劉曉涵，李雪利，王悅霖，宋佳倩，徐亮，葉協(xié)鋒，吳東，王靜*

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，國家煙草栽培生理生化研究基地，煙草行業(yè)煙草栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002；

2 廣東省韶關(guān)煙葉復(fù)烤有限公司，韶關(guān) 512000；

3 中國煙草總公司職工進(jìn)修學(xué)院，鄭州 450002；

4 湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，武漢 430000

鹽脅迫是威脅全球作物產(chǎn)量和品質(zhì)的環(huán)境因素之一。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中過量的化肥施用以及使用低質(zhì)量的灌溉水，愈發(fā)加劇了土壤鹽漬化的進(jìn)程。目前，全球超過20%的耕地受到鹽漬化的危害，而這個(gè)數(shù)字還在逐年增長[1]。在鹽脅迫中Na+起關(guān)鍵的脅迫作用，過多的Na+會(huì)阻礙植物對(duì)營養(yǎng)離子的吸收，最終導(dǎo)致植物體內(nèi)離子失衡[2]。此外Na+大量進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)，一方面導(dǎo)致植物體內(nèi)Na+/K+比值升高，會(huì)置換質(zhì)膜的鈣，另一方面會(huì)破壞質(zhì)膜上的膜保護(hù)系統(tǒng)，致使膜脂過氧化作用加劇，離子外滲造成礦質(zhì)營養(yǎng)的缺失[3]。同時(shí)在煙草種植過程中，硫酸鉀作為追施鉀肥的主要來源，在煙草生產(chǎn)中廣泛使用，其用量在75～360 kg/hm2[4-5]；煙草吸收K+后，大量的SO42-被殘留在土壤中，成為煙田鹽漬化的隱患。近年來調(diào)查發(fā)現(xiàn)，植煙土壤已經(jīng)出現(xiàn)次生鹽漬化現(xiàn)象[6-8]，2017年對(duì)洛陽典型煙區(qū)的土壤狀況調(diào)查發(fā)現(xiàn)，SO42-含量普遍高于0.35 g/kg，并且隨著硫酸鉀使用的增多以及植物吸收量的限制導(dǎo)致土壤中SO42-逐年富集[9]。對(duì)番茄[10]、小麥[11]、沙棗[12]等作物的研究表明，高濃度SO42-具有明顯的毒性，影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。但煙草在這方面的研究還較少，因此，研究過量硫酸鈉對(duì)煙草造成的危害并尋找可能的緩解途徑是十分必要的。

通過外源添加緩解物質(zhì)調(diào)控植物的耐鹽性是保證鹽漬化土壤安全、高效生產(chǎn)的重要措施。研究表明，一些植物生長調(diào)節(jié)劑能通過增加滲透壓以及提高抗氧化酶的活性，提高植物對(duì)非生物脅迫的抗性[13-14]。肉桂醛作為一種添加劑廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥和工業(yè)研究中，其具有較強(qiáng)的殺菌消毒功能，常用保鮮防腐防霉劑。它能夠調(diào)節(jié)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的含量且能提高部分抗氧化酶的活性來消除ROS，從而達(dá)到消炎目的[15-16]；WU等[17]用肉桂醛熏蒸處理柑橘，發(fā)現(xiàn)肉桂醛熏蒸處理能夠顯著提高超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性，繼而降低果實(shí)酸敗腐病的發(fā)生率。WANG等[18]發(fā)現(xiàn)肉桂醛能夠提高獼猴桃的抗氧化能力并延緩其衰老。

本研究選擇硫酸鈉為鹽脅迫處理，肉桂醛為緩解劑，煙草品種K326作為研究對(duì)象，通過測量煙草幼苗根長、化學(xué)染色和qRT-PCR等方法，探究肉桂醛提高煙草幼苗耐鹽脅迫的機(jī)理，以期為提高植物耐鹽性研究以及鹽漬化土壤改良提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試品種：K326（由玉溪中煙種子有限公司提供）。

1.2 試驗(yàn)方法

用0.2%的高錳酸鉀將煙草種子消毒，消毒后用無菌水沖洗5～7次，將其種在MS培養(yǎng)基中，然后將培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱中（光輻射200 μmol/m2/s，光照周期12 h/12 h（光/暗），相對(duì)濕度75%，溫度22℃）正常培養(yǎng)5 d，5 d后挑選長勢(shì)一致的幼苗（根長約5～6 cm）轉(zhuǎn)移到添加0～250 mmol/L硫酸鈉處理的培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)5 d。通過測量煙草幼苗根系長度，確定能夠引起根伸長下降50%的硫酸鈉濃度（定義為EC50濃度）。采用Na2SO4脅迫的EC50濃度，選擇0～30 μmmol/L的肉桂醛進(jìn)行處理，通過對(duì)根長的測定篩選出能夠有效緩解Na2SO4脅迫的最佳肉桂醛濃度。后續(xù)試驗(yàn)將采用以下4個(gè)處理：CK（正常培養(yǎng)）、T1（75 mmol/L硫酸鈉處理）、T2（20 μmmol/L肉桂醛處理）、T3（75 mmol/L硫酸鈉和20 μmmol/L肉桂醛處理）。

1.3 指標(biāo)測定及方法

1.3.1 幼苗根長測定

在加入處理5 d后測量根長，每個(gè)處理測量30株幼苗根長。

1.3.2 幼苗鮮質(zhì)量測定

各處理分別收集處理5 d后的幼苗100株，用濾紙吸干幼苗表面水分，稱重（以100株為單位），每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3.3 DAB和NBT染色

按照Frahry和Schopfer[19]的方法，用氮藍(lán)四唑（NBT）對(duì)根尖染色以檢測內(nèi)源O2·-，用超景深顯微鏡觀察并拍照。

葉片內(nèi)源H2O2可采用Nguyen等[20]的方法，用二甲基聯(lián)苯胺（DAB）進(jìn)行染色，用超景深顯微鏡觀察并拍照。

1.3.4 煙苗生理指標(biāo)測定

收集處理5 d后的幼苗整株，用液氮冷凍保存，用于生理指標(biāo)測定，每個(gè)處理重復(fù)取樣3次。H2O2、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量，過氧化物酶（Peroxidase，POD）、SOD和過氧化氫酶（Catalase，CAT）活性使用試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)公司）測定。

SOD活性單位定義U：黃嘌呤氧化藕聯(lián)反應(yīng)體系中抑制百分率為50%時(shí)，反應(yīng)體系中的SOD酶活力定義為一個(gè)酶活力單位（U/mL）；POD活性單位定義U：每克組織在每毫升反應(yīng)體系中每分鐘A470變化0.01為一個(gè)酶活單位；CAT活性單位定義：每克組織每分鐘催化1 nmol H2O2降解定義為一個(gè)酶活力單位。

1.3.5 SOD和GSH基因轉(zhuǎn)錄分析

各處理分別收集處理5 d后的幼苗1 g，迅速液氮凍存研磨，立即采用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（real-time qRT-PCR）兩步法測定轉(zhuǎn)錄水平，每個(gè)處理重復(fù)3次。RNA的提取采用成都福際生物公司試劑盒說明書的方法進(jìn)行（Plant Total RNA Isolation Kit），RNA提取后用NanoDrop One/OneC微量核酸蛋白濃度測定儀檢測其濃度和純度，并立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。cDNA的反轉(zhuǎn)錄使用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行，具體操作步驟詳見反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明書。合成的cDNA于-80℃條件下保存?zhèn)溆?。根?jù)煙草基因組數(shù)據(jù)庫的核苷酸序列設(shè)計(jì)特異性引物（表1），qRT-PCR采用LightCycler? 480II 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，反應(yīng)條件為：94℃ 2 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 2 min。煙草的管家基因Actin作為計(jì)算時(shí)的內(nèi)參基因，相對(duì)表達(dá)量計(jì)算采用2-ΔΔCt方法計(jì)算。

表1 RT-PCR引物序列Tab. 1 Primers for qRT-PCR

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2017和SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和差異顯著性檢驗(yàn)（α=0.05）。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 篩選適宜的硫酸鈉脅迫濃度和肉桂醛緩解濃度

由圖1A可知，煙草幼苗對(duì)于Na2SO4十分敏感，處理3 d和處理5 d，加入Na2SO4處理的煙草幼苗較未加Na2SO4處理的煙草幼苗根系增長量和幼苗鮮重降低，H2O2含量增加。在正常培養(yǎng)基中處理5 d，煙苗根長平均增長7.4 mm，加入100 mmol/L的Na2SO4后煙苗根長增長量相較未加Na2SO4平均降低5.6 mm，鹽濃度越高，煙苗根長越短。煙苗鮮重的變化趨勢(shì)與根長增長量一致，表現(xiàn)為Na2SO4濃度越高，煙苗生長受抑制效果越嚴(yán)重。對(duì)各處理H2O2含量分析可知（圖1B），在處理5 d后，未加鹽處理的H2O2含量最低，為0.65 μmol/g；當(dāng)Na2SO4濃度達(dá)到250 mmol/L時(shí)，H2O2的積累量為未加鹽處理的214.67%。數(shù)據(jù)計(jì)算使煙苗根伸長降低至對(duì)照一半時(shí)的Na2SO4濃度為75 mmol/L，因此選擇該濃度作為鹽處理濃度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 硫酸鈉和肉桂醛處理對(duì)煙苗的影響Fig.1 Effects of sodium sulfate and cinnamaldehyde on tobacco plant

加入肉桂醛后，煙苗的根長增長量和鮮重都較未加肉桂醛處理有增加，其中在肉桂醛濃度為20 μmol/L時(shí)，效果最明顯，根長增長量較未加肉桂醛處理增長79.6%，幼苗鮮重增長46.0%。這些結(jié)果表明，使用肉桂醛能夠緩解鹽脅迫對(duì)煙草幼苗生長的抑制作用，促進(jìn)煙草幼苗的生長，其最適濃度為20 μmol/L。

2.2 肉桂醛對(duì)硫酸鈉脅迫下煙草幼苗的緩解作用

2.2.1 對(duì)煙草幼苗生長量的影響

由圖2A可知，CK和T2處理，煙草幼苗的根長無明顯差別，T1處理煙苗根長明顯縮短，加入肉桂醛以后（T3處理），根長有所增長。煙苗根長5 d后，CK的煙苗根長增長量為8.11 mm，單獨(dú)使用肉桂醛對(duì)根長影響不大，其根長增長量為8.09 mm；T1處理煙草幼苗的根長增長幅度明顯降低，僅為2.20 mm；而T3處理明顯促進(jìn)根長增長，較T1處理增長92.45%（圖2B）。

煙苗鮮重表現(xiàn)出與根長相同的變化趨勢(shì)，單獨(dú)使用肉桂醛煙苗的鮮重為0.49 g，相較CK僅降低了0.02 g，總體比較無明顯差異；在鹽脅迫下煙苗生長受到明顯抑制，煙苗鮮重為0.28 g，在鹽與肉桂醛混合處理中，煙苗鮮重較鹽處理有所增加，為0.36 g（圖2C）。

圖2 硫酸鈉和肉桂醛處理對(duì)對(duì)煙苗生長的影響Fig.2 Effects of sodium sulfate and cinnamaldehyde on tobacco growth

2.2.2 對(duì)H2O2和MDA含量的影響

鹽分和肉桂醛對(duì)煙草幼苗H2O2和MDA含量有顯著影響。鹽脅迫引起煙草幼苗活性氧過量產(chǎn)生，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞膜損傷。組織化學(xué)染色可以清楚顯示煙苗體內(nèi)O2·-和H2O2的分布，分別為帶有深藍(lán)色斑點(diǎn)和棕色斑點(diǎn)，從圖3A和圖3B可以看出，CK處理的O2·-和H2O2的含量均較少，葉片中無明顯褐色，根部無明顯藍(lán)色；T1處理葉片分布較多褐色斑塊，尤其是幼芽部分顏色較重，根尖能看到明顯藍(lán)色，表明鹽能促進(jìn)幼苗體內(nèi)ROS的產(chǎn)生；T2處理中，O2·-的產(chǎn)生較少，但從根尖染色可以看出，在根表面有藍(lán)色附著，表明肉桂醛會(huì)調(diào)節(jié)H2O2的產(chǎn)生；在T3處理中，褐色區(qū)域只分布在嫩芽，在根尖部分區(qū)域呈藍(lán)色斑點(diǎn)，其余部分藍(lán)色相對(duì)鹽處理明顯減少。

數(shù)據(jù)與染色圖片表現(xiàn)一致，從圖3C和3D可知，CK處理H2O2和MDA含量都處于較低水平；在75 mmol/L Na2SO4處理下，H2O2和MDA含量均大幅度升高，分別為1.07 nmol/g和28.62 nmol/g，較CK增長了160.0 %和137.1%。單獨(dú)添加肉桂醛可以增加H2O2和MDA含量，但與CK相比無明顯差異。而在鹽脅迫下添加肉桂醛較單獨(dú)鹽處理降低了幼苗H2O2和MDA含量，其含量分別為0.74 nmol/g和21.51 nmol/g。結(jié)果表明，在鹽脅迫下，添加肉桂醛能顯著減少鹽脅迫誘導(dǎo)的H2O2和MDA。

圖3 處理5d后煙草幼苗體內(nèi)活性氧積累狀況Fig.3 Reactive oxygen species accumulation in tobacco seedlings after treatment for 5 days

2.2.3 對(duì)抗氧化酶活性的影響

對(duì)煙草幼苗的SOD、CAT和POD活性進(jìn)行比較表明，4個(gè)處理中，T1處理的SOD和POD活性最高，分別為172.28 U/g·FW 和10627 U/ g·FW，CAT酶活在T3處理中最高，為467.3 U/g·FW；CK中三種酶的活性均最低；而鹽脅迫和肉桂醛處理后，SOD活性較CK處理增加，但相比鹽處理有明顯降低趨勢(shì)，POD酶活與CK相比無顯著差異，鹽脅迫和肉桂醛的相互作用促進(jìn)了CAT酶活的增強(qiáng)。通過三種抗氧化酶活性的變化可以看出，鹽脅迫條件下添加肉桂醛可以提高CAT酶活，但在一定程度上會(huì)降低POD和SOD酶活。

2.2.4 對(duì)抗氧化相關(guān)基因表達(dá)量的影響

為了進(jìn)一步研究肉桂醛對(duì)與鹽脅迫下煙草幼苗在轉(zhuǎn)錄水平上的作用，我們對(duì)非酶抗氧化系統(tǒng)和酶抗氧化系統(tǒng)中的兩個(gè)關(guān)鍵基因SOD和GSH（還原性谷胱甘肽，Glutathione）表達(dá)量進(jìn)行研究。從表5可以看出，鹽處理幼苗的SOD和GSH的表達(dá)水平都較高，分別是CK的3.4倍和2.0倍；在T3處理中SOD的表達(dá)量明顯降低，接近CK的水平，而GSH的表達(dá)量在四個(gè)處理中最高。這表明，受到鹽脅迫之后，煙苗體內(nèi)抗氧化基因快速表達(dá)，而肉桂醛的使用可以降低SOD的相對(duì)表達(dá)量，誘導(dǎo)GSH的高表達(dá)。

圖4 處理5 d后煙草幼苗體內(nèi)抗氧化酶活性Fig.4 Antioxidant enzyme activity in tobacco seedlings after treatment for 5 days

圖5 處理5d后煙草幼苗SOD和GSH基因的表達(dá)量Fig.5 Expression levels of SOD and GSH genes in tobacco seedlings after treatment for 5 days

3 討論

土壤鹽堿化是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的一個(gè)嚴(yán)重問題，制約了可持續(xù)農(nóng)業(yè)的發(fā)展[21]。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，湖南和河南部分植煙土壤已經(jīng)出現(xiàn)次生鹽漬化現(xiàn)象[7-9]，馬靜等[22]通過對(duì)烤煙葉肉細(xì)胞亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Na2SO4濃度為200 mmol/L時(shí)，葉綠體結(jié)構(gòu)膨脹、線粒體內(nèi)膜溶解、細(xì)胞核萎縮、核仁解體。本研究發(fā)現(xiàn)隨著Na2SO4濃度的升高，煙苗根長增長速率減緩，生物積累量降低，并且誘導(dǎo)H2O2的大量產(chǎn)生。當(dāng)添加20 μmol/L的肉桂醛后，煙草幼苗可以部分恢復(fù)在鹽脅迫下的生長能力，根長增長速率較鹽處理增加，生物積累量也有所增加，這表明肉桂醛對(duì)緩解鹽脅迫有一定的效果。

鹽脅迫會(huì)誘導(dǎo)ROS的積累，這是氧化應(yīng)激的必然產(chǎn)物，過量的ROS會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用[23]。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照相比，Na2SO4脅迫的幼苗體內(nèi)MDA和H2O2的積累顯著增加；Na2SO4與肉桂醛同時(shí)處理后H2O2和MDA含量明顯降低，這與錢霄晨等[24]的研究結(jié)果一致，可能是肉桂醛降低了鹽誘導(dǎo)的H2O2積累和脂質(zhì)過氧化所造成的潛在影響。孫琦和王帆等[15-16]研究表明肉桂醛作為一種外源添加劑能夠調(diào)節(jié)ROS的含量且能提高部分抗氧化酶的活性來消除ROS；也有研究指出肉桂醛可能通過加成反應(yīng)導(dǎo)致Ca2+外排進(jìn)而影響ROS的產(chǎn)生[25]；后有研究證明，肉桂醛能夠通過抑制丙二醛（MDA）含量上升，促進(jìn)脯氨酸的積累量，從而延緩香菇的衰老[26]。

為了保護(hù)自身免受氧化應(yīng)激，植物進(jìn)化出了酶和非酶活性氧清除系統(tǒng)，這些系統(tǒng)在保護(hù)膜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能以及維持細(xì)胞氧化還原狀態(tài)方面起著至關(guān)重要的作用[27]。在植物中，超氧化物歧化酶（SOD）是將O2·-轉(zhuǎn)入H2O2和O2的第一道防線，隨后H2O2通過CAT、POD、抗壞血酸—谷胱甘肽循環(huán)等作用轉(zhuǎn)化為水而消除[28]。本試驗(yàn)的研究結(jié)果表明，鹽處理能顯著提高煙草幼苗SOD、POD和CAT的活性，而使用肉桂醛后增強(qiáng)了CAT活性，這表明肉桂醛誘導(dǎo)的鹽脅迫下H2O2的含量的降低導(dǎo)致SOD和POD并不需要非?；钴S就能夠達(dá)到清除活性氧的目的，這與Mishra等[29]的結(jié)果相似，而較高的CAT活性對(duì)于清除H2O2有著起到延緩效果，能夠保證在O2·-轉(zhuǎn)入H2O2后將其有效清除。同時(shí)GSH清除H2O2的能力強(qiáng)，在煙草抗病和逆境脅迫研究過程中起著重要的作用[30-31]。本研究中鹽處理幼苗的SOD和GSH快速表達(dá)，添加肉桂醛后誘導(dǎo)GSH的高表達(dá)，推測該基因的大量表達(dá)可以提高植株的抗氧化能力從而提高煙草幼苗對(duì)鹽脅迫的耐受能力。WU[17]和WANG[18]等發(fā)現(xiàn)肉桂醛能夠顯著提高植物的抗氧化能力，這些結(jié)果證實(shí)了肉桂醛對(duì)于脅迫條件下植物的抗氧化系統(tǒng)存在調(diào)控作用。

4 結(jié)論

隨著硫酸鈉濃度的升高，煙苗受到的抑制作用越明顯，根系生長減緩，植株鮮重降低，H2O2積累增加，而肉桂醛的使用可以有效緩解這種脅迫作用。在75 mmol/L Na2SO4處理中加入20 μmol/L的肉桂醛可以促進(jìn)煙草幼苗根系的生長，更好的促進(jìn)營養(yǎng)積累；同時(shí)可以有效降低MDA和H2O2的積累，減緩氧化應(yīng)激給煙苗造成的傷害，從而降低SOD和POD的酶活；并誘導(dǎo)CAT酶活的提高來增強(qiáng)煙苗的抗鹽能力。