周澤華， 紀(jì)萬里， 安 叡， 梁 琨， 王新宏

(上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海 201203)

慢性胃炎是一種常見的、多發(fā)性的消化系統(tǒng)疾病，病變分布不均勻。主要由炎性細(xì)胞(淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞為主)浸潤所導(dǎo)致的胃黏膜慢性炎癥或萎縮性病變，也可同時存在中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤。該病的發(fā)病率逐年上升，且有隨著年齡的增長而升高的趨勢[1]。目前西醫(yī)治療以對癥處理為主，暫無特效藥物，而中藥治療顯示出明顯優(yōu)勢，中醫(yī)強(qiáng)調(diào)辨證論治，從整體觀念出發(fā)調(diào)整機(jī)體狀態(tài)[2]。中醫(yī)學(xué)并無“慢性胃炎”病名，根據(jù)本病的主要臨床表現(xiàn)將其劃分為“胃脘痛”“痞滿”“嘈雜”等范疇。本病以脾虛為本，痰濁、瘀血、濕熱為標(biāo)，為本虛標(biāo)實之證。疾病日久即可因虛致實，又可因?qū)嵵绿?，?dǎo)致虛實夾雜，同時多種致病因素又可郁久化熱，表現(xiàn)出寒熱錯雜的臨床癥狀[3]。半夏瀉心湯出自張仲景的《傷寒論》，是治療寒熱錯雜之心下痞的代表方劑之一，具有和中降逆，開痞散結(jié)之功，臨床上主要治療急慢性胃炎。

Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of Caja，ICC)作為胃腸道慢波的起搏細(xì)胞，是基本電節(jié)律的主要傳播者，參與了慢波的傳導(dǎo)，同時也是胃腸神經(jīng)與平滑肌細(xì)胞聯(lián)系的重要通道，參與了胃腸神經(jīng)信息傳遞過程，在胃腸動力的調(diào)控中起著十分重要的作用，與胃腸動力性疾病的發(fā)病密切相關(guān)。ICC的功能結(jié)構(gòu)異常改變、發(fā)育分化障礙、凋亡或自噬引起胃腸道起搏電位、慢波節(jié)律和興奮傳導(dǎo)的異常，是多種胃腸道疾病發(fā)生的關(guān)鍵機(jī)制[4]。既往研究表明[5]慢性胃炎與胃腸功能的障礙有一定關(guān)聯(lián)，文獻(xiàn)[6]報道，半夏瀉心湯具有調(diào)節(jié)胃腸道作用，但從半夏瀉心湯的配伍角度來研究作用機(jī)制的文獻(xiàn)較少。中藥配伍理論是中醫(yī)藥理論的精華之一，開展方劑配伍規(guī)律的現(xiàn)代研究有利于闡釋中藥復(fù)方對疾病的多靶點治療作用，同時也有助于臨床療效的提高及應(yīng)用的推廣。因此，本實驗研究半夏瀉心湯及各配伍組對胃腸道運動相關(guān)受體的影響，同時，通過觀察半夏瀉心湯及各配伍組含藥血清對ICC細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響，探究半夏瀉心湯調(diào)節(jié)慢性胃炎胃腸道功能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級SD大鼠，雄性，體質(zhì)量160～180 g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2014-0008，飼養(yǎng)環(huán)境溫度(22±0.5)℃，相對濕度(50±5)%，12 h/12 h光照/黑暗交替。實驗前，所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，自由進(jìn)食飲水。

1.2 試劑與藥物 半夏瀉心湯組方藥材黃連、黃芩、人參、甘草、半夏、干姜、大棗均購自上?？禈蛑兴庯嬈邢薰荆?jīng)上海虹橋中藥飲片有限公司陳燕軍藥師鑒定為正品，符合2020年版《中國藥典》規(guī)定。伊托必利(迪沙藥業(yè)集團(tuán)有限公司)；兔抗5-羥色胺4受體(5-HT4)、兔抗多巴胺D2受體(DA2)、兔抗乙酰膽堿酯酶(AchE)多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；小鼠抗c-kit多克隆抗體(上海圣克魯斯生物技術(shù)有限公司)；羊抗兔HRP標(biāo)記二抗、羊抗鼠HRP標(biāo)記二抗、Fluo-4-AM、Western blot Kit高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；兔抗GAPDH多克隆抗體(美國CST公司)；M199培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)(美國Gibco公司)；干細(xì)胞因子(SCF)、Ⅱ型膠原酶(美國Sigma公司)；青鏈霉素混合液(100X)、D-hanks(美國Solarbio公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(加拿大Fermentas公司)；SYBR Green PCR試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(美國Thermo公司)。

1.3 儀器 TDZ4-WS離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；BHC-1300IIB2生物安全柜(蘇州金凈凈化設(shè)備公司)；Thermo Forma 3111CO2恒溫培養(yǎng)箱[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]；T100 PCR儀(美國Bio-Rad公司)；7500實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；DYCZ-24DN電泳儀(北京六一儀器廠)；Eclipse Ni熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；SP8 激光掃描共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)。

1.4 方法

1.4.1 藥液制備 按全方半夏、干姜、黃芩、黃連、人參、大棗、炙甘草12∶9∶9∶3∶9∶6∶9比例，加入10倍量水煎煮45 min，共2次，濾過，合并濾液，濃縮至生藥量1.0 g/mL。按比例稱取各配伍組飲片，包括辛開組(半夏、干姜)，苦降組(黃芩、黃連)，甘補(bǔ)組(人參、炙甘草、大棗)，同法煎煮。

1.4.2 動物分組 70只大鼠遵循隨機(jī)分配原則分為正常組、模型組、全方組、苦降組、辛開組、甘補(bǔ)組、陽性藥(伊托必利)組，每組10只。

1.4.3 造模及給藥 空白組大鼠灌胃給予生理鹽水，其余各組大鼠建立寒熱錯雜型慢性胃炎大鼠模型。采用苦寒瀉下法[7]，大承氣湯按10 g/kg劑量灌胃，隔天1次，連續(xù)10 d，第11天開始灌胃給予含4%辣椒的56%乙醇混懸液，劑量8 mL/kg，每3 d 1次，連續(xù)9 d，復(fù)制熱證模型[8]。造模成功后大鼠灌胃給藥(依照人單位體質(zhì)量生藥量來求得大鼠單位體質(zhì)量生藥量, 并擴(kuò)大3倍)，分別為全方組15 g/kg、苦降組3 g/kg、辛開組5.5 g/kg、甘補(bǔ)組6.5 g/kg、陽性藥組40 mg/kg，而正常組、模型組大鼠每天灌胃給予等劑量生理鹽水，均連續(xù)7 d。

1.4.4 標(biāo)本采集及處理 大鼠按0.4 mL/100 g劑量腹腔注射20%烏拉坦溶液麻醉，分離胃部并沿胃長緣剪開，生理鹽水洗去胃內(nèi)容物，濾紙吸干，4%多聚甲醛固定，使組織細(xì)胞中的蛋白變性并固化，進(jìn)行病理學(xué)檢查。另取胃組織，RT-qPCR法檢測5-HT4、AchE、DA2、c-kitmRNA表達(dá)，Western blot法檢測蛋白表達(dá)。

1.4.5 HE染色 將在4%多聚甲醛中固定過夜的大鼠胃組織放到包埋盒中，自來水沖洗6 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，切片(約4 μm厚)，脫蠟至水，進(jìn)行HE染色，在光鏡下觀察其形態(tài)學(xué)。

1.4.6 RT-qPCR法檢測5-HT4、AchE、DA2、c-kitmRNA表達(dá) 取凍存的各組大鼠部分胃組織，按照說明書提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用實時熒光定量PCR儀對5-HT4、AchE、DA2、c-kit進(jìn)行相對定量分析，目標(biāo)基因通過2-△△CT公式計算，引物序列由上海基爾頓生物科技有限公司設(shè)計，見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.4.7 Western blot檢測5-HT4、AchE、DA2、c-kit蛋白表達(dá) 取凍存的各組大鼠胃組織，稱定質(zhì)量，置于2 mL離心管中，按1∶10比例加入RIPA裂解液，機(jī)械勻漿1 min，10 000×g離心5 min，取上清，BCA法定量，SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜，5%BSA室溫下封閉1 h，加入5-HT4(1∶500)、AchE(1∶500)、DA2(1∶300)、c-kit(1∶500)，4 ℃過夜，TBST洗膜，加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶1 000)，室溫下孵育1 h，TBST洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測，凝膠成像系統(tǒng)拍照，以GAPDH為內(nèi)標(biāo)，檢測5-HT4、AchE、DA2、c-kit蛋白的相對表達(dá)量。

1.4.8 免疫熒光法檢測5-HT4、AchE、DA2、c-kit蛋白共表達(dá) 將各組大鼠胃組織切片在二甲苯中浸泡，脫蠟后切片，浸入梯度乙醇中脫二甲苯，0.01 mol/L PBS緩沖液沖洗，正常山羊血清封閉，37 ℃下放置30 min，滴加兔抗大鼠5-HT4(1∶500)、AchE(1∶500)、DA2(1∶300)抗體、小鼠抗大鼠c-kit抗體(1∶500)，置于濕盒中，4 ℃下過夜，取出切片，37 ℃下復(fù)溫60 min，0.01 mol/L PBS緩沖液沖洗，免疫熒光雙標(biāo)記滴加羊抗兔HRP標(biāo)記二抗、羊抗鼠HRP標(biāo)記二抗(1∶1 000)，37 ℃下放置40 min，0.01 mol/L PBS緩沖液沖洗，100 g/L緩沖甘油封固，在熒光顯微鏡下觀察拍照，并記錄熒光強(qiáng)度值。

1.4.9 ICC細(xì)胞分離與培養(yǎng) 大鼠禁食18 h后腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉，無菌條件下取胃竇組織，4 ℃預(yù)冷的D-hanks液反復(fù)沖洗胃內(nèi)容物，胃竇組織剪成1 cm3左右小塊，將呈糜狀者移入離心管中，加3 mL 4%Ⅱ型膠原酶充分吹勻，37 ℃下消化30 min，1 000 r/min離心3 min，棄去上清，加入D-hanks液反復(fù)吹打10 min，再離心棄上清，加入M199基礎(chǔ)培養(yǎng)基應(yīng)用液重懸沉淀，過200目網(wǎng)篩去除大塊組織，將所得懸液加到等體積Ficoll溶液中，離心，取中間沉淀，加到M199培養(yǎng)基中，細(xì)胞計數(shù)后將其接種至6孔板上，37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)24 h后換液，每隔2～3 d 1次，細(xì)胞穩(wěn)定培養(yǎng)7 d后進(jìn)行后續(xù)研究。

1.4.10 ICC細(xì)胞鑒定 細(xì)胞穩(wěn)定培養(yǎng)后，0.02 mol/L PBS洗去培養(yǎng)基，4%甲醛固定30 min，0.02 mol/L PBS緩沖液沖洗，0.5% TritonX-100通透10 min，0.02 mol/L PBS緩沖液沖洗，1%BSA封閉1 h，0.02 mol/L PBS緩沖液沖洗，加入小鼠抗c-kit多克隆抗體(1∶500)，置于濕盒中，4 ℃下孵育過夜，0.02 mol/L PBS緩沖液沖洗，滴加羊抗鼠HRP標(biāo)記二抗(1∶1 000)，置于濕盒中孵育，室溫下放置1 h，0.02 mol/L PBS緩沖液沖洗，防淬滅封片劑與DAPI(1∶500)稀釋封片，置于-20 ℃冰箱中保存，熒光顯微鏡拍片。

1.4.11 含藥血清制備 將60只大鼠隨機(jī)分為空白血清對照組、全方組、苦降組、辛開組、甘補(bǔ)組、陽性藥組，灌胃給藥量與“1.4.3”項下相同，連續(xù)7 d，處死，腹主動脈取血，12 000×g高速離心，取上清液，56 ℃下滅活，-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.12 細(xì)胞分組及給藥 取對數(shù)生長期的ICC細(xì)胞，稀釋成1×105個/mL單細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板上，每孔0.1 mL，每組設(shè)3個復(fù)孔，RPMI 1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)24 h，隨機(jī)分為正常組(25%空白血清)、模型組(NO 30 μmol/L)、全方組(NO 30 μmol/L+25%含藥血清)、苦降組(NO 30 μmol/L+25%含藥血清)、辛開組(NO 30 μmol/L+25%含藥血清)、甘補(bǔ)組(NO 30 μmol/L+25%含藥血清)、陽性藥組(NO 30 μmol/L+25%含藥血清)。

1.4.13 Ca2+含量測定 將各組ICC細(xì)胞加到0.2 mL 5 μmol/L Fluo-4-AM中，37 ℃下避光孵育 30 min，吸出染液，D-Hanks液沖洗3次，加入0.2 mL D-Hanks液，F(xiàn)luo-4-AM溶液處理5 min，激光共聚焦顯微鏡觀察拍照，設(shè)定激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為522 nm，采樣頻率為488 Hz，每皿選3～5個視野及4個形態(tài)良好的細(xì)胞，采ZEN blue edition 2.5軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析，以熒光強(qiáng)度增高的比值來衡量鈣含量變化。

2 結(jié)果

2.1 大鼠胃組織HE染色 造模后，大鼠胃組織固有層-黏膜下-漿膜層有淋巴細(xì)胞浸潤，肌層散在少量淋巴細(xì)胞，黏膜下水腫，固有層少許充血，為慢性淺表性胃炎(非萎縮性)的典型癥狀，表明模型建立成功。給藥后，全方組、辛開組、苦降組、甘補(bǔ)組、陽性藥組大鼠癥狀明顯好轉(zhuǎn)，胃黏膜表面上皮細(xì)胞受損、炎細(xì)胞浸潤狀況較模型組明顯減輕，胃腺排列稍整齊平整, 黏液增厚且腺管構(gòu)造逐漸規(guī)則。見圖1。

圖1 各組大鼠胃組織HE染色(×200)Fig.1 HE staining of rat gastric tissues in various groups(×200)

2.2 半夏瀉心湯對5-HT4、AchE、DA2、c-kitmRNA表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組AchE、5-HT4、c-kitmRNA表達(dá)降低(P<0.05，P<0.01)，DA2 mRNA表達(dá)升高(P<0.01)，表明模型建立成功；與模型組比較，全方組及各配伍組能不同程度提高AchEmRNA表達(dá)(P<0.05，P<0.01)，降低DA2 mRNA表達(dá)(P<0.01)，以全方組及甘補(bǔ)組更明顯；全方組可提高5-HT4、c-kitmRNA表達(dá)(P<0.05，P<0.01)；除辛開組可提高5-HT4 mRNA表達(dá)(P<0.01)外，其他各配伍組均無明顯變化(P>0.05)，表明半夏瀉心湯及配伍組可調(diào)節(jié)大鼠胃腸動力，有利于恢復(fù)其正常功能。見圖2。

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖2 半夏瀉心湯對5-HT4、AchE、DA2、c-kit mRNA表達(dá)的影響Fig.2 Effects of Banxia Xiexin Decoction on mRNA expressions of 5-HT4, AchE, DA2 and

2.3 半夏瀉心湯對5-HT4、AchE、DA2、c-kit蛋白表達(dá)的影響 模型組大鼠胃組織中AchE蛋白表達(dá)與正常組比較降低(P<0.05)，而全方組及配伍組可提高其蛋白表達(dá)(P<0.05)。與正常組比較，模型組大鼠胃組織中5-HT4蛋白表達(dá)降低(P<0.01)，而全方組及配伍組可提高其蛋白表達(dá)(P<0.05，P<0.01)，以全方組和辛開組更明顯(P<0.01)；DA2蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，而全方組及配伍組可降低其蛋白表達(dá)(P<0.05，P<0.01)，以全方組更明顯(P<0.01)；c-kit蛋白表達(dá)降低(P<0.01)，而全方組及配伍組可升高其蛋白表達(dá)(P<0.01)。見圖3。

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖3 半夏瀉心湯對5-HT4、AchE、DA2、c-kit蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effects of Banxia Xiexin Decoction on protein expressions of 5-HT4, AchE, DA2 and

2.4 半夏泄心湯對5-HT4/AchE/DA2、c-kit蛋白共表達(dá)的影響 與正常組大鼠比較，模型組大鼠胃組織5-HT4、c-kit熒光強(qiáng)度水平降低，經(jīng)全方組及配伍組干預(yù)后明顯升高(圖4A)；AchE熒光強(qiáng)度水平低于正常組，而全方組及配伍組能提高其水平，同時還可提高c-kit熒光強(qiáng)度值(圖4B)；DA2熒光強(qiáng)度高于正常組大鼠，出現(xiàn)了DA2/c-kit蛋白共表達(dá)，而全方組及配伍組可降低其熒光強(qiáng)度(圖4C)。

圖4 各組5-HT4(A)、AchE(B)、DA2(C)與c-kit蛋白共表達(dá)Fig.4 Co-expressions of 5-HT4 (A), AchE (B), DA2 (C) and c-kit protein in various groups

2.5 ICC細(xì)胞形態(tài)及鑒定 穩(wěn)定培養(yǎng)7 d后，在倒置顯微鏡下可見ICC細(xì)胞呈三角形、梭形或多邊形、核大，周圍充滿胞漿，胞體發(fā)出多條大小不等的樹枝狀突起，突起與周圍細(xì)胞的胞體和突起相互連接，見圖5。免疫熒光染色后，細(xì)胞表面c-kit呈綠色陽性顯性，胞體和突起均明顯熒光染色，見圖6。

圖5 光鏡下ICC細(xì)胞形態(tài)Fig.5 Morphologies of ICC cells under light microscope

圖6 熒光顯微鏡下ICC細(xì)胞形態(tài)Fig.6 Morphologies of ICC cells under fluorescencemicroscope

2.6 半夏瀉心湯全方對ICC鈣流的影響 與正常組比較，模型組ICC細(xì)胞鈣離子熒光強(qiáng)度增強(qiáng)(P<0.05)；與模型組比較，全方組及配伍組能降低ICC內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度(P<0.05，P<0.01)，以全方組更明顯(P<0.01)，表明全方組及各配伍組能不同程度抑制ICC鈣離子內(nèi)流的作用。見圖7。

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖7 各組ICC細(xì)胞中Ca2+的Fluo-4-AM熒光染色及熒光強(qiáng)度值Fig.7 Fluo-4-AM fluorescence staining and fluorescence intensity of Ca2+ in ICC cells in various

3 討論

ICC被稱為胃腸動力的“起搏者”和“調(diào)節(jié)者”[9]，c-kit表達(dá)是在胃腸肌ICC中存在的主要標(biāo)志物[10]。ICC中上述受體與胃腸神經(jīng)系統(tǒng)釋放的神經(jīng)遞質(zhì)和肽類物質(zhì)結(jié)合，將神經(jīng)信息傳送給平滑肌細(xì)胞，從而調(diào)控胃腸道平滑肌的舒縮是ICC細(xì)胞發(fā)揮功能的主要機(jī)制之一。本研究發(fā)現(xiàn)，半夏瀉心湯及不同配伍可通過調(diào)節(jié)AchE、5-HT4、DA2及c-kit的mRNA表達(dá)、蛋白表達(dá)，達(dá)到改善慢性胃炎的目的。其中，全方組在調(diào)節(jié)各受體及c-kit的mRNA和蛋白表達(dá)方面的效果皆極顯著，這與之前的研究結(jié)果相符[11-14]。其他各配伍組間效果則較為接近。其中，辛開組可極顯著提高5-HT4的mRNA和蛋白表達(dá)，推測是由于組中半夏和干姜均屬味辛性溫的中藥，而此前王鵬等[15]發(fā)現(xiàn)，溫?zé)嵝灾兴幠軌蛏险{(diào)大鼠血清5-HT的作用?？嘟到M和甘補(bǔ)組則能極顯著提高AchE的mRNA表達(dá)，可能源于苦降組中黃芩與黃連，據(jù)報道[16]，黃芩可使大鼠血清中乙酰膽堿(Ach)升高，進(jìn)而增加Ach水解酶AchE的活性。黃連則可提高大鼠外周組織中乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)活性而間接增強(qiáng)AchE的活性。此外，甘補(bǔ)組能極顯著提高AchE的mRNA表達(dá)的原因，可能與人參具有提高AchE活性的作用有關(guān)[17]。

ICC細(xì)胞還可通過起搏胃腸道慢波產(chǎn)生自發(fā)電節(jié)律變化并參與慢波的傳導(dǎo)發(fā)揮功能。本研究顯示，半夏瀉心湯及各配伍組能不同程度降低ICC細(xì)胞內(nèi)Ca2+的熒光強(qiáng)度，其中全方組效果較各配伍組更好。提示半夏瀉心湯及各個配伍組可通過降低ICC細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度，抑制ICC鈣超載，防止ICC興奮節(jié)律失常，從而調(diào)節(jié)胃腸道運動，與文獻(xiàn)[14]報道相符。

ICC的兩個功能間可能也具有一定的關(guān)聯(lián)性。如胃腸道的5-HT4可激活腺苷環(huán)化酶[18]，黃棪等[19]就曾發(fā)現(xiàn)，旋覆代赭湯可使5-HT4表達(dá)增加，促進(jìn)cAMP釋放，打開電壓門控鈣通道，最終使胞內(nèi)Ca2+濃度升高。至于半夏瀉心湯降低ICC細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度并調(diào)節(jié)胃腸道神經(jīng)遞質(zhì)的進(jìn)一步機(jī)制，以及ICC細(xì)胞內(nèi)Ca2+與這些神經(jīng)遞質(zhì)之間是否也存在類似的關(guān)聯(lián)性，還有待深入研究。