seafood flavor condiment base from Urechis unicinctus body wall.The basic nutritional composition，amino acid composition of urechis unicinctus body wall were analyzed;the parameters of enzymolysis were optimized through single factor experiment and orthogonal experiment.[Result] Flavor protease was adopted in the progress of enzymatic hydrolysis，the optimal conditions were as follows：the enzymolysis temperature was 50℃，the solid-liquid ratio was 1∶4，the dosage of enzyme was 7 000 U/g，the enzymolysis time was 5 h，under these conditions，the degree of hydrolysis was 38.23%，the obtained enzymatic hydrolysate has better flavor and lower molecular weight.[Conclusion]The filtered enzymatic hydrolysate will be combined with the supernatant after boiled，and this combined liquid was Urechis unicinctus seafood flavor condiment base，which was rich in nutrients and umami flavor and can be used for further compounding and processing to related seafood seasonings.

Key words Urechis unicinctus;Nutrition evaluation;Enzymatic hydrolysis;Degree of hydrolysis;Seafood flavor condiment base

基金項(xiàng)目

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（51703214） 。

作者簡介 付雪媛（1990—），女，山西陽泉人，工程師，碩士，從事海洋水產(chǎn)品高值化利用研究。*通信作者，教授，博士，博士生導(dǎo)師，從事海洋功能制品研究。

收稿日期 2021-02-19

單環(huán)刺螠（Urechis unicinctus），俗稱海腸，隸屬螠蟲動(dòng)物門，主要分布于中國、俄羅斯、日本、朝鮮沿海地區(qū)的泥潭或巖石縫中[1]，其營養(yǎng)成分接近海參，因此被譽(yù)為裸體海參[2]。單環(huán)刺螠營養(yǎng)價(jià)值豐富，體壁占總質(zhì)量的32%左右，含有豐富的蛋白質(zhì)[3]，氨基酸組成合理，含有多種必需氨基酸。生物活性肽、纖溶酶等含量豐富[4]，呈味氨基酸含量豐富[5]，味道鮮美，是制作海鮮調(diào)味料的良好材料。

目前市面上常見的海鮮調(diào)味料有魚露、蝦油、耗油等，主要以魚、蝦、貝類為原料，經(jīng)過抽提、分解、加熱、濃縮等工藝[6]，使天然鮮味釋放。根據(jù)加工方式不同，調(diào)味料分為分解型、抽提型和反應(yīng)型[7]。分解型調(diào)味料是通過加酸、加酶、發(fā)酵等方式將原料分解，形成富含氨基酸、多肽、有機(jī)酸的調(diào)味液[8-10];抽提型海鮮調(diào)味料是經(jīng)過抽提、分離、混合等產(chǎn)生鮮味濃郁的天然浸出物，常用方法有水提法、醇提法[11];反應(yīng)型調(diào)味料是通過氨基酸和糖類的美拉德反應(yīng)制備天然香基，再經(jīng)調(diào)配后得到成品調(diào)味料[12-13]。

有學(xué)者對以單環(huán)刺螠為原料制備海鮮調(diào)味料進(jìn)行研究和開發(fā)。在李新民[14]的研究中，將海腸烘烤、粉碎得到海腸粉，經(jīng)復(fù)配得到海腸調(diào)味料;劉海梅等[15]采用復(fù)合風(fēng)味蛋白酶或木瓜蛋白酶直接酶解海腸，改善了水解液風(fēng)味;王思婷等[16]通過風(fēng)味蛋白酶酶解海腸，再經(jīng)噴霧干燥制得海腸調(diào)味顆粒。該研究創(chuàng)新了提取工藝，將物理抽提法與加酶分解法相結(jié)合，研究了酶解工藝條件和工藝參數(shù)，所得調(diào)味液基料滋味鮮美，既保留了海腸原始風(fēng)味，又進(jìn)一步釋放鮮味成分，可用于加工成單環(huán)刺

螠調(diào)味料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮單環(huán)刺螠：購自青島麥島海鮮水產(chǎn)市場;中性蛋白酶（130 000 U/g）、堿性蛋白酶（220 000 U/g）、風(fēng)味蛋白酶（130 000 U/g）、胰蛋白酶（350 000 U/g）、復(fù)合蛋白酶（52 000 U/g）：南寧龐博生物工程有限公司，食品級;石油醚、甲醛、氫氧化鈉：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司;L-8900型氨基酸自動(dòng)分析儀，日本日立公司;SKD-100型凱氏定氮儀，上海沛歐分析儀器有限公司;QSJ-B03E1型料理機(jī)，廣東小熊電器有限公司;HWS24型恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司;SHA-C型恒溫振蕩器，常州國華電器有限公司;BSA2202S型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司;PH400型pH計(jì)，安萊立思儀器科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 單環(huán)刺螠基本營養(yǎng)成分分析。

水分：參照GB/T 5009.3—2016，直接干燥法測定;灰分：參照 GB/T 5009.4—2016，灼燒法測定;蛋白質(zhì)：參照GB/T 5009.5—2016，半微量凱氏定氮法測定;總脂：參照GB/T 5009.6—2016，索氏抽提法測定。

1.3.2 氨基酸組成分析。

參照GB/T 5009.124—2016食品中氨基酸的測定。采用氨基酸自動(dòng)分析儀測定，855-4506型離子交換柱（4.6 mm×60.0mm），柱溫57 ℃，泵流速0.4 mL/min，進(jìn)樣體積20 μL，分析時(shí)間50 min。

1.3.3 分子量分析。

參照GB 31645—2018進(jìn)行測定。采用高效液相色譜法，TSK GEL G2000SWXL色譜柱，柱溫30 ℃，體積流量0.8 mL/min，流動(dòng)相為體積比1∶1的乙腈與0.2%三氟乙酸混合溶液，檢測波長220 nm，結(jié)果通過GPC軟件進(jìn)行分析。

1.3.4 單環(huán)刺螠體壁海鮮基料的制備工藝。將單環(huán)刺螠體壁置于攪碎機(jī)攪碎→調(diào)整料液比為1∶2→小火煮沸蒸煮2 h→過濾得上清備用→剩余固體冷卻后調(diào)整料液比→調(diào)節(jié)pH→加酶恒溫酶解→滅酶→冷卻→過濾得上清液→與蒸煮上清液合并→單環(huán)刺螠體壁海鮮基料。

1.3.5 酶解單因素試驗(yàn)。

在固定其余因素不變的情況下，分別考察料液比、酶解溫度（℃）、酶解時(shí)間（h）、加酶量（U/g）對蛋白質(zhì)水解度的影響，以此數(shù)據(jù)作為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的依據(jù)。

1.3.6 酶解正交試驗(yàn)。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用風(fēng)味蛋白酶，固定酶解液pH為7.5，選擇酶解料液比、加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度為因素，以蛋白質(zhì)水解度為試驗(yàn)指標(biāo)，進(jìn)行4因素3水平正交優(yōu)化試驗(yàn)。因素水平設(shè)計(jì)見表1。

1.3.7 蛋白質(zhì)回收率與水解度測定。

參照GB/T 6432—2018，采用凱氏定氮法測定原料和酶解液中總氮含量;參照GB 5009.235—2016，中性甲醛滴定法測定游離氨基態(tài)氮含量。

蛋白質(zhì)回收率（%）=水解液總氮含量/原料總氮含量 ×100;蛋白質(zhì)水解度（%）=水解液游離氨基態(tài)含量/水解液總氮含量×100

1.4 數(shù)據(jù)分析

對所有數(shù)據(jù)利用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，多組數(shù)據(jù)之間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異采用單因素方差分析，P<0.05表示顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 單環(huán)刺螠體壁基本營養(yǎng)成分

由表2可知，單環(huán)刺螠體壁水分含量為82.70%，蛋白質(zhì)含量為12.63%，總脂含量為1.55%，灰分含量為2.22%，其中蛋白質(zhì)含量占干重的71.01%，含量豐富。

2.2 單環(huán)刺螠體壁氨基酸

通過檢測18種氨基酸，單環(huán)刺螠體壁的氨基酸組成見表3。單環(huán)刺螠體壁中谷氨酸含量為非必需氨基酸最高，達(dá)到9.81%，其次為甘氨酸（8.86%）、丙氨酸（8.20%），色氨酸未檢測出。谷氨酸、丙氨酸和甘氨酸等均為重要的呈味氨基酸，其總和占氨基酸總量比例（DAA/TAA）達(dá)到57.35%，這可能是單環(huán)刺螠味道鮮美的原因所在。FAO/WHO的理想模式認(rèn)為，EAA/TAA接近40%營養(yǎng)價(jià)值較好。單環(huán)刺螠體壁的EAA/TAA為31.17%，較為接近FAO/WHO的標(biāo)準(zhǔn)。

必需氨基酸評分結(jié)果見表4。8種必需氨基酸的含量及構(gòu)成比例是評價(jià)蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值的依據(jù)，通常以FAO/WHO推薦的EAA模式和蛋氨酸模式進(jìn)行參比。單環(huán)刺螠體壁檢測出7種必需氨基酸，其中蘇氨酸的AAS評分最高，為1.18，蛋氨酸+胱氨酸的AAS評分最低，為0.52，其余各項(xiàng)氨基酸評分均接近1.00，說明單環(huán)刺螠體壁必需氨基酸結(jié)構(gòu)較為合理，基本符合人體對必需氨基酸的需求，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值。

2.3 酶種類篩選

比較風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶對酶解效果的影響，酶解參數(shù)見表5。以蒸煮后剩余固體為原料進(jìn)行酶解，以氮收率和水解度為考察指標(biāo)，結(jié)果見圖1。5種蛋白酶中，胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶酶解后氮收率分別達(dá)到63.10%和61.08%，兩者無顯著性差異，但顯著高于復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶與堿性蛋白酶;風(fēng)味蛋白酶酶解后水解度達(dá)到33.25%，顯著高于其他4種酶。鑒于風(fēng)味蛋白酶酶解后氮收率和水解度較高，且酶解液風(fēng)味較好，因此選擇風(fēng)味蛋白酶為最適宜水解酶。

2.4 酶解單因素試驗(yàn)

2.4.1 不同料液比對水解度的影響。

固定提取溫度50 ℃，提取時(shí)間4 h，加酶量7 000 U/g，研究不同料液比對蛋白水解度的影響，結(jié)果見圖2。從圖2可見，在料液比為1∶3時(shí)，水解度達(dá)到最高水平，為30.66%。隨著加水量增加，水解度呈下降趨勢，原因可能是酶濃度降低，難以充分與單環(huán)刺螠蛋白接觸，從而難以充分酶解。因此，選擇料液比為1∶3作為酶解提取的適宜條件。

2.4.2 不同酶解溫度對水解度的影響。

固定料液比1∶3，提取時(shí)間4 h，加酶量7 000 U/g，研究不同酶解溫度對水解度的影響，結(jié)果見圖3。從圖3可見，隨著酶解溫度的升高，蛋白水解度不斷增大，到50 ℃時(shí)水解度最高，達(dá)到31.50%，當(dāng)酶解溫度繼續(xù)升高至60 ℃時(shí)，水解度下降至29.10%。溫度升高時(shí)，酶和底物的分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)加快，結(jié)合速率提高，因此使得水解度不斷升高，當(dāng)達(dá)到一定溫度后繼續(xù)升高溫度時(shí)，酶活力下降，水解度降低，因此選擇50 ℃作為風(fēng)味蛋白酶酶解的適宜溫度。

2.4.3 不同酶解時(shí)間對水解度的影響。固定料液比1∶3，提取溫度50 ℃，加酶量7 000 U/g，研究不同酶解時(shí)間對蛋白水解度的影響，結(jié)果見圖4。從圖4可見，在3～6 h，隨著酶解時(shí)間的延長，水解度不斷上升，到6 h時(shí)水解度達(dá)到32.22%。隨著酶解時(shí)間的進(jìn)一步延長，水解度呈下降趨勢。過長水解時(shí)間可能導(dǎo)致蛋白過度水解產(chǎn)生苦味肽，且提高制備成本。因此，選擇6 h作為最佳酶解時(shí)間。

2.4.4 不同加酶量對水解度的影響。

固定料液比1∶3，提取溫度50 ℃，酶解時(shí)間4 h，研究不同加酶量對水解度的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可知，隨著加酶量的增加，水解度不斷上升。當(dāng)加酶量為7 000 U/g時(shí)，水解度達(dá)到32.75%，加酶量繼續(xù)增加，水解度反而下降，當(dāng)加酶量為11 000 U/g時(shí)，水解度為30.67%。這是由于當(dāng)酶濃度過高時(shí)酶與底物接觸已經(jīng)飽和，不會(huì)再提高水解效率。因此，選擇7 000 U/g作為單環(huán)刺螠體壁酶解的適宜加酶量。

2.5 酶解正交優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用風(fēng)味蛋白酶，固定酶解液pH為7.0，選擇酶解料液比、加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度為因素，以水解度為試驗(yàn)指標(biāo)，進(jìn)行4因素3水平正交優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果見表6。由表6可知，風(fēng)味蛋白酶酶解單環(huán)刺螠體壁過程中，各因素對水解度的影響從大到小依次為料液比、酶解溫度、酶解時(shí)間、加酶量。最佳酶解條件組合為料液比1∶4，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間5 h，加酶量7 000 U/g。在該試驗(yàn)條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，平行3次，水解度為（38.23±1.32）%，優(yōu)于最大值38.11%。

2.6 分子量測定 采用液相色譜法分別測定酶解液和酶解前單環(huán)刺螠體壁固體分子量，分子量分布見圖6。酶解前單環(huán)刺螠體壁蛋白質(zhì)平均分子量為1 886 Da，酶解后分子量為637Da，說明在該試驗(yàn)條件下，風(fēng)味蛋白酶能夠?qū)⒋蠓肿拥鞍踪|(zhì)切割為小分子肽段或游離氨基酸，酶解效果顯著。

3 結(jié)論

該研究以單環(huán)刺螠為原料進(jìn)行基本營養(yǎng)成分分析及氨基酸分析，結(jié)果表明，單環(huán)刺螠具有高蛋白、低脂肪的營養(yǎng)特點(diǎn)，氨基酸含量豐富，其中必需氨基酸占比達(dá)31.17%，呈味氨基酸占比達(dá)57.35%，說明單環(huán)刺螠不僅營養(yǎng)豐富且味道鮮美，可以作為海鮮調(diào)味料的原料進(jìn)行開發(fā)。

將抽提法與酶解法的工藝條件結(jié)合，經(jīng)蒸煮抽提后的單環(huán)刺螠體壁進(jìn)一步酶解，確定風(fēng)味蛋白酶作為最適宜水解酶，經(jīng)過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定最適酶解條件，當(dāng)酶解條件為酶解溫度50 ℃、料液比1∶4、加酶量7 000 U/g、酶解時(shí)間5 h時(shí)，蛋白水解度最高，為38.23%，且酶解液分子量較低，利于人體吸收;所得的酶解液經(jīng)過濾后與前期蒸煮過濾得到的上清液合并（為增強(qiáng)基料鮮味的渾厚感）即為單環(huán)刺螠海鮮調(diào)味料基料，該基料風(fēng)味鮮美、澄清、無苦味，可用于進(jìn)一步加工復(fù)配成海鮮調(diào)味料。該研究為單環(huán)刺螠海鮮調(diào)味料的開發(fā)提供了理論依據(jù)。

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