張浩，莊新建，郭梟，徐紅梅，賀振，張坤

揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州文昌中路567號(hào)，225000

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Endoplasmic reticulum，ER）是植物細(xì)胞重要的具備膜和管道系統(tǒng)的細(xì)胞器，是分泌蛋白、膜蛋白合成、糖基化修飾的場(chǎng)所[1]。ER具有極強(qiáng)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，但仍然有很多因素（病毒和細(xì)菌侵入等）導(dǎo)致內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，未折疊或錯(cuò)折疊蛋白蓄積，膜雙層結(jié)構(gòu)組成紊亂，進(jìn)而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ER stresses）[2]。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的折疊受到逆境等因素干擾時(shí)，未折疊蛋白和錯(cuò)誤折疊蛋白就會(huì)大量積累，細(xì)胞就會(huì)啟動(dòng)一種非常保守的機(jī)制——未折疊蛋白應(yīng)答（Unfolded Protein Response，UPR）通路激活[3]。植物細(xì)胞主要通過(guò)兩條通路來(lái)感受和傳導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，其中一條通路由S1P/S2P-bZIP17/bZIP28介導(dǎo)，而另一條通路由IRE1-bZIP60mRNA介導(dǎo)[4]。

NbbZIP60是一個(gè)含有跨膜結(jié)構(gòu)域且定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的轉(zhuǎn)錄因子，而NbIRE1則是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)I型跨膜蛋白，在細(xì)胞質(zhì)側(cè)有激酶和RNase結(jié)構(gòu)域[5]。在正常情況下，NbbZIP60蛋白能定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上；bZIP60轉(zhuǎn)錄的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物（pri-mRNA） 具有保守的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，在逆境脅迫（如高溫，病原菌侵染等）下，該結(jié)構(gòu)能被定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的IRE1剪接，而產(chǎn)生閱讀框移碼，從而編碼不含跨膜結(jié)構(gòu)域，但攜帶有核定位信號(hào)的NbbZIP60成熟蛋白。該蛋白在核轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物的作用下能被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)，從而啟動(dòng)下游分子伴侶基因的轉(zhuǎn)錄[6]。在沉默bZIP60時(shí), 普通煙（Nicotiana attenuata）更易感煙草赤星?。ˋlternaria alternata）；在TuMV侵染擬南芥（Arabidopsis）時(shí)能顯著誘導(dǎo)bZIP60的剪切[7]；在沉默NbbZIP60時(shí)，馬鈴薯X病毒（potato virus X，PVX）更易擴(kuò)散到本氏煙（Nicotiana benthamiana）的上部葉；IRE1-bZIP60可以限制PVX在本氏煙中的侵染[8]。

鑒于本氏煙作為研究植物病毒的模式植物，本研究擬克隆本氏煙bZIP60基因，通過(guò)原核表達(dá)純化NbbZIP60重組蛋白并制備其特異性抗血清，制備的bZIP60抗體可以檢測(cè)DTT噴施過(guò)的本氏煙中bZIP60蛋白的表達(dá)，對(duì)bZIP60蛋白剪切與非剪切兩種形式蛋白的定量能直接反應(yīng)本氏煙UPR反應(yīng)激活的強(qiáng)度。后續(xù)在病毒侵染本氏煙的條件下對(duì)UPR進(jìn)行研究時(shí)，可以對(duì)本氏煙bZIP60蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，為探索bZIP60的相關(guān)功能和作用機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

原核表達(dá)載體pET28(+)a、大腸桿菌DH5α菌株、BL21菌株來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)李大偉教授的饋贈(zèng)；pMD19-T質(zhì)粒、RTase M-MLV、5 × M-MLV Buffer、dNTP Mixture、RNase Inhibitor 、Nco I限制性內(nèi)切酶、Xho I 限制性內(nèi)切酶等購(gòu)自于寶生物工程（大連）有限公司；FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit試劑盒，2 × Taq Master Mix、180 kDa Protein Marker、RNA-easyTM Isolation Reagent Kit購(gòu)自于南京諾唯贊生物科技有限公司；Ni -NTA 親和層析介質(zhì)購(gòu)自南京金斯瑞生物科技有限公司；PMSF、DTT購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；IPTG購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。NbbZIP60多克隆抗血清由揚(yáng)州大學(xué)植物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。本氏煙（Nicotiana benthamiana）培育在揚(yáng)州大學(xué)植物病毒學(xué)恒溫室；生長(zhǎng)條件為在（24 ± 1）℃，光周期為 16/8 h，其中16 h四級(jí)光照，8 h黑暗處理。

1.2 NbbZIP60基因擴(kuò)增及原核表達(dá)載體構(gòu)建

登錄本氏煙數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站（https://solgenomics.net/tools/blast）查詢并獲得可能的NbZIP60基因序列，按照獲得的本氏煙bZIP60基因合成引物bZIP60-Nco I/F: 5’-CATGCCATGGNcoITTGGATGACATCGATGATATCG-3’ ，bZIP60-Xho I/R：5’-CCGCTCGAGXhoIAGACTCCTGC-TTGGTCAT ACAAG-3’；按照RNA-easyTM Isolation Reagent Kit說(shuō)明書(shū)的方法來(lái)提取本氏煙葉片的總RNA。以提取的本氏煙葉片總RNA為模板，bZIP60-Xho I/R作為引物，使用逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV，于42℃條件下合成cDNA；用上述合成的cDNA為模板，按設(shè)計(jì)的正反引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增本氏煙的bZIP60基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳分離并回收純化，用Nco I和Xho I對(duì)純化片段與載體進(jìn)行酶切反應(yīng)，隨后于16℃連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。經(jīng)菌落PCR 驗(yàn)證陽(yáng)性克隆后并測(cè)序，從中選擇測(cè)序結(jié)果正確的克隆進(jìn)行后續(xù)的研究，并將該質(zhì)粒命名為pET28a-bZIP60。

1.3 蛋白表達(dá)和SDS-PAGE分析

將pET28a-bZIP60質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），挑取單菌落接種于5 mL含卡那霉素（100 μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜?；罨喊?:100加入50 mL含卡那霉素（100 μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600為0.6。分別在28℃和37℃下進(jìn)行誘導(dǎo)，每個(gè)溫度取2管，其中一管加IPTG至終濃度為1 mmol/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h。取2 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)物，12 000 rpm離心30 s收集菌體。加入100 μL SDS-PAGE Loading Buffer，沸水煮10 min，12 000 rpm離心10 min。取5 μL上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。電泳結(jié)束后，通過(guò)考馬斯亮藍(lán)R-250對(duì)凝膠進(jìn)行染色，檢測(cè)分析融合蛋白的表達(dá)情況。

1.4 NbbZIP60蛋白的Ni柱純化

通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定蛋白表達(dá)后，在1 L液體LB培養(yǎng)基中按1:100加入10 mL活化菌液，37℃培養(yǎng)至OD600為0.6，用1 mmol/L IPTG于18℃誘導(dǎo)18 h。然后離心收集菌體，用40 mL含20 mmol/L Tris-HCl （pH 7.0）、500 mmol/L NaCl、10%甘油的蛋白buffer重懸，加蛋白酶抑制劑PMSF至終濃度為1 mmol/L，超聲波破碎，離心收集上清和沉淀備用。上清用High Affinity Ni-NTA Resin進(jìn)行純化。取5 mL High Affinity Ni-NTA Resin過(guò)5倍柱體積蛋白buffer，上清過(guò)柱子5遍，之后分別用10 mL含40 mmol/L、60 mmol/L、80 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L咪唑的蛋白緩沖液進(jìn)行洗脫，取上清、沉淀、穿柱液以及各濃度的洗脫液等體積加入SDS-PAGE Loading Buffer，使用SDS-PAGE電泳來(lái)檢測(cè)蛋白的洗脫情況。使用超濾管對(duì)將含靶標(biāo)蛋白的洗脫液進(jìn)行離心濃縮，分裝后液氮速凍，-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 NbbZIP60蛋白抗血清的制備

以誘導(dǎo)表達(dá)的特異的NbbZIP60蛋白為抗原，參照張超等[8]的方法，分4次在第1 d、22 d、36 d、50 d免疫新西蘭大白兔, 最后一次注射10 d后，自大白兔頸動(dòng)脈取血，5000 r·m-1離心10 min，經(jīng)過(guò)2次離心后收集 NbbZIP60抗血清30 mL。

1.6 Western blot免疫印跡檢測(cè)

將待檢測(cè)蛋白樣品進(jìn)行SDS- PAGE電泳，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上；隨即轉(zhuǎn)入10 mL 封閉液 （10 mL TBST緩沖液+0.5 g脫脂奶粉），37℃反應(yīng)1 h；在封閉液中加入1:10000的抗血清，37℃反應(yīng)1 h，隨后使用1×TBST緩沖液洗脫3次，每次10 min；隨后將膜置入含有AP-IgG二抗的TBST緩沖液（1 : 5 000），37℃反應(yīng)45 min；1×TBST洗脫3次，每次10 min；在避光條件下，將膜放至含有165 μg/mL BCIP和330 μg/mL NBT底物的堿性磷酸酯酶緩沖液中顯色至條帶清晰。

1.7 抗血清效價(jià)測(cè)定

提取DTT噴施過(guò)的本氏煙葉片總蛋白，采用Western blot的方法對(duì)NbbZIP60的抗血清進(jìn)行效價(jià)測(cè)定。梯度稀釋NbbZIP60抗血清，稀釋倍數(shù)為1000、2000、5000、8000、10000和20000，測(cè)定其效價(jià)。

1.8 抗血清的靈敏度分析

以DTT噴施過(guò)的本氏煙葉片和原核表達(dá)純化的NbbZIP60為材料，使用Western blot來(lái)對(duì)抗血清的靈敏度進(jìn)行分析。稱取本氏煙葉片0.2 g，組織粉碎研磨后加入200 μL SDS-PAGE Loading Buffer，制備蛋白電泳樣品，即以1:1稀釋樣品。繼續(xù)使用SDSPAGE Loading Buffer來(lái)制備梯度稀釋的電泳樣品，稀釋倍數(shù)依次為5、10、50、100、200、300、500、1000，NbbZIP60特異性抗血清以1:2000 稀釋，進(jìn)行western blot 檢測(cè)。另取已知濃度原核表達(dá)純化的NbbZIP60蛋白，分別取50、40、30、20、10、8、6、4、1 ng蛋白上樣，NbbZIP60抗血清以1：5000稀釋進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 NbbZIP60的誘導(dǎo)表達(dá)、純化

將構(gòu)建成功的原核表達(dá)載體pET28a-bZIP60轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），篩選陽(yáng)性克隆，并經(jīng)過(guò)1 mM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳顯示在35 kDa附近位置出現(xiàn)與預(yù)期大小一致的融合蛋白條帶，表明NbbZIP60重組蛋白在大腸桿菌中能正確表達(dá)。剩余菌體經(jīng)蛋白懸浮緩沖液懸浮后，通過(guò)超聲波細(xì)胞破碎儀破碎，將上清和沉淀分別取出，并進(jìn)行SDSPAGE電泳，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示靶標(biāo)融合蛋白主要是以可溶的狀態(tài)存在于破碎后的上清液中（圖2）。選擇陽(yáng)性菌株，經(jīng)過(guò)大量發(fā)酵培養(yǎng)后，在18℃條件下誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，菌體經(jīng)破碎后，利用Ni-NTA親和層析介質(zhì)對(duì)上清液中的靶標(biāo)蛋白進(jìn)行純化。SDS-PAGE電泳分析表明，在沉淀和上清中都檢測(cè)到NbbZIP60融合蛋白的存在（圖2），說(shuō)明通過(guò)該原核表達(dá)技術(shù)誘導(dǎo)表達(dá)的NbbZIP60融合蛋白是一個(gè)部分可溶性蛋白。進(jìn)一步通過(guò)Ni-NTA親和層析介質(zhì)進(jìn)行NbbZIP60融合蛋白的純化，使用100 mmol/L、300 mmol/L咪唑進(jìn)行洗脫時(shí)，與介質(zhì)結(jié)合的非特異性蛋白的量較少，目的蛋白純度相對(duì)較高，使用200 mmol/L的咪唑洗脫時(shí)獲得的蛋白濃度最高。因此，結(jié)果表明利用Ni-NTA親和層析介質(zhì)純化NbbZIP60融合蛋白時(shí)，咪唑濃度為200 mmol/L洗脫緩沖液為最佳濃度。

圖1 原核表達(dá)本氏煙 bZIP60蛋白的SDS-PAGE圖Fig.1 SDS-PAGE analysis of NbbZIP60 expression in Escherichia coli

圖2 本氏煙 bZIP60抗血清效價(jià)的檢測(cè)Fig.2 Determination of antibody titer of NbbZIP60

2.2 抗血清效價(jià)的測(cè)定

成功制備了NbbZIP60血清抗體后，通過(guò)Western Blot對(duì)抗血清效價(jià)進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)血清抗體稀釋不同濃度時(shí)，均能檢測(cè)到目的蛋白（圖3）。通過(guò)Western Blot對(duì)本氏煙進(jìn)行檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)抗血清按比例稀釋到1:20000時(shí)，制備的抗血清仍然能夠特異地檢測(cè)到目的蛋白（圖3），說(shuō)明制備的抗血清效價(jià)良好。

圖3 Western blot分析本氏煙 bZIP60抗血清靈敏度圖Fig.3 Sensitivity of NbbZIP60 antiserum determined by Western blot

2.3 抗血清靈敏度的檢測(cè)鑒定

為了分析多克隆抗血清的檢測(cè)靈敏性，分別以本氏煙葉片和原核表達(dá)蛋白為材料，梯度稀釋樣品進(jìn)行Western blot檢測(cè)。當(dāng)抗血清稀釋倍數(shù)為1:2000時(shí)，0.2 g本氏煙葉片的總蛋白稀釋500倍后反應(yīng)呈陽(yáng)性（圖4-A），而以1:5000稀釋的抗血清可以檢測(cè)到大約4 ng原核表達(dá)蛋白（圖4-B），說(shuō)明制備的抗血清具有較強(qiáng)的靈敏度。同時(shí)，通過(guò)His抗體對(duì)純化的蛋白進(jìn)行檢測(cè)（圖4-C），結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了制備的抗血清具有較強(qiáng)的靈敏度。

2.4 Western blot 免疫印跡分析本氏煙總蛋白

為了進(jìn)一步驗(yàn)證制備的抗體是否能夠用于檢測(cè)本氏煙中UPR機(jī)制中bZIP60蛋白，提取本氏煙總蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)。Western blot結(jié)果顯示，產(chǎn)生了兩條特異性條帶（圖4），表明制備的抗體可以特異地與本氏煙中的bZIP60蛋白結(jié)合，可以檢測(cè)到本氏煙中兩種形式的bZIP60蛋白，為后續(xù)開(kāi)展bZIP60調(diào)控植物防御脅迫的分子機(jī)理提供了研究基礎(chǔ)。

圖4 本氏煙bZIP60抗血清特異性的Western blot 分析Fig.4 Western blot analysis of the specificity of NbbZIP60 antiserum

3 結(jié)論

本研究利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，成功表達(dá)可溶性的重組bZIP60蛋白，并制備了高效價(jià)的多克隆抗體，能夠檢測(cè)出本氏煙中表達(dá)的bZIP60蛋白, 為進(jìn)一步研究bZIP60基因在植物發(fā)育和抗逆性中的功能奠定了基礎(chǔ)。