張 健，劉 維

（廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院教學(xué)部 廣東 廣州 510080）

多柔比星，是臨床常用的抗惡性腫瘤的藥物，廣泛用于多種實(shí)體瘤和血液系統(tǒng)腫瘤的治療。該藥物在發(fā)揮抗腫瘤作用的同時(shí)，普遍存在多種毒副作用，因此也限制了其在臨床上的應(yīng)用。肝臟作為人體全身最大的代謝器官，對于人體的穩(wěn)態(tài)、新陳代謝等各個(gè)方面起著關(guān)鍵性的作用，對于藥物引起的肝毒性可能與自由基的形成和活性氧（ROS）的產(chǎn)生有關(guān)。因此，抑制氧化應(yīng)激可能是治療Dox引起肝臟損傷的有效方法[1]。生長激素（GH）由生長激素細(xì)胞分泌，可促進(jìn)細(xì)胞分裂和生長等。有報(bào)道表明，在病理情況下GH可以增加細(xì)胞的抗氧化能力，降低細(xì)胞中ROS的水平，增加細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)而發(fā)揮有效的保護(hù)作用[2]。線粒體是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生能量的場所。在維持細(xì)胞生長和新陳代謝起著十分重要的作用。而自噬是人體內(nèi)重要的生理現(xiàn)象之一，可通過溶酶體降解和去除細(xì)胞內(nèi)有害的蛋白質(zhì)和受損的細(xì)胞器來提供營養(yǎng)，從而恢復(fù)代謝穩(wěn)態(tài)。有研究表明，通過誘導(dǎo)增加線粒體自噬，能夠?qū)寡趸瘧?yīng)激并起到保護(hù)作用[3]。自噬的過程均由一種特殊的細(xì)胞器即自噬體所介導(dǎo)，其可分為非選擇性和選擇性，而自噬的選擇性是由自噬受體所介導(dǎo)的[4]。p62是一種選擇性自噬接頭蛋白，將自噬和Keap1-Nrf2通路相關(guān)聯(lián)，其中LC3相互作用結(jié)構(gòu)域（LC3 interacting region, LIR）作為選擇性自噬受體，穿梭于受損的蛋白質(zhì)、線粒體和細(xì)胞器對其進(jìn)行清除，在細(xì)胞選擇性自噬過程中發(fā)揮重要的作用[5]；而KIR結(jié)構(gòu)域（keap1 interacting region, KIR）參與氧化應(yīng)激，與Keap1在胞質(zhì)內(nèi)形成復(fù)合體，將Keap1固定在細(xì)胞質(zhì)中，增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力[6]。Keap1/Nrf2/NQO1信號通路是目前公認(rèn)的機(jī)體抵抗內(nèi)外環(huán)境氧化和有害刺激的重要防御性轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。Keap1是Nfr2的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，Nrf2的激活可通過與Keap1解耦連或與p62形成復(fù)合體，進(jìn)而啟動下游保護(hù)性基因的表達(dá)，如醌氧化還原酶1（NQO1）等[7]。本文旨在探究GH對Dox誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞損傷中發(fā)揮保護(hù)作用的相關(guān)作用機(jī)制。

1.資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

40只C57BL/6小鼠，SPF級，12周齡，購買于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動物合格證號：SCXK（京）2019-0010，使用許可證編號：SYXK（粵）2017-0124。動物自由進(jìn)食飲水，12 h明暗交替光照，環(huán)境溫度22～25℃，相對濕度50%～55%。本實(shí)驗(yàn)所有操作均符合實(shí)驗(yàn)動物使用及保護(hù)條例，且通過本院倫理委員會審核通過。

1.2 藥品和主要試劑

攜帶小鼠生長激素基因的重組腺相關(guān)病毒-8型（mGH-rAAV8）（廣州派真生物技術(shù)有限公司）；BCA定量試劑盒、RT-PCR引物、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 594標(biāo)記的山羊抗兔或抗大鼠IgG（Thermo Scientific公司）；動物RNA抽提試劑盒、DAPI染液（江蘇碧云天生物技術(shù)公司）；逆轉(zhuǎn)錄、RT-PCR試劑盒（北京全式金生物公司）；兔抗小鼠Tom20、p62、GAPDH，大鼠抗小鼠Keap1、LC3抗體（Abcam公司）；HRP標(biāo)記的山羊抗兔或抗大鼠IgG二抗、ECL發(fā)光液（Proteintech公司）。

1.3 免疫組織熒光法

將4%多聚甲醛固定的肝臟制成石蠟切片。隨后進(jìn)行抗原修復(fù)，用PBS漂洗后置于封閉液中，于室溫下孵育40 min，加入p62、Keap1、Tom20、LC3（1:500）一抗于4℃孵育過夜，次日PBST漂洗3次，在暗室分別加入Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 594標(biāo)記的二抗于室溫下孵育1 h, PBST漂洗3次，最后用DAPI染液進(jìn)行復(fù)染10 min, PBS漂洗后于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real time-PCR）

取上述1.3等量的肝臟，利用動物RNA抽提試劑盒，提取肝組織中的總RNA。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)試劑說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。RTPCR引物序列見表1。以GADPH作為待測GH的內(nèi)參進(jìn)行分析。所有實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.5 Western blot實(shí)驗(yàn)

隨機(jī)選取各組小鼠的肝臟，提取組織中的總蛋白。BCA法進(jìn)行蛋白定量。取50 μg的蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳進(jìn)行蛋白分離，采用濕轉(zhuǎn)法將分離的蛋白轉(zhuǎn)至PDVF膜上，5%的脫脂奶粉于室溫下孵育1 h后，分別加入p62、Keap1、Nrf2、NQO1（1:1000）的一抗，4℃搖床孵育過夜。用TBST溶液清洗，以HRP標(biāo)記的二抗（1:1000）室溫孵育1 h，以TBST溶液清洗。最后均勻滴加ECL發(fā)光液后于凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照[7]。以上實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0和GraphPad Prism 5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）的Dunnett’s或Bonferroni’s多重比較進(jìn)行分析；P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 GH能增加肝細(xì)胞線粒體的自噬對Dox誘導(dǎo)的肝臟損傷發(fā)揮保護(hù)作用

如上所述，通過增加線粒體的自噬，能夠?qū)寡趸瘧?yīng)激并起到保護(hù)作用[3]。我們運(yùn)用免疫組織熒光技術(shù)對各組中肝細(xì)胞中的線粒體自噬情況進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，與正常對照組和模型對照組相比，mGH-rAAV8低、高劑量組能夠增加肝細(xì)胞的線粒體自噬，且高劑量組的效果更為明顯，見圖1。

圖1 肝細(xì)胞線粒體自噬熒光圖

2.2 GH對Dox誘導(dǎo)的肝臟損傷中Keap1/Nrf2/NQO1信號通路的影響

Keap1/Nrf2/NQO1信號通路是機(jī)體抵抗內(nèi)外環(huán)境氧化等的重要防御性轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[7]。我們隨機(jī)選取各組的肝臟組織，對p62、Keap1、Nrf2和NQO1表達(dá)水平進(jìn)行檢測。Real time-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與非藥物治療組相比，藥物治療組中的GH表達(dá)水平顯著增高；與空白對照組和模型對照組相比，藥物治療組中p62、Keap1、Nrf2和NQO1表達(dá)顯著增高，見圖2。

圖2 （A）各組Nrf2、Keap1、p62、NQO-1表達(dá)結(jié)果，（B）各組GH mRNA表達(dá)情況，（C）各組熒光圖

從以上結(jié)果可以得出，生長激素能夠通過上調(diào)p62的表達(dá)從而增加線粒體的自噬，同時(shí)可以上調(diào)Keap1、Nrf2和NQO1表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮對肝臟的保護(hù)作用。

3.討論

Dox是常用的抗腫瘤藥物，因其具有較多的毒副作用，故臨床使用經(jīng)常受到限制[1]。在該實(shí)驗(yàn)中，從模型對照組可見，Dox能引起較為嚴(yán)重的肝臟損傷。我們通過尾靜脈注射包含GH序列的rAAV8，結(jié)果顯示，注射該藥物后能有效改善Dox誘導(dǎo)的肝臟損傷。

線粒體的自噬是生物體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)重要的生理現(xiàn)象[8]。p62能將自噬和Keap1-Nrf2通路相關(guān)聯(lián)[7]。如上所述，Nrf2是體內(nèi)抗氧化調(diào)節(jié)的重要蛋白。鑒于此，我們猜測GH可能是通過增加細(xì)胞p62的表達(dá)進(jìn)而增強(qiáng)線粒體的自噬，并進(jìn)而調(diào)控Keap1/Nrf2/NQO1信號通路，對Dox誘導(dǎo)的肝臟損傷發(fā)揮保護(hù)作用。該研究的免疫組織熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常對照組和模型對照組相比，mGH-rAAV8低、高劑量組能夠增加肝細(xì)胞的線粒體自噬，且高劑量組的效果更為明顯。同時(shí)Real time-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，mGH-rAAV8低、高劑量組p62、Keap1、Nrf2和NQO1表達(dá)顯著增高，且高劑量組的增高更為顯著。

綜上所述，GH保護(hù)Dox誘導(dǎo)的肝臟損傷可能是通過增強(qiáng)細(xì)胞的線粒體自噬并參與調(diào)控Keap1/Nrf2/NQO1信號通路，從而增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力來實(shí)現(xiàn)的。其具體的機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明。