許娟秀， 吳海根

(江西省婦幼保健院腫瘤科，江西 南昌 330006)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)中最嚴(yán)重的惡性腫瘤之一。全球每年超過125 000例死于卵巢癌[1]，而在中國，近年來卵巢癌的發(fā)病率持續(xù)上升[2]。目前的首要臨床問題是提高患者的早期診斷和療效。近年來，手術(shù)聯(lián)合藥物治療可改善患者的預(yù)后，但晚期卵巢癌的5年生存率仍小于30%[3]。因此，迫切需要更好地理解發(fā)病機(jī)理和鑒定分子改變，以開發(fā)有助于卵巢癌診治的有效策略。

藤黃酸(Gambogic acid，GA)已被多次報道可在卵巢癌中扮演抗癌作用[4-5]。但是其抗癌的內(nèi)在分子機(jī)制并不清楚。研究發(fā)現(xiàn)在膀胱癌細(xì)胞中藤黃酸可以促進(jìn)抗癌長鏈非編碼RNA(lncRNA)GAS5水平的表達(dá)[6]。而GAS5又可以通過調(diào)節(jié)miRNA和靶基因參與介導(dǎo)膀胱癌和卵巢癌中的抗癌機(jī)制[6-7]。GAS5和藤黃酸都具有較明顯的抗炎、抗增殖、抗侵襲和遷移的能力[8-9]。因此藤黃酸很可能在卵巢癌中同樣調(diào)節(jié)GAS5的表達(dá)，但在藤黃酸是否通過調(diào)節(jié)GAS5介導(dǎo)卵巢癌進(jìn)展方面缺乏報道。

本研究使用藤黃酸處理卵巢癌細(xì)胞，觀察NF-κB的激活狀態(tài)、細(xì)胞炎癥狀態(tài)、以及增殖和轉(zhuǎn)移標(biāo)記物的變化，并基于lncRNAGAS5研究藤黃酸介導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞功能的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 組織 2016年7月至2018年12月，從江西省婦幼保健院醫(yī)院接受手術(shù)的患者中獲得12例卵巢癌組織和相鄰正常組織。根據(jù)組織病理學(xué)診斷為卵巢癌(Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ期)根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(FIGO)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評估。手術(shù)前未對這些患者進(jìn)行局部或全身治療。收集組織并立即在液氮中冷凍，儲存在-80 ℃。本研究經(jīng)江西省婦幼保健院研究倫理委員會批準(zhǔn)，每個參與者都獲得知情同意。

1.2 細(xì)胞系 人卵巢表面上皮細(xì)胞(HNOECs)和卵巢癌細(xì)胞系SW626分別購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)和中國科學(xué)院細(xì)胞庫，根據(jù)供應(yīng)商的說明培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞。在含有10%胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基中(美國Gibco公司)常規(guī)培養(yǎng)，所有培養(yǎng)基均含1%青-鏈霉素(100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)，將所有細(xì)胞培養(yǎng)于補(bǔ)充有5%CO2、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.3 藥物 藤黃酸購于上海阿拉丁生化科技有限公司(G101480)，處理SW626細(xì)胞，濃度為每孔100 μg/2×104cells，分為對照組和藤黃酸組，分別處理6、12、24 h。

1.4 實(shí)時熒光定量PCR(RT-qPCR)分析 使用TRIzol試劑(美國英杰生命科技有限公司)從組織樣品或培養(yǎng)的細(xì)胞中提取總RNA。使用Reverse Transcription試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]將2 μg總RNA用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和cDNA合成。使用SYBR-Green Real-Time Master Mix(日本TaKaRa公司)進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR分析。將結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化為組成型表達(dá)基因GAPDH。GAS5引物正向5′-CTTCTGGGCTCAAGTGATCCT-3′，反向5′-TTGTGCCATG AGACTCCATCAG-3′；MMP-2引物正向5′-TGGCAGTGCAA TACCTGAAC-3′，反向5′-CCGTACTTGCCATCCTTCTC-3′；MMP-9引物正向5′-AGTTTGGTGTCGCGGAGCAC-3′，反向5′-TACATGAGCGCTTCCGGCAC-3′’；GAPDH引物正向5′-ACACCCACTCCTCCACCTTT-3′，反向5′-TTACTCCTTGGAG GCCATGT-3′；U6引物5′-GCTCTAGATTTGATCCGACGCC GCCATCTC-3′。在Applied Biosystems 7500序列檢測系統(tǒng)(美國ABI公司)上進(jìn)行RT-qPCR和數(shù)據(jù)收集。計算GAS5的相對表達(dá)并使用2-ΔΔCt方法相對于GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化。

1.5 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗 根據(jù)制造商的說明書，用Cell Counting Kit-8(CCK-8)(日本同仁化學(xué)研究所)進(jìn)行細(xì)胞增殖測定。將每孔2×104個細(xì)胞接種在96孔板中。接種后24 h內(nèi)的三個間隔用CCK-8評估細(xì)胞活力。CCK-8在37 ℃處理1 h后，使用酶標(biāo)儀測450 nm處的吸光度。

1.6 MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗 采用MTT法檢測藤黃酸對正常卵巢細(xì)胞系IOSE386(中國典型培養(yǎng)物保藏中心)的細(xì)胞毒性。IOSE386細(xì)胞用10% FBS和1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5% CO2、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱。取對數(shù)生長期的細(xì)胞以每孔7×103個密度接種于96孔板，過夜培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁。然后棄去培養(yǎng)液，加入用培養(yǎng)液稀釋的不同質(zhì)量濃度藤黃酸，每個質(zhì)量濃度設(shè)置6個平行，空白對照只加入培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后吸去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL質(zhì)量濃度為500 μg/mL的MTT溶液。培養(yǎng)4 h，吸去MTT，PBS清洗，加入100 μL DMSO，用酶標(biāo)儀測量580 nm處的OD值，計算細(xì)胞的存活率。細(xì)胞存活率=[OD(加藥孔)/OD(空白孔)]×100%。

1.7 蛋白質(zhì)提取和蛋白免疫印跡檢測 用SDS裂解緩沖液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)在冰上將培養(yǎng)的細(xì)胞中提取總蛋白質(zhì)20 min，并使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒(美國Pierce公司)測定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。為檢測p-p65的表達(dá)，使用核蛋白和胞漿蛋白抽提試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)提供的具體步驟對核蛋白進(jìn)行抽提，并存儲在-70 ℃以進(jìn)行下一步實(shí)驗。通過10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離等量的總蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移至0.22 μm聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美國Millipore Corp公司)并與特異性第一抗體(美國Abcam公司)一起室溫孵育8 h。PBS洗掉一抗，經(jīng)過熒光二抗(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)孵育2 h后，通過增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測蛋白質(zhì)，并通過光密度測定法(Quantity One軟件；美國Bio-Rad公司)定量條帶的強(qiáng)度。 GAPDH抗體(1∶2 000)用作總蛋白的內(nèi)參蛋白，Lamin A作為核蛋白的內(nèi)參蛋白。測定MMP-2(1∶1 500)、MMP-9(1∶1 000)、VEGF(1∶800)，側(cè)支發(fā)芽因子同源物2(Sprouty homolog2，SPRY2)(1∶900)，p-p65(1∶800)蛋白表達(dá)。

對供試種子樣品進(jìn)行處理，種子發(fā)芽勢統(tǒng)計分析結(jié)果見表3。結(jié)果表明，不同處理上杭錐種子發(fā)芽勢為7.61%～85.20%，處理6發(fā)芽勢最高為85.20%。從R值可以得出，不同因素對上杭錐種子發(fā)芽勢影響的主次順序為B>A>C>D，依次為浸種溫度、粒級分類、GA3濃度、萌發(fā)溫度處理。根據(jù)各因素水平的平均值(ki)的大小比較可得最優(yōu)水平組合為A1B2C1D2，即大粒種子在30℃溫度下浸種后瀝干，加入50mg·l-1GA3溶液浸種24h，放在萌發(fā)溫度20℃的人工氣候箱內(nèi)萌發(fā)，種子發(fā)芽勢最高。進(jìn)一步經(jīng)方差分析，浸種時間對上杭錐種子發(fā)芽勢的影響是極顯著 (P=0.0096< 0.01)。

1.8 質(zhì)粒構(gòu)建細(xì)胞轉(zhuǎn)染 構(gòu)建GAS5的siRNA，合成人GAS5完整序列(2 651 bp)并亞克隆到siRNA載體中。另外，通過DNA測序確認(rèn)質(zhì)粒[生工生物工程(上海)股份有限公司]。將卵巢癌細(xì)胞接種于24孔板(每孔1×105個細(xì)胞)中并孵育24 h，然后使用Lipofectamine 2000(美國英杰生命科技有限公司)轉(zhuǎn)染si-GAS5(每孔2 μg/2×104cells)或陰性對照(si-NC，每孔2 μg/2×104cells)到細(xì)胞內(nèi)。按照制造商的說明書在無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行孵育。

1.9 酶聯(lián)免疫吸附檢測 將各組細(xì)胞離心，取上清液，使用IL-6和IL-1β 酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒(上海江林生物科技有限公司)，嚴(yán)格按照制造商的說明進(jìn)行檢測，用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中人白介素的質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果

2.1 藤黃酸促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞SW626中的GAS5的表達(dá) 使用RT-qPCR檢查12例配對的人卵巢癌組織和相匹配的癌旁正常組織中GAS5的表達(dá)。如圖1A所示，與相應(yīng)的相鄰組織學(xué)正常組織比較，卵巢癌組織中GAS5的表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。其次，檢測卵巢癌細(xì)胞系SW626和正常卵巢細(xì)胞中GAS5的表達(dá)差異，與正常卵巢細(xì)胞比較，SW626中GAS5的表達(dá)同樣下調(diào)(圖1B，P<0.05)。另外，在藤黃酸(6、12、24 h)刺激下，GAS5的表達(dá)呈時間依賴性升高(圖1C，P<0.05)。

注：A為卵巢癌組織和相應(yīng)癌旁正常組織(n=12)中GAS5的表達(dá)，與癌旁正常組織比較，*P<0.05；B為卵巢癌細(xì)胞中GAS5表達(dá)，與人卵巢表面上皮細(xì)胞比較，*P<0.05；C為藤黃酸(每孔100 μg/2×104 cells)對卵巢癌細(xì)胞中GAS5表達(dá)的影響，與對照組比較，*P<0.05；與藤黃酸-6 h比較，#P<0.05；與藤黃酸-12 h比較，&P<0.05。圖1 藤黃酸對卵巢癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA GAS5表達(dá)的影響

2.2 藤黃酸抑制卵巢癌細(xì)胞SW626的增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)指標(biāo) 采用CCK-8實(shí)驗檢測藤黃酸對卵巢癌細(xì)胞增殖能力的影響，分析與對照組比較，藤黃酸處理后細(xì)胞在6、12、24 h增殖率均下調(diào)(圖2A，P<0.05)；藤黃酸分別在每孔10、50、100、200、300、400、500、600 μg/2×104cells濃度下處理正常卵巢細(xì)胞IOSE386，增殖率均未降低(圖2B，P>0.05)；藤黃酸處理24 h后，MMP-2、MMP-9的mRNA和蛋白表達(dá)均下調(diào)(圖2C～2F，P<0.05)。

注：A為CCK-8用于檢測藤黃酸(每孔100 μg/2×104 cells)處理不同時間卵巢癌細(xì)胞的成活率，B為MTT法檢測藤黃酸(每孔10～600 μg/2×104 cells)處理卵巢細(xì)胞IOSE386的成活率，RT-qPCR檢測卵巢癌細(xì)胞中MMP-2(C)、MMP-9(E)mRNA表達(dá)，Western blot檢測卵巢癌細(xì)胞中MMP-2(D)、MMP-9(F)蛋白表達(dá)。與對照組比較，*P<0.05。圖2 藤黃酸對卵巢癌細(xì)胞成活率和MMP-2及MMP-9表達(dá)的影響(n=3)

2.3 藤黃酸抑制卵巢癌細(xì)胞SW626的炎癥水平 藤黃酸刺激24 h后，與對照組比較，p-p65核表達(dá)降低(圖3A，P<0.05)，炎癥因子水平IL-6、IL-1β降低(圖3B～3C，P<0.05)。

注：A為Western blot檢測卵巢癌細(xì)胞核中p-p65表達(dá)，ELISA檢測卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中IL-6(B)、IL-1β(C)水平。與對照組比較，*P<0.05。圖3 藤黃酸對卵巢癌細(xì)胞中炎癥反應(yīng)的影響(n=3)

2.4 沉默GAS5恢復(fù)卵巢癌細(xì)胞的增殖，轉(zhuǎn)移相關(guān)指標(biāo)和炎癥因子的表達(dá)siGAS5轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞并聯(lián)合藤黃酸處理，使用CCK-8檢測GAS5沉默對卵巢癌細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果顯示，與單獨(dú)藤黃酸處理24 h組比較，siGAS5+藤黃酸處理后細(xì)胞在24 h增殖率上調(diào)(圖4A，P<0.05)，MMP-2、MMP-9、VEGF的蛋白表達(dá)增加(圖4B～4D，P<0.05)。與單獨(dú)藤黃酸處理24 h組比較，藤黃酸+siGAS5組p-p65核表達(dá)部分升高，IL-6、IL-1β水平部分上調(diào)(圖4E～4G，P<0.05)。

注：A為CCK-8檢測卵巢癌細(xì)胞的成活率，Western blot檢測卵巢癌細(xì)胞中MMP-2(B)、MMP-9(C)、VEGF(D)蛋白及細(xì)胞核中p-p65蛋白(E)表達(dá)，ELISA檢測卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中IL-6(F)、IL-1β(G)水平。與對照組比較，*P<0.05；與藤黃酸組比較，#P<0.05；與藤黃酸+si-GAS5比較，&P<0.05。圖4 沉默GAS5恢復(fù)卵巢癌細(xì)胞成活率(n=3)

2.5GAS5敲低減弱藤黃酸對miR-21和SPRY2的調(diào)控作用 miR-21在SW626細(xì)胞中表達(dá)升高，SPRY2表達(dá)則降低(P<0.05)。在藤黃酸處理24 h后細(xì)胞中miR-21表達(dá)降低，SPRY2表達(dá)升高(P<0.05)。在藤黃酸+si-GAS5轉(zhuǎn)染處理24 h細(xì)胞中miR-21表達(dá)升高，SPRY2表達(dá)降低(P<0.05)。見圖5。

注：A、C為RT-qPCR法檢測卵巢癌細(xì)胞中miR-21表達(dá)，B、D為Western blot檢測SPRY2的蛋白表達(dá)。與對照組比較，*P<0.05；與藤黃酸組比較，#P<0.05；與藤黃酸+si-GAS5比較，&P<0.05。圖5 GAS5敲低減弱藤黃酸對miR-21和SPRY2的調(diào)控作用(n=3)

3 討論

研究表明，中藥單體化合物可能在治療癌癥中起重要作用[10]。藤黃酸是一種多靶標(biāo)的化合物，具有抗腫瘤活性[5，11]。研究表明藤黃酸可在體內(nèi)外抑制卵巢癌腫瘤的生長[5]。本研究確定了藤黃酸對卵巢癌細(xì)胞炎癥、細(xì)胞增殖、以及轉(zhuǎn)移標(biāo)志物表達(dá)水平的影響，進(jìn)一步明確lncRNA GAS5的異常表達(dá)以及其介導(dǎo)的miR-21/SPRY2軸可能是藤黃酸調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞功能的關(guān)鍵下游機(jī)制之一。

多項證據(jù)表明，藤黃酸不僅抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，且不良反應(yīng)較少[12-13]。本研究以每孔100 μg/2×104cells的藤黃酸分別處理卵巢癌細(xì)胞6、12、24 h后，卵巢癌細(xì)胞的增殖能力以時間依賴性下調(diào)。另外，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移標(biāo)志物MMP-2、MMP-9和VEGF蛋白表達(dá)均被藤黃酸所抑制。由此提示，藤黃酸可以作為潛在的抗卵巢癌新藥物。

近年來研究表明，lncRNA在細(xì)胞的基本生物學(xué)過程中起重要作用，如影響表觀遺傳信息、促進(jìn)細(xì)胞生長[14-15]。

在多種腫瘤惡性進(jìn)展過程中頻繁出現(xiàn)lncRNA表達(dá)失調(diào)現(xiàn)象，可能對腫瘤的發(fā)展起關(guān)鍵作用[16]。lncRNA GAS5全稱為生長停滯特異性5，被發(fā)現(xiàn)可作為潛在的腫瘤抑制基因，其在生長停滯的細(xì)胞中高表達(dá)[17-18]，在乳腺癌和前列腺癌等癌癥中異常表達(dá)[19-20]，對不同類型的癌細(xì)胞生長具有抑制作用，其中包括卵巢癌細(xì)胞[6-7]。本研究證明GAS5在卵巢癌中被下調(diào)，而且藤黃酸可以恢復(fù)GAS5在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)。為進(jìn)一步驗證藤黃酸是通過上調(diào)GAS5參與抑制卵巢癌細(xì)胞的惡性特征，本研究在藤黃酸處理卵巢癌細(xì)胞的基礎(chǔ)上同時改變GAS5的表達(dá)，結(jié)果表明沉默GAS5的表達(dá)可以在較大程度上逆轉(zhuǎn)藤黃酸對卵巢癌細(xì)胞表型的影響，包括部分恢復(fù)細(xì)胞生長，恢復(fù)細(xì)胞轉(zhuǎn)移標(biāo)記物MMP-2、MMP-9和VEGF。抑制GAS5的水平可提高卵巢癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力和增殖能力[8]，本研究結(jié)果表明，藤黃酸通過調(diào)節(jié)lncRNA GAS5參與抑制卵巢癌細(xì)胞的惡性特征。

NF-κB可被不同的內(nèi)源性或外源性因子激活從而刺激細(xì)胞，促進(jìn)一系列促炎和抗凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。研究表明，NF-κB信號通路在各種腫瘤的發(fā)展中起著重要作用，在晚期可以促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展[21]。在本研究中，藤黃酸能抑制細(xì)胞核中磷酸化p65的表達(dá)以及促炎癥因子IL-6和IL-1β的水平，說明NF-κB信號通路的失活可能是藤黃酸對于卵巢癌的抑制作用的關(guān)鍵機(jī)制之一。沉默GAS5的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)藤黃酸對卵巢癌細(xì)胞磷酸化p65表達(dá)及促炎癥因子IL-6和IL-1β水平的抑制作用，表明藤黃酸可通過調(diào)節(jié)lncRNA GAS5介導(dǎo)抑制卵巢癌細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

GAS5在卵巢癌中已被證實(shí)可以抑制miR-21并促進(jìn)SPRY2基因表達(dá)，從而在卵巢癌細(xì)胞中扮演內(nèi)源競爭性RNA的角色調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖[7]?；诒狙芯克玫降奶冱S酸可正向調(diào)節(jié)GAS5的結(jié)論，進(jìn)一步驗證藤黃酸對卵巢癌細(xì)胞中miR-21和靶基因SPRY2水平的影響，最終確定藤黃酸不僅上調(diào)GAS5水平，且抑制miR-21/SPRY2表達(dá)水平的比值。表明藤黃酸可能直接調(diào)控了GAS5/miR-21/SPRY2軸的表達(dá)水平。

綜上所述，藤黃酸可阻止卵巢癌細(xì)胞過度增殖、細(xì)胞轉(zhuǎn)移和細(xì)胞炎癥的激活，上調(diào)lncRNA GAS5是藤黃酸發(fā)揮體外抑制卵巢癌增殖、轉(zhuǎn)移、炎癥功能的關(guān)鍵機(jī)制之一，為卵巢癌的藥物治療提供了新的理論基礎(chǔ)、潛在的檢測和治療靶點(diǎn)。