景夢曉， 呂邵娃， 付婷婷， 劉紫衡， 李永吉

(黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

白虎湯出自《傷寒論》，由石膏、知母、甘草、粳米4味藥材組成，功效清熱瀉火、除煩生津，是治療陽明熱證的經(jīng)典方劑，在解熱、抑菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、增強免疫、抗痛風、降血糖、降脂、減輕腫瘤治療不良反應、抑制皮脂腺增生等方面均有作用[1-3]。目前，對白虎湯含量測定的研究主要集中在不同配伍條件對某些成分的影響[4-9]，但只測定某一成分的含量；另外有采用HPLC法測定方中4種成分的含量[10]，但該方法檢測時間較長，分離度低。因此，本實驗建立UPLC法同時測定白虎湯中芒果苷、新芒果苷、甘草苷、甘草酸銨的含量，而且該方法取樣量少，簡單快速，靈敏度和分離度高，可為有效控制該方質(zhì)量提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 炙甘草(批號170201)、石膏(批號SAO251)(安徽廣印堂中藥股份有限公司)；知母(批號20160512，北京本草方源藥業(yè)有限公司)；粳米為市售。芒果苷(DST180513-010)、新芒果苷(DST180630-017)、甘草酸銨(DST180422-012)、甘草苷(DST180321-014)對照品均購自成都德思特生物技術有限公司，純度均>98%。乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純；水為屈臣氏飲用水。

1.2 儀器 ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀(美國Waters公司)；電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；SB-5200D超聲波清洗機(寧波新芝生物科技有限公司)；ATGL-16C-高速離心機(上海安亭科學儀器廠)；煎煮鍋(潮州市順創(chuàng)陶瓷有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液制備 精密稱取芒果苷、新芒果苷、甘草苷、甘草酸銨對照品適量，置于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，即得(質(zhì)量濃度分別為0.32、0.32、0.1、0.4 mg/mL)。

2.2 供試品溶液制備 取知母6兩(93.75 g)、甘草2兩(31.25 g)、粳米6合(120 mL)，置于1斗(1 981 mL)水中浸泡30 min，加入生石膏(碎)1斤(250 g)后一起轉(zhuǎn)入砂鍋中，武火煮沸后轉(zhuǎn)至文火煎煮40 min，4層紗布趁熱過濾得到湯液約850 mL。取1 mL，50%甲醇溶解并定容于10 mL量瓶中，超聲處理30 min，4 000 r/min離心15 min，取上清液約2 mL，0.22 μm微孔濾膜過濾，取濾液，即得。

2.3 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動相乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脫(0～1 min，5%～10%B；1～3 min，10%～14%B；3～5 min，14%～18%B；5～6 min，18%B；6～9 min，18%～19%B；9～12 min，19%～55%B；12～15 min，55%～62%B)；體積流量0.3 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長256 nm。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性考察 精密移取對照品、供試品溶液各1 μL，在“2.3”項色譜條件下進樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，各成分峰形完整，分離度高，表明該方法專屬性良好。

1.新芒果苷 2.芒果苷 3.甘草苷 4.甘草酸銨1.mangiferin 2.neomangiferin 3.liquiritin 4.ammoniumglycyrrhizinate圖1 各成分UPLC色譜圖Fig.1 UPLC chromatograms of various constituents

2.4.2 線性關系考察 取芒果苷對照品溶液，甲醇稀釋至40、60、80、160、320、640 μg/mL；取新芒果苷對照品溶液，甲醇稀釋至60、80、160、320、640、1 280 μg/mL；取甘草苷對照品溶液，甲醇稀釋至10、25、50、100、150、200 μg/mL；取甘草酸銨對照品溶液，甲醇稀釋至40、65、80、100、200、400 μg/mL。以質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關系良好。

表1 各成分線性關系

2.4.3 精密度試驗 取上述4種供試品溶液，在“2.3”項色譜條件下進樣測定6次，測得芒果苷、新芒果苷、甘草苷、甘草酸銨峰面積RSD分別為2.91%、2.42%、3.00%、1.37%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，于配制后0、2、4、6、8、10 h在“2.3”項色譜條件下進樣測定，測得芒果苷、新芒果苷、甘草苷、甘草酸銨峰面積RSD分別為1.82%、1.32%、1.16%、1.19%，表明溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復性試驗 取同一批飲片，按“2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.3”項色譜條件下進樣測定，測得芒果苷、新芒果苷、甘草苷、甘草酸銨峰面積RSD分別為2.89%、1.89%、2.72%、1.74%，表明該方法重復性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗 取湯劑6份，每份0.5 mL，加入0.5 mL對照品溶液，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結(jié)果見表2。

表2 各成分加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)

2.5 樣品含量測定 取飲片6份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”項色譜條件下進樣測定，計算含量，結(jié)果見表3。

表3 各成分含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 檢測波長篩選 本實驗采用紫外分光光度計，在200～400 nm波長范圍內(nèi)進行掃描，發(fā)現(xiàn)對照品、供試品溶液均在256 nm處有最大吸收峰，故選擇其作為檢測波長。

3.2 檢測指標篩選 白虎湯中粳米含有大分子多糖類物質(zhì)，在PDA檢測器無法被檢出[11]；石膏作為礦物藥，其主要成分為含水硫酸鈣，在該檢測器也無法被檢出[12]。因此，本實驗選擇知母、甘草所含主要成分作為檢測指標。

3.3 色譜條件篩選 本實驗考察了HPLC、UPLC法，并通過查閱相關文獻對出峰時間、分離度、檢測靈敏度進行分析，最終選擇UPLC法，相比于HPLC法可大大縮短分析時間，提高效率，減少溶劑消耗[13-15]。

此外，前期已有報道采用UPLC法測定白虎湯中指標成分含量，但采用等度洗脫，而且僅限于1種成分，無法全面反映該方質(zhì)量，故本實驗采用梯度洗脫，不僅縮短了分析時間，還使得4種成分色譜峰均達到了較好的分離度。此外，在分離色譜峰時為了得到分離度好、峰形完整的色譜峰，本實驗在流動相中加入了適量甲酸，既抑制了白虎湯中水溶性酸性成分的分解，又得到了理想的色譜峰峰形。

4 結(jié)論

本實驗建立了UPLC法同時測定白虎湯中芒果苷、新芒果苷、甘草苷、草酸銨的含量，發(fā)現(xiàn)該方法較HPLC法更簡便、快速、準確，重復性更好，可為該方后期進一步研發(fā)奠定基礎。