陳 琳 胡博森 周 波 陳 擁

1.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110034；2.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院骨科，遼寧沈陽(yáng) 110024

骨質(zhì)疏松癥是常見(jiàn)的慢性病，伴有骨量及微結(jié)構(gòu)系統(tǒng)性損傷，易引發(fā)脆性骨折。21 世紀(jì)以來(lái)，隨著老齡化加劇，慢性病發(fā)病率逐年升高。骨質(zhì)疏松癥等慢性病已是全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside，C3G）是花色苷最常見(jiàn)的形式[2-3]，因其具有抗氧化的作用，可對(duì)多種慢性病的防治產(chǎn)生積極效應(yīng)，如糖尿病[4]、癌癥[5]、神經(jīng)系統(tǒng)疾病[6]和心血管疾病[7]等。研究顯示[8-10]，花色苷可減緩骨質(zhì)流失。亦有研究發(fā)現(xiàn)，C3G 能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化，但機(jī)制尚未明確[11]。叉頭盒蛋白O1（forkhead box O1，F(xiàn)OXO1）是成骨過(guò)程中的氧化調(diào)節(jié)因子，與成骨細(xì)胞活性關(guān)系密切[12]。c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun Nterminal kinase，JNK）通路與骨質(zhì)疏松有關(guān)，但調(diào)節(jié)方向不明。有研究顯示，JNK/FOXO1 與氧化應(yīng)激及成骨細(xì)胞增殖和分化有關(guān)[12-14]。本研究將探討C3G 對(duì)人原代成骨細(xì)胞JNK/FOXO1的影響，及對(duì)轉(zhuǎn)錄激活因子-4（activiating transcripition factor-4，ATF4）和骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）mRNA 表達(dá)水平的影響，對(duì)以C3G 為主成分的骨質(zhì)疏松類(lèi)保健品開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

C3G（大連美侖生物技術(shù)有限公司，純度>98%，批號(hào)：7084-24-4）；MTT 試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：G020-1-1）；Trizol 試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒（日本TaKaRa 公司，批號(hào)：9108、RR037A、RR820A）。

細(xì)胞培養(yǎng)箱（BB-15，Thermo Fisher Scientific）；酶標(biāo)儀（SpectraMax Plus 384，Moleclar Devices）；核酸分析儀（Nano，Thermo Fisher Scientific）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（7500FAST，ABI）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人原代成骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

本研究方案經(jīng)學(xué)校倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書(shū)。收集2017 年6 月至2018 年6 月沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院60～90 周歲的骨質(zhì)疏松且股骨頸或股骨粗隆間骨折行人工股骨頭或全髖置換患者的松質(zhì)骨組織。將其剪碎至直徑約3 mm，PBS 沖洗后，加入紅細(xì)胞裂解液。室溫條件下充分混勻。隨后，棄裂解液，加胰蛋白酶，再加入雙酶消化液。離心取沉淀即為人原代成骨細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀重懸，移至培養(yǎng)瓶中（α-MEM 細(xì)胞培養(yǎng)液含有10% FBS），37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每4 天換液1 次，細(xì)胞1∶2 傳代。第三代及以后的細(xì)胞可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT 法檢測(cè)C3G 對(duì)人成骨細(xì)胞增殖的影響

設(shè)置分組：control 組（含0 μmol/L C3G的α-MEM培養(yǎng)液）、C3G 組（含100 μmol/L C3G的α-MEM 培養(yǎng)液）。細(xì)胞以4000 個(gè)/孔的密度接種于96 孔板，各組經(jīng)無(wú)血清同步化處理24 h 后加入各處理因素。24 h后使用MTT 法分析成骨細(xì)胞增殖的情況，按試劑盒說(shuō)明操作。使用酶標(biāo)儀在570 nm 處測(cè)定吸光度。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)基因表達(dá)

1.2.3.1 C3G 對(duì)細(xì)胞FOXO1、ATF4 和OPG的基因表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)分組同“1.2.2”項(xiàng)下。細(xì)胞以1.4×106個(gè)/皿接種在10 cm 培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后使用無(wú)血清培養(yǎng)基處理24 h，同步化處理后處理各組細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集樣本。使用Trizol 法抽提細(xì)胞總RNA，隨后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以GAPDH 基因?yàn)閮?nèi)參，2-ΔΔCt方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。使用Primer Blast 設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物公司合成，F(xiàn)OXO1、ATF4 和OPG的引物序列見(jiàn)表1。按TaKaRa 試劑盒要求配置反應(yīng)混合液：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ10 μl，ROX Reference Dye Ⅱ0.4 μl；，RNase-Free ddH2O 0.6 μl，引物預(yù)混液1 μl，稀釋好的cDNA 8 μl，總體系為20 μl。反應(yīng)條件為：95℃條件下，預(yù)變性2 min，接著40 個(gè)循環(huán)，95℃、5 s；冷卻到60℃、34 s，延伸到68℃、30 s；然后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，收集熒光信號(hào)，進(jìn)行熔解曲線分析。

表1 引物序列

1.2.3.2 JNK 信號(hào)通路抑制劑和C3G 對(duì)細(xì)胞FOXO1基因表達(dá)的影響 設(shè)置分組：SP600125-control 組（含0 μmol/L C3G 和50 μmol/L SP600125的α-MEM 培養(yǎng)液）、SP600125-C3G 組（含100 μmol/L C3G 和50 μmol/L SP600125的α-MEM 培養(yǎng)液）。將細(xì)胞密度調(diào)節(jié)至1.4×106個(gè)/皿后接種在10 cm 培養(yǎng)皿中。細(xì)胞貼壁后，無(wú)血清培養(yǎng)基同步化處理。在同步化處理結(jié)束前4 h使用含有50 μmol/L的SP600125 抑制劑的α-MEM培養(yǎng)基對(duì)兩組細(xì)胞進(jìn)行預(yù)孵。待孵育結(jié)束后按上述實(shí)驗(yàn)分組分別加入相應(yīng)的干預(yù)因素處理細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用“1.2.3.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行樣品總RNA 提取和FOXO1 基因表達(dá)檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 C3G 對(duì)人原代成骨細(xì)胞增殖活力的影響

C3G 組人原代成骨細(xì)胞增殖率高于control 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 control 組與C3G 組細(xì)胞增殖率比較（n=3）

2.2 C3G 對(duì)人原代成骨細(xì)胞FOXO1、ATF4 和OPG mRNA 表達(dá)水平的影響

C3G 組人原代成骨細(xì)胞FOXO1、ATF4、和OPG mRNA 相對(duì)表達(dá)量低于control 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 control 組與C3G 組FOXO1、ATF4 和OPG mRNA 表達(dá)水平比較（n=3）

2.3 JNK 信號(hào)通路抑制劑處理后C3G 對(duì)人原代成骨細(xì)胞FOXO1 mRNA 表達(dá)水平的影響

SP600125-control 組和SP600125-C3G 組FOXO1的mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 SP600125 處理后control 組與C3G 組FOXO1 基因表達(dá)量比較（n=3）

3 討論

骨質(zhì)疏松實(shí)質(zhì)是骨重塑和吸收異常[15]，而成骨細(xì)胞在骨重塑中發(fā)揮著重要作用，而氧化應(yīng)激是其影響因素[16]。C3G 具有抗氧化能力[11,17-19]，在骨代謝中可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖分化，但未闡明機(jī)制。

FOXO1 被證明是骨質(zhì)量的調(diào)節(jié)因子，與ATF4 和OPG 等基因聯(lián)系密切，在成骨細(xì)胞中相互影響[21]。ATF4位于FOXO1 通路下游，是關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)受FOXO1的調(diào)控，F(xiàn)OXO1 與ATF4 相互作用可調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的蛋白合成和氧化應(yīng)激[22]。FOXO1 基因缺失，常伴隨OPG 表達(dá)水平降低[23]。Guo 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，C3G能使脂肪細(xì)胞FOXO1的含量下降，從而改善機(jī)體的炎癥水平。本研究結(jié)果顯示，C3G 能下調(diào)FOXO1、ATF4和OPG的表達(dá)，故認(rèn)為C3G 在成骨細(xì)胞中發(fā)揮抗氧化抗炎作用與FOXO1 有關(guān)。

研究顯示，成骨細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷時(shí)，JNK/FOX 信號(hào)軸能產(chǎn)生抵抗作用[11]，F(xiàn)OXO1 向核的移動(dòng)能促進(jìn)JNK 活化[25]。Yan 等[26]研究發(fā)現(xiàn)，以C3G 為主成分的花色苷能消除氧化應(yīng)激導(dǎo)致的HepG2 細(xì)胞p-JNK 和FOXO1 上調(diào)。使用JNK 通路的抑制劑SP600125對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理后，兩組FOXO1 表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。提示當(dāng)JNK 受到抑制時(shí)，C3G的加入不能改變FOXO1的基因表達(dá)，C3G 可能通過(guò)JNK 通路對(duì)人成骨細(xì)胞FOXO1 mRNA的表達(dá)量產(chǎn)生影響。

綜上所述，本研究使用人原代成骨細(xì)胞模型，觀察C3G 對(duì)人原代成骨細(xì)胞增殖活力的影響以及對(duì)FOXO1、ATF4 和OPG 表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)C3G 能促進(jìn)人原代成骨細(xì)胞的增殖，C3G 可以下調(diào)人原代成骨細(xì)胞中的FOXO1、ATF4 和OPG的基因表達(dá)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)C3G 能夠通過(guò)影響JNK 來(lái)進(jìn)一步影響FOXO1。本研究結(jié)果為以C3G 為主成分的骨質(zhì)疏松類(lèi)保健品開(kāi)發(fā)提供理依據(jù)。由于轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性及體外實(shí)驗(yàn)與實(shí)際的體內(nèi)情況存在差異性，關(guān)于C3G影響成骨細(xì)胞增殖的具體分子機(jī)制仍需要大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。