李亞蒙 侯亞威 徐玉坤 李 芮

1.山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，山東濟(jì)南 250000；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，山東濟(jì)南 250000

水陸二仙丹（金櫻子-芡實(shí)）出自《洪氏經(jīng)驗(yàn)方》，金櫻子生于山上謂之“仙”，味酸甘澀，性平，固精縮尿；芡實(shí)生于水中，味甘澀，性亦平，益腎固精；二者用于治療男子遺精白濁，女子帶下及小便頻數(shù)、遺尿等癥狀[1]。

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，但與糖代謝紊亂密切相關(guān)，作為最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，DN 已成為終末期腎病主要發(fā)病原因，臨床上多采用葡萄糖控制、脂質(zhì)調(diào)節(jié)、抗氧化和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑等措施，但效果不理想[2]。因此運(yùn)用中西醫(yī)結(jié)合的治療方式被學(xué)者普遍認(rèn)同，在傳統(tǒng)祖國(guó)醫(yī)學(xué)中，DN 屬于“消渴”“水腫”等范疇，中藥能夠明顯延緩DN的進(jìn)展，減輕患者痛苦。其中水陸二仙丹是治療DN的常用處方，并取得良好成效[3]。

現(xiàn)為明確水陸二仙丹治療DN的具體分子機(jī)制，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，并進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，明確作用靶點(diǎn)及分子機(jī)制，為進(jìn)一步探索DN的發(fā)病機(jī)制及開(kāi)發(fā)新的治療藥物提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 藥物相關(guān)靶點(diǎn)的篩選

通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)尋找2 味中藥化學(xué)組成成分，并進(jìn)行ADME 篩選，按照口服生物利用度≥30%和類(lèi)藥性≥0.18 兩個(gè)閾值初步獲得藥物有效活性成分及其作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，并通過(guò)TCMID 及中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方搜集2015 年1 月至2020 年9 月的文獻(xiàn)補(bǔ)充未預(yù)測(cè)到的靶點(diǎn)，刪除未預(yù)測(cè)到的靶點(diǎn)有效活性成分，將篩選后得到的靶點(diǎn)統(tǒng)一在Uniprot 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)規(guī)范化合物作用靶點(diǎn)[4]。

1.2 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將藥物活性成分及靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 中，構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 疾病相關(guān)靶點(diǎn)的篩選

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中挖掘DN的潛在靶點(diǎn)，該數(shù)據(jù)庫(kù)Score 值越高則代表該靶點(diǎn)與疾病關(guān)系越密切。根據(jù)學(xué)者經(jīng)驗(yàn)，疾病靶點(diǎn)過(guò)多，則設(shè)為Score≥中位數(shù)的目標(biāo)靶點(diǎn)為DN的潛在靶點(diǎn)，并在TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)及DRUGBANK 中尋找DN 靶點(diǎn)予以補(bǔ)充，刪除4 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的重復(fù)值得到DN 靶點(diǎn)。

1.4 維恩圖及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為明確“藥物-疾病”靶點(diǎn)間的相互作用，利用R語(yǔ)言繪制二者維恩圖，獲得交集靶點(diǎn)。將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING11.0 版數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行PPI 分析，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)出tsv 格式文本，并將其文本導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 中，借助MCODE 插件，對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)中緊密區(qū)域進(jìn)行提取及可視化[5]。

1.5 藥物-疾病靶點(diǎn)功能與通路富集分析

將“1.4”項(xiàng)下交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape 平臺(tái)，物種選擇H.Sapiens（70），設(shè)置均為默認(rèn)值，完成其主要的GO 生物學(xué)過(guò)程及KEGG 信號(hào)通路分析，通過(guò)生物信息學(xué)平臺(tái)對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

1.6 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

通過(guò)Cytoscape 3.7.2 構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，對(duì)交集的網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，包括連接度、介度中心性、緊密度中心性，據(jù)此探究水陸二仙丹治療DN發(fā)揮作用的主要成分、靶點(diǎn)及通路。

1.7 分子對(duì)接驗(yàn)證

將“1.6”項(xiàng)下主要成分與靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，依據(jù)TCMSP 搜索化合物小分子2D 結(jié)構(gòu)，采用Chem-Draw 19.0 繪出此2D 結(jié)構(gòu)，然后導(dǎo)入到Chem3D 19.0中獲得化合物小分子的3D 結(jié)構(gòu)，并保存為Mol2 格式，導(dǎo)入到Pymol 中，對(duì)其進(jìn)行去水、移除靶蛋白中的配體，該配體及處理過(guò)的靶蛋白分別保存為PDB 格式。從RCSBPDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取靶蛋白的3D 結(jié)構(gòu)。采用AutoDockTools1.5.6 對(duì)化合物小分子及靶蛋白結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為pdbqt 格式，并設(shè)置其活性口袋，運(yùn)行vina 1.1.2進(jìn)行分子對(duì)接，采用PyMol 對(duì)結(jié)果可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 藥物靶點(diǎn)的獲取

初步獲得金櫻子化學(xué)成分48 種、芡實(shí)化學(xué)成分26 種，經(jīng)ADME 篩選后共獲得金櫻子6 種活性成分、芡實(shí)1 種活性成分，見(jiàn)表1。金櫻子成分作用靶點(diǎn)158 個(gè)、芡實(shí)成分作用靶點(diǎn)22 個(gè)，合并后刪除重復(fù)靶點(diǎn)共得到166 個(gè)靶點(diǎn)。

表1 水陸二仙丹主要成分

2.2 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖中，共得到176 個(gè)節(jié)點(diǎn)，272 條邊，菱形代表藥物，正三角代表藥物活性成分，橢圓代表藥物靶點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

圖1 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 疾病靶點(diǎn)的獲取

在Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得DN 靶點(diǎn)3319 個(gè)，該靶點(diǎn)Score 中位數(shù)為3.18，故設(shè)定Score≥3.18的靶點(diǎn)為DN的潛在靶點(diǎn)。結(jié)合TTD、OMIM、DRUGBANK 數(shù)據(jù)庫(kù)補(bǔ)充相關(guān)靶點(diǎn)，4 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)靶點(diǎn)結(jié)合刪除重復(fù)值，得到1261 個(gè)靶點(diǎn)。

2.4 維恩圖及PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

“藥物-疾病”靶點(diǎn)維恩圖中，獲得70 個(gè)交集靶點(diǎn)，見(jiàn)圖2。PPI 網(wǎng)絡(luò)共有259 條邊，平均節(jié)點(diǎn)度值為7.4，PPI 富集P<1.0e-16，導(dǎo)出tsv 格式文件及PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖3。PPI 網(wǎng)絡(luò)較為復(fù)雜，通過(guò)Cytoscape 3.7.2 MCODE發(fā)現(xiàn)PPI 網(wǎng)絡(luò)中緊密聯(lián)系的基因團(tuán)模塊有3 個(gè)。見(jiàn)圖4。

圖2 “藥物—疾病”靶點(diǎn)維恩圖

圖3 “藥物-疾病靶點(diǎn)”P(pán)PI 網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 PPI 網(wǎng)絡(luò)中的緊密分子結(jié)構(gòu)

2.5 GO 與KEGG 通路富集分析

通過(guò)Metascape 平臺(tái)對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行通路信號(hào)分析，并通過(guò)生物信息學(xué)平臺(tái)對(duì)結(jié)果可視化。GOBP 選取前20 個(gè)集群、GOCC 選取11 個(gè) 集群、DOMF 選取前16 個(gè)集群，每個(gè)集群選取1 個(gè)代表進(jìn)行分析，GO結(jié)果如圖5 所示。水陸二仙丹治療DN的KEGG 通路圖見(jiàn)圖6（封四）。

圖5 “藥物-疾病”交集靶點(diǎn)GO 分析

圖6 “藥物- 疾病"交集靶點(diǎn)KEGG分析

2.6 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖見(jiàn)圖7，倒三角代表藥物成分，方形代表通路，橢圓形代表靶點(diǎn)，該網(wǎng)絡(luò)有73 個(gè)節(jié)點(diǎn)，412 條邊。從圖中可發(fā)現(xiàn)AGE-RAGE 信號(hào)通路富集最為顯著，槲皮素、葉紅素及山柰酚3 種活性成分與該通路密切相關(guān)，則槲皮素、葉紅素為該通路主要活性成分，與該通路相關(guān)的靶點(diǎn)有23 個(gè)，其中AKT1、MAPK1、VEGFA 和CCND1 是該通路的主要靶點(diǎn)，與DN的發(fā)生機(jī)制緊密相關(guān)。見(jiàn)表2。

表2 成分-通路-靶點(diǎn)

圖7 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 分子對(duì)接結(jié)果

將“2.6”項(xiàng)下主要成分與其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)果所示，槲皮素與葉紅素與其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)具有較好的親和力，槲皮素與MAPK1 對(duì)接結(jié)合能為-8.5 Kcal/mol，穩(wěn)定性最高，見(jiàn)表3，分子對(duì)接模式見(jiàn)圖8。

表3 分子對(duì)接結(jié)合能

圖8 分子對(duì)接模式圖

3 討論

本研究從水陸二仙丹中篩選出7 個(gè)活性成分作用靶點(diǎn)。通過(guò)“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖分析，推測(cè)槲皮素、葉紅素、山柰酚是藥物的主要活性成分。有研究顯示[6-11]，槲皮素能夠通過(guò)降低機(jī)體氧化應(yīng)激水平、增強(qiáng)肝臟丙酮酸激酶活性及抑制胰島細(xì)胞凋亡起到降糖作用，槲皮素的抗炎、抗氧化應(yīng)激及抑制腎臟纖維化對(duì)腎臟起到保護(hù)作用；葉紅素相關(guān)研究較少，但本研究發(fā)現(xiàn)葉紅素與多個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行連接，并且與主要靶點(diǎn)有較好的對(duì)接活性，提示葉紅素具有較好的降糖保腎的作用，值得進(jìn)一步研究；山柰酚可減輕高糖下的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡，抗感染，防治動(dòng)脈硬化。

PPI 網(wǎng)絡(luò)中分離出3 個(gè)模塊，查閱文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)3 個(gè)模塊參加的生物學(xué)過(guò)程進(jìn)行分析[12-16]，第一模塊主要參與白細(xì)胞趨化性、炎癥反應(yīng)等過(guò)程；第二模塊主要參與脂多糖的反應(yīng)、脂質(zhì)的反應(yīng)等過(guò)程；第三模塊主要參與膠原分解、大分子等代謝過(guò)程。GO 生物功能分析發(fā)現(xiàn)，主要涉及脂多糖的反應(yīng)，活化氧代謝過(guò)程，調(diào)控血管生成、細(xì)胞凋亡等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程。對(duì)20 條KEGG 通路分析[17-21]，以AGE-RAGE 通路為主體，可刺激VEGF 增加血管的通透性引起蛋白尿，刺激血管緊張素Ⅱ的產(chǎn)生及在AT1 受體過(guò)度表達(dá)從而加速DN的惡化；大量文獻(xiàn)顯示表明[22-24]，AGE-RAGE 通路下游機(jī)制較為繁雜，作用機(jī)制尚未完全明了，值得進(jìn)一步研討。VEGF 通路可刺激心血管生長(zhǎng)因子亞家族，促進(jìn)腎臟微血管的形成，延緩DN的進(jìn)展，激活內(nèi)分泌抵抗，調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞中的脂肪分解及碳水化合物的消化吸收減輕糖尿病癥狀，學(xué)者們認(rèn)為結(jié)合能小于-5 Kcal/mol 是分子對(duì)接時(shí)受體與配體穩(wěn)定結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合能越低分子對(duì)接結(jié)合穩(wěn)定性越高[25]，分子對(duì)接驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)活性成分與對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)有較好的對(duì)接活性。

水陸二仙丹通過(guò)槲皮素、葉紅素等活性成分，調(diào)控AKT1、MAPK1、VEGFA 等相關(guān)靶點(diǎn)的表達(dá)，進(jìn)而干預(yù)AGE-RAGE、HIF-1、ErbB 多條通路，調(diào)控脂多糖的反應(yīng)、活化氧代謝過(guò)程、血管生成等生物功能發(fā)揮治療DN的作用。