牛浩，段衛(wèi)東，汪代斌，白金瑩，彭軍，宋朝鵬，路曉崇*

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，河南鄭州 450002；

2 河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，河南鄭州 450018；

3 重慶煙草科學(xué)研究所，重慶 400023

烘烤是決定煙葉最終質(zhì)量和工業(yè)可用性的重要環(huán)節(jié)。在生產(chǎn)實踐中，易出現(xiàn)對采后煙葉變黃變褐特征把握不準(zhǔn)確的現(xiàn)象，導(dǎo)致煙葉烤青烤黑，造成經(jīng)濟損失影響煙農(nóng)收入。本文探討采后煙葉顏色變化機制為提高煙葉烘烤質(zhì)量，制定烘烤工藝提供參考。近年來，研究認(rèn)為果蔬采后衰老和褐變的發(fā)生與能量代謝有著密切的聯(lián)系[1]。Liu等[2]發(fā)現(xiàn)外源ATP能夠抑制荔枝果皮細胞膜脂過氧化程度，從而延緩褐變發(fā)生。劉海[3]指出ATP缺乏引起了香蕉果實細胞膜結(jié)構(gòu)的破壞，加速了香蕉的衰老褐變。而用能量代謝抑制劑（DNP，2,4-二硝基苯酚）浸泡過的龍眼果實果皮褐變明顯加快[4]。在煙草領(lǐng)域，采后煙葉的變黃變褐過程及其背后的能量代謝機制尚未見報道?；诖?，本研究以烤煙品種（系）“豫煙13號”和“LY1306”為研究對象，采用暗箱試驗的方式研究了采后煙葉的變黃變褐過程。通過測定試驗期間煙葉的變黃程度、變褐程度、丙二醛含量（MDA）、能量相關(guān)物質(zhì)（ATP、ADP、AMP含量）、能荷以及細胞色素氧化酶（CCO）、琥珀酸脫氫酶（SDH）等呼吸代謝相關(guān)酶的活性，來研究采后煙葉變黃變褐特點差異及其背后的能量代謝機理，為提升煙葉烘烤質(zhì)量，制定適宜烘烤工藝提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2019—2020年度進行，供試品種（系）為豫煙13號和LY1306。豫煙13號是以中煙101為母本、664-01為父本雜交后培育而成的烤煙純系品種，大田生育期120 d左右，成熟特征明顯，烘烤特性表現(xiàn)為變黃失水容易，易烤性好[5]。LY1306是由系統(tǒng)選育的G80株系以此與K326、89112交育成的烤煙品系，大田生育期約128 d，烘烤特性表現(xiàn)為變黃失水相對困難，易烤性稍差[6]。供試煙葉均產(chǎn)自河南省洛陽市宜陽縣石村（N112°3′25″，E34°30′24″）。煙葉田間的移栽，施肥和其他田間管理措施均按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)方法進行。在當(dāng)?shù)刂胁咳~適熟時期，選取第10～13葉位長相一致，落黃均勻的適熟煙葉各200片進行采收。所有煙葉均在同一天進行采收以保證試驗材料的均一性和代表性。采后煙葉立刻送回實驗室進行暗箱試驗。在暗箱試驗期間，每隔24 h隨機選取3片煙葉觀察變黃變褐情況后放回；每隔48 h隨機選取3片煙葉，去除主脈后混合第6至第7支脈葉肉，用液氮速凍后放入超低溫冰箱中-80℃保存用于后續(xù)統(tǒng)一測定各項生理指標(biāo)；各項生理指標(biāo)均重復(fù)測定3次。試驗開始當(dāng)天記為第0 d，進行至所有煙葉變褐程度達到30%時結(jié)束。

1.2 測定方法

1.2.1 黃化褐變的測定

參考文獻[7]的方法，在黑暗、不通風(fēng)、室溫環(huán)境下進行暗箱試驗。每隔24 h拍照觀察一次，目測變黃變褐程度。以煙葉變黃/變褐面積在整個煙葉面積的占比來表示變黃變褐程度，直至所有煙葉的變褐程度均達到30%為止。

1.2.2 丙二醛（MDA）含量的測定

采用硫代巴比妥酸法測定MDA含量[8]。取0.5 g煙草樣品置于研缽中，加入2 mL預(yù)冷的0.05 mol/L pH7.8的磷酸緩沖液，冰浴下充分研磨。隨后將研磨后的勻漿轉(zhuǎn)移到5 mL刻度離心管中，將研缽用緩沖液洗凈，清洗液也移入離心管中，用緩沖液定容至5 mL。冷凍離心機4℃，4500 rpm下離心10 min。取上清液2 mL，加入3 mL 0.5%的TBA溶液后放入沸水浴中煮沸10 min。之后立刻將試管取出并放入冰浴中。冷凍離心機4℃，4500 rpm下再次離心10 min。取上清液于532 nm，600 nm波長下測定吸光度，計算MDA含量，結(jié)果以nmol/g表示。

1.2.3 ATP、ADP、AMP含量和能荷的測定

采用高效液相色譜法測定ATP、ADP和AMP的含量[9]。取煙草樣品2.0 g，液氮研磨后加入1 mL 0.4 mol/L 高氯酸溶液繼續(xù)研磨20 min。隨后冷凍離心機4℃，14000 rpm下離心10 min。上清液用1 mol/L氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH至6.5～6.8后定容至5 mL。定容后的樣本經(jīng)0.45 μm孔徑微孔濾膜過濾，應(yīng)用高效液相色譜儀（Agilent 1260）進行檢測。色譜柱為Diamonsil C18(2)（250*4.6 mm，5 μm），流動相為磷酸緩沖鹽溶液，磷酸鹽緩沖液（含20 mmol/L的磷酸二氫鉀和20 mmol/L的磷酸氫二鈉，pH=6.5）—乙腈（99：1，v:v），流速為1 mL/min，柱溫為30℃。檢測波長254 nm。進樣量為10 μL，重復(fù)3次。ATP、ADP、AMP標(biāo)準(zhǔn)品（購自上海源葉生物）重復(fù)上述過程制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)各物質(zhì)峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算ATP、ADP、AMP含量。

根據(jù)公式（1）計算能荷（EC）

1.2.4 煙草葉片線粒體的提取

參考Hiroshi等[10]的方法提取煙葉線粒體，略有改動。稱取1 g煙葉，加入10 ml緩沖液（50 mmol/L pH7.5 Tris-HCL緩沖液，內(nèi)含0.3 mol/L 甘露醇、1 mmol/L EDTA二鈉鹽、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1% PVP）冰浴勻漿。接著四層紗布過濾，濾液在4℃ 4000 g下離心10 min；取上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，在4℃14000 g條件下離心20 min。棄上清液，將沉淀用前述緩沖液洗滌，在4℃ 14000 g下離心20 min，沉淀即為線粒體。將沉淀用1.5 mL緩沖溶液溶解，用于后續(xù)指標(biāo)的測定。

由表2可以看出，除處理⑥和處理⑦污泥中Cd含量超過 《城鎮(zhèn)污水處理廠污泥處置－農(nóng)用泥質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》A級標(biāo)準(zhǔn)但低于B級標(biāo)準(zhǔn)（A標(biāo)準(zhǔn)是Cd含量＜3 mg/kg，B 標(biāo)準(zhǔn)是 Cd 含量＜15 mg/kg）外，其余重金屬指標(biāo)均符合A級標(biāo)準(zhǔn)，可用于種植錦紫蘇。

1.2.5 線粒體琥珀酸脫氫酶（SDH）的測定

參考Ackrell等[11]和陳京京[12]的方法測定琥珀酸脫氫酶（SDH）的活性。取線粒體制備液0.1 mL，加入在30℃預(yù)熱的工作液中（內(nèi)含0.2 mol/L pH7.4磷酸鉀緩沖液，0.2 mol/L 琥珀酸鈉和0.9 mmol/L 2,6-DCPIP）?；靹蚝?，30℃下保溫5 min。立即加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.33%的甲硫酚嗪溶液搖勻，測定600 nm處吸光值的變化來表示SDH的活性。

1.2.6 線粒體細胞色素氧化酶（CCO）的測定

參考Kan等[13]方法測定細胞色素氧化酶的活性，略有改動。取線粒體制備液0.1 mL，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.04%的細胞色素C水溶液0.2 mL和蒸餾水2 mL（37℃預(yù)熱）。接著加入0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的二甲基對苯二胺水溶液37℃保溫至出現(xiàn)紅色，顏色在10 min內(nèi)穩(wěn)定。于540 nm比色，用秒表計時，以變化的吸光值度表示CCO活性。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel進行數(shù)據(jù)整理分析；采用Origin 7.5作圖；采用SPSS 17.0進行方差分析、相關(guān)分析、回歸分析和顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 采后煙葉黃化褐變的發(fā)展

豫煙13號和LY1306兩品種（系）煙葉的變黃變褐情況圖1所示，詳細情況展示在圖2中?？梢钥闯觯谧凕S程度上，豫煙13號變黃較快，采后5 d煙葉已經(jīng)到十成黃；LY1306變黃相對緩慢，變黃十成用時7 d。在變褐程度方面，豫煙13號的褐變啟動也較早，在采后5 d出現(xiàn)了變褐的現(xiàn)象，在8 d時葉片已經(jīng)達到三成褐；LY1306褐變出現(xiàn)較晚，在采后7 h表現(xiàn)出變褐跡象，在10 d時煙葉達到三成褐。

圖1 采后煙葉變黃變褐特征Fig.1 Characteristics of yellowing and browning of postharvest tobacco leaves

圖2 豫煙13號和LY1306采后煙葉的變黃和變褐特征Fig.2 The characteristics of yellowing and browning of Yuyan 13 and LY1306 postharvest tobacco leaves

2.2 采后煙葉丙二醛含量的變化

由圖3可知，豫煙13號和LY1306采后煙葉MDA含量呈現(xiàn)出大致相同的趨勢，表現(xiàn)為持續(xù)上升。在采后0～4 d，兩品種（系）煙葉MDA含量差異不顯著。采后6～10 d，豫煙13號的MDA含量高于LY1306，且第8 d、第10 d的差異達到了顯著水平（P＜0.05）。說明LY1306采后煙葉的膜脂過氧化發(fā)展較慢，細胞膜完整性能維持較長時間。

圖3 采后煙葉MDA含量和變化Fig.3 Change of MDA content in postharvest tobacco leaves

2.3 采后煙葉ATP、ADP、AMP含量及能荷值的變化

能荷水平是指在總的腺苷酸系統(tǒng)中所負荷的高能磷酸基的數(shù)量，一定程度上反映了細胞整體的能量狀態(tài)。由圖3-D可知，兩品種（系）煙葉的能荷值隨時間的變化趨勢基本一致，都呈現(xiàn)出先上升后平緩的趨勢，但豫煙13號能荷水平始終高于LY1306。

2.4 采后煙葉細胞色素C還原酶（CCO）活性的變化

由圖4可知，LY1306和豫煙13號兩品種（系）采后煙葉CCO酶活性的變化基本一致，都表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。兩品種（系）煙葉CCO酶活性的峰值都出現(xiàn)在第2 d，但此時LY1306的CCO活性要顯著高于豫煙13號（P＜0.05）。隨后，兩品種（系）煙葉CCO酶活性都出現(xiàn)下降，但LY1306活性下降更多。在采后4～10 d，豫煙13號的CCO酶活性始終高于LY1306。CCO是位于線粒體內(nèi)膜上參與氧化磷酸化反應(yīng)的關(guān)鍵酶，也是呼吸鏈上的末端氧化酶，其主要功能是把呼吸底物上的電子傳遞給分子態(tài)氧，能夠反應(yīng)細胞有氧呼吸的代謝水平。上述結(jié)果表明，豫煙13號采后煙葉CCO活性能夠長時間維持較高水平，有氧呼吸活動更加旺盛。

圖4 采后煙葉ATP(A)、ADP(B)、AMP(C)含量及能荷值(D)的變化Fig.4 Changes of ATP(A), ADP(B), AMP(C) content and EG(D) of postharvest tobacco leaves

2.5 采后煙葉琥珀酸脫氫酶（SDH）活性的變化

由圖5可以看出，兩品種（系）采后煙葉SDH活性均呈現(xiàn)出先增加而后減少的趨勢。不同的是，豫煙13號的SDH活性高峰出現(xiàn)在第2 d，而LY1306的SDH活性高峰出現(xiàn)在第6 d。除開始時和第6 d外，豫煙13號的SDH活性均高于LY1306。琥珀酸脫氫酶（SDH）是TCA循環(huán)中唯一一個整合于膜上的酶類，也是連接氧化磷酸化與電子傳遞的樞紐之一。同時，SDH可為真核細胞線粒體和多種原核細胞需氧和產(chǎn)能的呼吸鏈提供電子，反映了細胞有氧呼吸的狀態(tài)。以上結(jié)果表明，豫煙13號采后煙葉SDH活性較高，促進了TCA循環(huán)的順利進行，有氧呼吸作用更加旺盛。

圖5 采后煙葉細胞色素C還原酶（CCO）活性的變化Fig 5 Change of CCO activity in postharvest tobacco leaves

圖6 采后煙葉琥珀酸脫氫酶（SDH）活性的變化Fig.6 Change of SDH activity in postharvest tobacco leaves

2.6 采后煙葉能量代謝和變黃變褐程度的相關(guān)性分析

為明確能量的代謝與采后煙葉變黃變褐的關(guān)系，對兩品種（系）煙葉變黃變褐程度與ATP、ADP、AMP及能荷進行相關(guān)性分析。由表2可知，ATP、AMP和能荷與變黃程度的相關(guān)系數(shù)分別為0.934**、0.809**和0.835**，且均達到了極顯著水平（P＜0.01），ADP含量與變黃程度呈現(xiàn)負相關(guān)關(guān)系（-0.360）；ATP、ADP、AMP和能荷與變褐程度的相關(guān)系數(shù)分別為0.722**、0.626*、0.931**和0.765**，ATP、ADP、AMP和能荷與變褐程度的相關(guān)關(guān)系達到了極顯著水平（P＜0.01），ADP與變褐程度的相關(guān)關(guān)系達到了顯著水平（P＜0.05）。變黃程度與ATP、AMP和能荷的相關(guān)系數(shù)較大，變褐程度與AMP的相關(guān)系數(shù)較大，表明能量代謝水平與煙葉變黃變褐程度關(guān)系密切。

表2 采后煙葉能量代謝與變黃變褐程度的相關(guān)性分析Tab. 2 Correlation analysis between energy metabolism and the degree of yellowing and browning of postharvest tobacco leaves

2.7 采后煙葉能量代謝與變黃變褐程度的回歸分析

分別以暗箱試驗中煙葉的變黃程度（Y1）、變褐程度（Y2）為因變量，以ATP（X1）、ADP（X2）、AMP（X3）、能荷（X4）作為自變量進行回歸分析，建立起采后煙葉能量代謝對顏色變化貢獻的預(yù)測方程：

Y1=-45.951-0.707X1+2.879X2+6.208X3+63.458X4（R2=0.950，P＜0.01）；

Y2=8.528+0.296X1-0.758X2+19.781X3-13.009X4（R2=0.908；P＜0.01）。

回歸分析的結(jié)果表明，采后煙葉的變黃程度和變褐程度與ATP、ADP、AMP和能荷回歸方程擬合度較好，均達到了極顯著水平（P＜0.01），說明能量代謝水平對采后煙葉的顏色形成有較大的影響。

3 討論

自田間采收的成熟煙葉雖然脫離了植株母體，但仍然處于生命活動狀態(tài)。此時，煙葉自身活動所需的能量只有靠呼吸作用不斷分解自身有機物來提供。園藝作物相關(guān)研究指出，果蔬采后衰老褐變與能量代謝活動存在密切聯(lián)系。在桃[12,14]、雙孢蘑菇[15]、枇杷[16]的研究中均觀察到褐變的發(fā)生與ATP含量和能荷值呈現(xiàn)負相關(guān)關(guān)系，其機理可能是ATP參與脂質(zhì)的合成與脂肪酸的去飽和作用，從而影響膜的理化性質(zhì)和生理功能[17-18]。采后煙葉的變黃變褐過程涉及一系列復(fù)雜的生理生化機制。一般認(rèn)為，煙葉黃化褐變的發(fā)生是由于膜脂過氧化作用加劇，煙葉細胞死亡，細胞膜間的分隔作用被打破導(dǎo)致酶和底物結(jié)合引起的[19-20]。從能量代謝的角度出發(fā)，煙葉黃化褐變最終走向死亡這一過程是能量代謝失衡的結(jié)果[21]。在本試驗中，采后煙葉在暗箱條件下ATP、ADP含量和能荷表現(xiàn)出先上升后下降，AMP含量表現(xiàn)出增加的趨勢，同時伴隨著MDA含量的上升和變黃變褐程度的加重。這表明在采后一段時間煙葉的能量代謝活動先是加強而后出現(xiàn)下降，這與前人的研究結(jié)果有相似之處[22-24]。采后煙葉ATP和ADP含量首先表現(xiàn)出上升，可能是由于煙葉采收后處于一個離體的逆境環(huán)境之中，需要更多的能量來應(yīng)對各種環(huán)境脅迫以維持其生命活動的正常進行[25]。但這種提升只是暫時的，隨著逆境的加深以及煙葉內(nèi)的呼吸底物的減少，此時煙葉細胞內(nèi)產(chǎn)能活動已經(jīng)不能滿足需求。此時，大量的ATP分解為ADP，同時ADP進一步分解為AMP為細胞提供能量，造成ATP、ADP含量下降，而AMP含量的上升的現(xiàn)象。相關(guān)性分析表明，變黃程度與ATP、AMP和能荷相關(guān)性較強，相關(guān)系數(shù)分別為0.934**、0.809**和0.835**（P＜0.01）；變褐程度與AMP相關(guān)性較強，相關(guān)系數(shù)為0.931**（P＜0.01），提示采后煙葉的變黃變褐過程可能與其能量代謝活動有關(guān)。此外，試驗中觀察到兩品種（系）煙葉的ATP含量和能荷值的高峰與煙葉全黃的時間幾乎一致，這與采后果實生理中的“呼吸躍變”現(xiàn)象相似[26]。在梨、香蕉等果實的研究中也報道了呼吸躍變與其顏色變化的關(guān)聯(lián)性[27-28]，表明能量代謝水平與煙葉的黃化褐變過程可能存在一定的因果關(guān)系。豫煙13號和LY1306一定程度上代表了煙葉的易烤性和耐烤性兩個方面。從能量代謝的角度來看，易烤性好的煙葉代表其逆境環(huán)境敏感，能量代謝提升迅速，變黃啟動早變黃快且容易變褐；耐烤性好的煙葉代表其對逆境環(huán)境耐受性較強，能量代謝提升相對緩慢，變黃啟動晚且不易變褐。在本研究中，豫煙13號采后煙葉ATP含量和能荷水平更高且更早達到高峰，變黃啟動更早也更易變褐，表明豫煙13號煙葉對逆境環(huán)境表現(xiàn)更敏感，在烤房中也更易變黃；LY1306采后煙葉能量代謝活動高峰出現(xiàn)較晚，變黃啟動時間和褐變發(fā)生也更晚，表明LY1306受逆境環(huán)境的耐受性較強，提示高水平的能量代謝活動可能加速了采后煙葉的黃化褐變過程。Meyer[29]的研究也指出衰老的煙草葉片的反而能夠保持較高的能荷值，這與在果蔬研究中提出的“能量缺乏”的觀點相反[30]。其原因可能是高水平的能量代謝活動會產(chǎn)生大量的活性氧[31]，破壞煙葉細胞膜的完整性，加速了采后煙葉變黃變褐的過程。

線粒體是細胞能量代謝的樞紐，通過氧化磷酸化作用為各種生命活動提供能量[32]。細胞色素氧化酶（CCO）是位于線粒體內(nèi)膜上參與氧化磷酸化反應(yīng)的關(guān)鍵酶，也是呼吸鏈上的末端氧化酶，其主要功能是把呼吸底物上的電子傳遞給分子態(tài)氧[33]。琥珀酸脫氫酶（SDH）是TCA循環(huán)中唯一一個整合于線粒體膜上的酶類，可為真核細胞線粒體和多種原核細胞需氧和產(chǎn)能的呼吸鏈提供電子[34]。SDH和CCO是反應(yīng)線粒體功能的標(biāo)志酶。在本試驗中，采后煙葉SDH和CCO酶活性呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，與ATP含量的變化相一致。與LY1306相比，豫煙13號SDH和CCO活性明顯處于較高水平，這表明豫煙13號對采摘的響應(yīng)更強烈，有著更高水平的能量代謝活動。高水平的能量代謝伴隨著強烈的氧化磷酸化活動造成活性氧的積累，過剩的活性氧會誘導(dǎo)或加劇膜脂過氧化，從而導(dǎo)致了豫煙13號變黃變褐更早更快的發(fā)生[35]。除SDH和CCO活性外，能量代謝活動還受到一系列因素的影響[36]。有研究指出烘烤過程中豫煙13號煙葉淀粉酶的活性較高[37]，這可能是其能量代謝活動旺盛的原因之一。從生產(chǎn)的角度出發(fā)，繼續(xù)研究煙葉的哪些與能量代謝相關(guān)的性狀（如呼吸底物的含量、組成、呼吸酶活性等）影響了其對采后逆境的敏感性，是改善品種烘烤特性，制定適宜烘烤工藝時應(yīng)首要考慮的問題。

4 結(jié)論

（1）隨著采后時間的延長，煙葉的變黃程度、變褐程度和MDA含量逐漸增加。與LY1306相比，豫煙13號煙葉變黃變褐發(fā)生的早，MDA含量增長較快。（2）采后煙葉的ATP和ADP含量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，AMP含量則逐漸上升。與LY1306相比，豫煙13號采后煙葉ATP含量、AMP含量和能荷較高，而ADP含量較低，表明豫煙13號采后能量代謝活動較高。（3）豫煙13號采后煙葉的SDH和CCO活性比LY1306更高，活性下降的也更緩慢，表明豫煙13號的線粒體功能保持更好，產(chǎn)能活動和氧化磷酸化水平更旺盛。（4）相關(guān)分析表明，變黃程度與ATP、AMP和能荷相關(guān)性較強，相關(guān)系數(shù)分別為0.934**、0.809**和0.835**（P＜0.01）；變褐程度與AMP相關(guān)性較強，相關(guān)系數(shù)為0.931**（P＜0.01），回歸分析表明采后煙葉的變黃程度和變褐程度與ATP、ADP、AMP和能荷的回歸方程擬合度較好。（5）與LY1306相比，豫煙13號更容易變黃和變褐，能量代謝活動更旺盛。采后煙葉的變黃變褐過程可能與其能量代謝活動有關(guān)。