王建華,徐莉,蔣鑫,王曉,張穎,李廣領(lǐng)

（河南科技學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003）

金銀花（Lonicerae Japonicae Flos）是忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或初開的花[1],具有渲散風(fēng)熱、清熱解毒和消炎退腫之功效[2],該中藥材具有悠久的歷史.近年來,隨著金銀花在治療病毒性急性呼吸道疾?。ㄈ鏢ARS、H7N9、COVID-19 等）方面的功效而倍受關(guān)注[3-4].

氯蟲苯甲酰胺（Chlorantraniliprole）是美國杜邦公司于2000 年成功開發(fā)的鄰甲酰氨基苯甲酰胺類殺蟲劑,該殺蟲劑對(duì)危害多種農(nóng)作物的重要鱗翅目害蟲防效優(yōu)異[5].氯蟲苯甲酰胺是昆蟲魚尼丁受體（RYR）的高效激活劑,二者結(jié)合后,將導(dǎo)致RYR 的鈣離子通道異常開放,使貯存在肌肉細(xì)胞內(nèi)的鈣離子大量釋放,引起肌肉調(diào)節(jié)功能衰弱、麻痹,最終導(dǎo)致害蟲癱瘓死亡[6].氯蟲苯甲酰胺純品為白色晶體,熔點(diǎn)為208～210 ℃,分解溫度為330 ℃,蒸氣壓（20 ℃）為6.3×10-12Pa,log Pow（pH 7.0,20 ℃）為2.86,pKa（20 ℃）為10.88,Henry 常數(shù)（20 ℃）為3.2×10-9Pa·m3,在水、丙酮、甲醇、乙腈中的溶解度（20 ℃）分別為1.023、3.446、1.714 和0.711 mg/L[7].

近年來,隨著金銀花在醫(yī)療、保健方面需求的不斷增加,其種植面積逐年擴(kuò)大[8],隨之而來的病蟲害問題開始凸顯,藥農(nóng)不得不施用各種農(nóng)藥,給金銀花產(chǎn)品品質(zhì)帶來了嚴(yán)重的農(nóng)藥殘留安全風(fēng)險(xiǎn).當(dāng)前,氯蟲苯甲酰胺在我國蔬菜、水果和糧食作物上獲準(zhǔn)登記使用,在金銀花種植上尚未獲得應(yīng)用登記,我國、歐盟和美國等均無金銀花中氯蟲苯甲酰胺的殘留限量標(biāo)準(zhǔn).由于氯蟲苯甲酰胺在害蟲防控方面表現(xiàn)出的高效、廣譜和持效性,其在金銀花生產(chǎn)過程中的違規(guī)使用現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生.

目前已報(bào)道的植物源樣品中氯蟲苯甲酰胺殘留分析方法主要包括液相色譜法（樣品基質(zhì)涉及果蔬[9-11]、谷物[12-14]、中藥材[15]和環(huán)境樣品[16-17]等）、液質(zhì)聯(lián)用法（樣品基質(zhì)涉及果蔬[18-20]、谷物[21-22]、植物調(diào)味品[23]和中藥材[24]等）、氣相色譜法[25]、氣質(zhì)聯(lián)用法[26-28]和毛細(xì)管電泳法[29-30]等.盡管基于單離子監(jiān)測(cè)（SIM）或選擇反應(yīng)監(jiān)控（SRM）模式的質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)可以大大簡化樣品前處理程序,但價(jià)格昂貴,而目前報(bào)道的氣相色譜或液相色譜檢測(cè)技術(shù)存在步驟繁瑣、費(fèi)時(shí)、費(fèi)力等缺點(diǎn).

截至目前,尚無金銀花中氯蟲苯甲酰胺殘留分析方面的文獻(xiàn)報(bào)道.本研究擬在已報(bào)道相關(guān)分析方法基礎(chǔ)上,建立金銀花中氯蟲苯甲酰胺殘留的QuEChERS 樣品前處理程序和UPLC-PDA 分析方法,該研究對(duì)于保障以金銀花為原材料的藥材產(chǎn)品品質(zhì)和健全氯蟲苯甲酰胺的殘留安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方面具有重要意義.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥品

氯蟲苯甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 mg/L,溶劑為乙腈）,德國Dr.Ehrenstorfer 公司;HPLC 級(jí)的甲醇和乙腈,美國Mreda 公司;氯化鈉、硫酸鎂和乙酸銨,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;PSA、C18和GCB,天津博納艾杰爾科技有限公司;MWCNTs-COOH 和MWCNTs-OH,北京德科島金科技有限公司;MWCNTs-COOH 和MWCNTs-OH 使用前均在120 ℃下烘干2 h,硫酸鎂使用前130 ℃烘干6 h.試驗(yàn)用水由Millipore 超純水系統(tǒng)制備.

1.2 試驗(yàn)儀器

UPLC-PDA 系統(tǒng),配置真空脫氣機(jī)、瓶式自動(dòng)進(jìn)器、二元泵、四元溶劑分配系統(tǒng)、柱溫箱和PDA 檢測(cè)器；Empower 3 數(shù)據(jù)采集和處理系統(tǒng),美國Waters 公司;VORTEX 3 渦旋混合儀,德國IKA 公司;TDL-5000B型低速冷凍大容量離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠;GTR16-2 型高速冷凍離心機(jī),北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司;JJ500Y 型電子天平,常熟市雙杰測(cè)試儀器廠;FW100 型高速萬能粉碎機(jī),蘇州江東精密儀器有限公司;Milli-Q 超純水系統(tǒng),美國Millipore 公司.

1.3 試驗(yàn)材料

金銀花,河南省封丘縣金銀花種植基地.試驗(yàn)所用金銀花樣品經(jīng)干燥、粉碎后用塑封袋封裝,并于-20 ℃下保存,待測(cè).

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 色譜分析條件 色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18柱（2.1×100 mm,1.7 μm）;柱溫30 ℃;流動(dòng)相乙腈和濃度為5 mmoL/L 乙酸銨水溶液（體積比V∶V=60∶40）,流速為0.4 mL/min;PDA 的檢測(cè)波長范圍200～400 nm,分析波長為254 nm;進(jìn)樣量為2 μL.

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 將氯蟲苯甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液用乙腈提取液稀釋為系列工作溶液,在優(yōu)化的色譜條件下,分別對(duì)所配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行色譜測(cè)定,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)的色譜峰積分面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,求得線性回歸方程和相關(guān)系數(shù);分別以3 倍信噪比（S/N=3）和10 倍信噪比（S/N=10）測(cè)定方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）.

1.4.3 回收率試驗(yàn) 預(yù)先配制0.1、1.0 和2.0 mg/L 質(zhì)量濃度的氯蟲苯甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液,各取1 mL 分別添加至盛裝有2.0 g均質(zhì)化金銀花空白樣品的50 mL離心管中,得到含量為0.05、0.50 和1.00 mg/kg三個(gè)添水平的標(biāo)樣添加樣品,各添加水平均作3 次重復(fù),渦旋混勻后靜置30 min,使添加的農(nóng)藥標(biāo)樣與樣品基質(zhì)充分吸附;加入2 mL 去離子水和10 mL 乙腈,渦旋混勻2 min,再加入2 g 氯化鈉,渦旋混勻1 min,5 000 r/min 離心5 min,小心移取1 mL 上清液至2 mL 聚四氟乙烯具塞離心管（預(yù)先盛裝有25 mg PSA、25 mg C18、50 mg 硫酸鎂和25 mgMWCNTs-OH）,劇烈渦旋1 min,12 000 r/min 離心5 min,上清液通過0.22 μm 針頭過濾器過濾;按照1.4.1 的UPLC-PDA 色譜條件進(jìn)行樣品檢測(cè),根據(jù)1.4.2 中求得的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行外標(biāo)法定量校準(zhǔn),并根據(jù)分析結(jié)果計(jì)算添加回收率及各添加水平3 個(gè)平行樣品測(cè)定值間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）.

1.4.4 實(shí)際樣品檢測(cè) 實(shí)際樣品嚴(yán)格按照與1.4.3 相同的方法制備,然后采用1.4.1 方法進(jìn)行樣品分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分析條件

氯蟲苯甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)樣品、金銀花空白樣品及氯蟲苯甲酰胺空白添加樣品色譜圖如圖2 所示.

在色譜方法優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn),以Acquity UPLC BEH C18柱（2.1×100 mm,1.7 μm）為分離分析柱,柱溫30 ℃,乙腈和濃度5 mmoL/L 乙酸銨水溶液（體積比V∶V=60:40）為流動(dòng)相,流速為0.4 mL/min,檢測(cè)波長254 nm,進(jìn)樣量2 μL,可獲得金銀花樣品中氯蟲苯甲酰胺良好的分離效果.分離結(jié)果如圖1 所示,色譜保留時(shí)間為1.05 min,且峰形良好、金銀花樣品基質(zhì)無干擾.

圖1 氯蟲苯甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)樣品、金銀花空白樣品及氯蟲苯甲酰胺空白添加樣品色譜圖Fig.1 Chromatograms of chlorantraniliprole standard sample,Lonicera japonica blank sample and chlorantraniliprole fortified in Lonicera japonica blank sample

2.2 線性方程及相關(guān)系數(shù)

分析方法的線性方程及相關(guān)系數(shù)如圖2 所示.

圖2 氯蟲苯甲酰胺在金銀花樣品中的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Matrix calibration curveof chlorantraniliprole in Lonicera japonica

由圖2 可知,將溶解于乙腈的質(zhì)量濃度為100 mg/L 氯蟲苯甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液用金銀花空白樣品提取液逐級(jí)稀釋為質(zhì)量濃度分別為0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.50 和5.00 mg/L 的基質(zhì)標(biāo)樣,在最佳色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、以對(duì)應(yīng)的色譜峰積分面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,擬合出線性回歸方程為y=6842.6x+27.745,相關(guān)系數(shù)為R2=0.999.

2.3 準(zhǔn)確度和精密度

通過加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）來確定分析方法的準(zhǔn)確度和精密度.圖1-c 和圖1-d 分別為金銀花空白樣品中氯蟲苯甲酰胺含量為0.5 mg/kg 的標(biāo)樣添加色譜圖和相應(yīng)的紫外吸收光譜檢測(cè)結(jié)果,表1 為金銀花空白樣品中氯蟲苯甲酰胺含量分別在0.05、0.50 和1.00 mg/kg 三個(gè)添加水平時(shí)的回收率試驗(yàn)結(jié)果.由表1 可知,金銀花空白樣品中氯蟲苯甲酰胺的平均回收率均在91%～104%,RSD 均小于6%.通過在金銀花空白樣品提取液中添加少量適當(dāng)質(zhì)量濃度的氯蟲苯甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析,并分別以S/N=3和S/N=10 計(jì)算方法的LOD 和LOQ 為0.017μg/kg 和0.028 mg/kg.

表1 金銀花樣品中不同水平氯蟲苯甲酰胺的添加回收率（n=3）Tab.1 Recoveries of chlorantraniliprole at the different spiked levels in Lonicera japonica（n=3）

2.4 實(shí)際樣品分析

應(yīng)用所開發(fā)殘留樣品前處理程序（1.4.3）和儀器分析方法（1.4.1）分別對(duì)源于8 個(gè)藥材商家的8 份金銀花樣品進(jìn)行氯蟲苯甲酰胺殘留量檢測(cè),結(jié)果顯示,3 份金銀花樣品中含氯蟲苯甲酰胺殘留檢測(cè)量分別為0.060 mg/kg、0.073 mg/kg 和0.130 mg/kg,其余5 份均為未檢出.

3 結(jié)論與討論

本研究在色譜分析方法開發(fā)過程中分別嘗試用甲醇、乙腈及不同pH 的甲醇和乙腈作為流動(dòng)相,試驗(yàn)可知,用體積比為60∶40 的乙腈和濃度為5 mmoL/L 的乙酸銨水溶液作流動(dòng)相時(shí)不但保證氯蟲苯甲酰胺有合適的色譜保留時(shí)間,而且峰形更加尖銳、對(duì)稱性更好.此外,為避免因色譜柱溫度變化造成重現(xiàn)性差,以及因流動(dòng)相黏度高造成色譜柱柱壓偏高、柱效降低,最終設(shè)定色譜柱柱溫為30 ℃.

金銀花樣品中含有黃酮、有機(jī)酸、揮發(fā)油、環(huán)烯醚萜、甾醇和植物色素等[31],基質(zhì)成分相對(duì)復(fù)雜,給金銀花殘留樣品分析帶來難度,本研究引入基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法進(jìn)行定量校準(zhǔn).

傳統(tǒng)的QuEChERS 方法使用PSA 和C18 作為凈化材料,PSA 表面為極性官能團(tuán),主要吸附樣品中較強(qiáng)極性的雜質(zhì),如有機(jī)酸、糖及部分色素等;C18 材料為弱極性吸附劑,對(duì)弱極性物質(zhì)有較強(qiáng)的吸附能力,可去除樣品中脂肪和蠟質(zhì)等弱極性雜質(zhì),并對(duì)樣品中硫化物等雜質(zhì)有較好的去除效果;GCB 主要用于去除樣品提取物中的大部分可見植物色素和固醇類物質(zhì),對(duì)平面型有機(jī)分子有較強(qiáng)的吸附能力[32].CNTs為新型碳納米吸附材料,具有典型的層狀中空結(jié)構(gòu),具有較大的比表面積、較好的熱穩(wěn)定性、機(jī)械穩(wěn)定性及疏水性,CNTs 與樣品基質(zhì)間的疏水作用及π-π 相互作用使其對(duì)樣品基質(zhì)中的色素等極性成分有較好的吸附能力[33].本研究分別比較了25 mg MWCNTs-COOH、MWCNTs-OH 和GCB 對(duì)1 mL 金銀花樣品乙腈提取液中植物色素和目標(biāo)分析物的去除效果和吸附情況,發(fā)現(xiàn)三種吸附材料對(duì)樣品提取液中植物色素的凈化效果無明顯差別,它們對(duì)氯蟲苯甲酰胺的吸附量依次為GCB＞MWCNTs-COOH＞MWCNTs-OH,MWCNTs-COOH 對(duì)氯蟲苯甲酰胺的吸附能力與其易于和氯蟲苯甲酰胺分子中的氨基形成酰胺鍵有關(guān);而GCB 對(duì)氯蟲苯甲酰胺較強(qiáng)的吸附能力應(yīng)歸因于氯蟲苯甲酰胺近乎平面型的分子構(gòu)型[34].

本研究建立的金銀花中氯蟲苯甲酰胺殘留改良版QuEChER 樣品前處理程序,不僅有效降低了影響定量分析結(jié)果的樣品基質(zhì)含量,而且與常規(guī)樣品前處理方法相比大幅度減少了有機(jī)溶劑的消耗量，并且有效提高了分析樣品制備效率.同時(shí)在UPLC-PDA 分析過程中,采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線定量校準(zhǔn)的方法有效降低了樣品基質(zhì)對(duì)殘留檢測(cè)結(jié)果的影響.本研究開發(fā)的殘留分析方法可以作為氯蟲苯甲酰胺在金銀花種植上應(yīng)用登記殘留試驗(yàn)的方法選項(xiàng).