汪 冰， 解盈盈， 薛 菲， 翟士旭， 林永強(qiáng)*

(1.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東省中藥標(biāo)準(zhǔn)創(chuàng)新與質(zhì)量評(píng)價(jià)工程實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101；2.威海人生藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，山東 濟(jì)南 250022)

小兒解表口服液由金銀花、葛根、牛蒡子、黃芩、連翹、蒲公英、紫蘇葉等藥材經(jīng)提取而成，具有宣肺解表，清熱解毒之功效，臨床主要用于治療小兒外感風(fēng)熱引起的惡寒發(fā)熱、頭痛咳嗽、鼻塞流涕、咽喉痛癢[1-4]。該制劑現(xiàn)行質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)主要是連翹苷、黃芩苷、葛根素的TLC定性鑒別和金銀花中綠原酸定量測(cè)定[5]，雖然在一定程度上保障了產(chǎn)品質(zhì)量，但無法全面反映其質(zhì)量狀況。因此，本實(shí)驗(yàn)建立小兒解表口服液HPLC特征圖譜，并對(duì)隱綠原酸、葛根素、黃芩苷、牛蒡苷含量進(jìn)行測(cè)定，以期從整體上評(píng)價(jià)該制劑質(zhì)量[6-15]。

1 材料

Waters 2695高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司，配置二極管陣列檢測(cè)器、Empower 2色譜工作站)；CP225D電子分析天平(德國(guó)賽多利斯公司)；Milli-Q 超純水系統(tǒng)(美國(guó)默克密理博公司)；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器(功率500 W，昆山市超聲儀器有限公司)。小兒解表口服液13批，購(gòu)自威海人生藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)分別為20161201(S1)、20161202(S2)、20161203(S3)、0190101(S4)、0190102(S5)、0190103(S6)、0190104(S7)、0190201(S8)、0190202(S9)、0190203(S10)、0190301(S11)、0190302(S12)、0190303(S13)。

綠原酸(批號(hào)110753-201314，純度96.6%)、黃芩苷(批號(hào)110715-201117，純度91.7%)、葛根素(批號(hào)110752-201313，純度95.5%)、連翹苷(批號(hào)110821-201615，純度94.9%)、牛蒡苷(批號(hào)110819-200606)、4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸(批號(hào)111894-201102)、咖啡酸(批號(hào)110885-200102)對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；隱綠原酸對(duì)照品(批號(hào)MUST-19032403，純度99.07%)購(gòu)自成都普思生物科技有限公司。甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為Millipore純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent Extend-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-0.4%磷酸(B)，梯度洗脫(0～10 min，10%A；10～35 min，10%～25%A；35～40 min，25%～35%A；40～43 min，35%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取各對(duì)照品適量，50%甲醇制成每1 mL分別含綠原酸45.24 μg、隱綠原酸33.00 μg、咖啡酸5.04 μg、葛根素20.38 μg、4,5-二-O-咖啡?？鼘幩?1.56 μg、黃芩苷97.03 μg、連翹苷14.80 μg、牛蒡苷69.63 μg的溶液，即得。

2.2.2 對(duì)照藥材溶液 取蒲公英、金銀花、紫蘇葉、葛根、黃芩、連翹、牛蒡子對(duì)照藥材各0.1 g，25 mL 50%甲醇超聲處理30 min，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 供試品溶液 精密量取口服液2 mL，置于50 mL量瓶中，50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液 按制劑處方和工藝，分別制備缺蒲公英、缺金銀花、缺葛根、缺黃芩、缺連翹、缺牛蒡子、缺紫蘇葉陰性樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 特征圖譜方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取樣品(S1)，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，所得色譜圖中1～8號(hào)峰以綠原酸為參照，9～13號(hào)峰以黃芩苷為參照，測(cè)得13個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積RSD分別小于0.5%、1.0%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品(S1)，按“2.2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，所得色譜圖中1～8號(hào)峰以綠原酸為參照，9～13號(hào)峰以黃芩苷為參照，測(cè)得13個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積RSD均分別小于0.5%、1.5%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品(S1)，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、5、10、15、20、25 h在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，所得色譜圖中1～8號(hào)峰以綠原酸為參照，9～13號(hào)峰以黃芩苷為參照，測(cè)得13個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積RSD均分別小于0.5%、1.0%，表明溶液在25 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 圖譜生成 按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備13批樣品的供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2012年版)對(duì)其色譜圖進(jìn)行分析(圖1)，選擇重復(fù)性、分離度較好，可歸屬到處方藥味的13個(gè)色譜峰作為共有峰。由于共有峰在圖譜中主要分布于前后部分，較為分散，故以保留時(shí)間適中、峰面積較大、分離度較好的2號(hào)峰(綠原酸)、10號(hào)峰(黃芩苷)為參照，保留時(shí)間在25 min前的1～8號(hào)峰選擇前者，25 min后的9～13號(hào)峰選擇后者，計(jì)算共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果見表1～2。

圖1 13批樣品HPLC特征圖譜Fig.1 Characteristic HPLC chromatograms of thirteen batches of samples

表1 共有峰相對(duì)保留時(shí)間

表2 共有峰相對(duì)峰面積

2.5 共有峰相對(duì)保留時(shí)間規(guī)定值確定 以綠原酸為參照峰1，計(jì)算前8個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間；以黃芩苷為參照峰2，計(jì)算后5個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間。以13批樣品HPLC特征圖譜中13個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間平均值為規(guī)定值，分別為0.93(峰1)、1.00(峰2)、1.15(峰3)、1.40(峰4)、1.50(峰5)、1.86(峰6)、1.94(峰7)、2.32(峰8)、0.87(峰9)、1.00(峰10)、1.04(峰11)、1.07(峰12)、1.16(峰13)，并且偏差均應(yīng)在±5%以內(nèi)。由表2可知，8個(gè)共有峰相對(duì)峰面積RSD較大(>10%)，故只規(guī)定共有峰相對(duì)保留時(shí)間，而不規(guī)定其相對(duì)峰面積。

2.6 共有峰指認(rèn)及歸屬 通過與對(duì)照藥材溶液、陰性樣品溶液色譜峰進(jìn)行比較，可判定1號(hào)色譜峰來自蒲公英，2號(hào)色譜峰為金銀花、蒲公英、牛蒡子的共有峰，3號(hào)色譜峰來自金銀花，4號(hào)色譜峰為蒲公英、紫蘇葉的共有峰，5～8號(hào)色譜峰來自葛根，9號(hào)色譜峰為金銀花、蒲公英的共有峰，10、13號(hào)色譜峰來自黃芩，11號(hào)色譜峰來自連翹，12號(hào)色譜峰來自牛蒡子。再進(jìn)行對(duì)照品定位及紫外光譜比較，確定峰2為綠原酸，峰3為隱綠原酸，峰4為咖啡酸，峰5為葛根素，峰9為4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸，峰10為黃芩苷，峰11為連翹苷，峰12為牛蒡苷。色譜圖見圖2。

2.7 計(jì)量學(xué)分析

2.7.1 相似度計(jì)算 將13批樣品數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)，以對(duì)照特征圖譜為參照，進(jìn)行共有峰匹配后計(jì)算相似度，結(jié)果見表3，可知均高于0.98，表明各批樣品之間差異較小。

表3 13批樣品相似度

2.綠原酸 3.隱綠原酸 4.咖啡酸 5.葛根素 9.4,5-O-二咖啡?？鼘幩?10.黃芩苷 11.連翹苷 12.牛蒡苷2.chlorogenic acid 3.cryptochlorogenic acid 4.caffeic acid 5.puerarin 9.isochlorogenic acid C 10.baicalin 11.phillyrin 12. arctiin圖2 各成分HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of various constituens

2.7.2 聚類分析 通過SPSS19.0軟件，以13個(gè)共有峰峰面積為變量，采用組間聯(lián)接系統(tǒng)聚類法中的歐氏距離對(duì)13批樣品進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖3。由此可知，各批樣品大致分為2類，S1～S3聚為一類，生產(chǎn)日期為2016年；S4～S13聚為另一類，生產(chǎn)日期為2019年。

圖3 13批樣品聚類分析圖Fig.3 Cluster analysis plot for thirteen batches of samples

2.8 各成分含量測(cè)定

2.8.1 溶液制備

2.8.1.1 對(duì)照品溶液 精密稱取各對(duì)照品，50%甲醇制成每1 mL分別含牛蒡苷0.208 89 mg、黃芩苷0.291 09 mg、葛根素0.030 57 mg、隱綠原酸0.099 0 mg的溶液，即得。

2.8.1.2 供試品溶液 精密量取口服液2 mL，置于50 mL量瓶中，50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.8.2 方法學(xué)考察

2.8.2.1 線性關(guān)系考察 取“2.8.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，50%甲醇稀釋(牛蒡苷0.013 93、0.034 82、0.069 63、0.104 45、0.139 26、0.174 08、0.208 89 mg/mL，黃芩苷0.019 41、0.048 52、0.097 03、0.145 55、0.194 06、0.242 58、0.291 09 mg/mL，葛根素0.002 04、0.005 10、0.010 19、0.015 29、0.020 38、0.025 48、0.030 57 mg/mL，隱綠原酸0.006 6、0.016 5、0.033 0、0.049 5、0.066 0、0.082 5、0.099 0 mg/mL)，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，得方程分別為牛蒡苷Y=1.768 0×107X-5.531 9×104(r=0.999 9)、黃芩苷Y=1.731 1×107X-4.899 7×104(r=1.000 0)、葛根素Y=3.038 2×107X-1.910 9×104(r=1.000 0)、隱綠原酸Y=1.399 1×107X-2.297 0×104(r=0.999 9)，分別在0.013 93～0.208 89、0.019 41～0.291 09、0.002 04～0.030 57、0.006 6～0.099 0 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.8.2.2 精密度試驗(yàn) 取“2.8.2.1”項(xiàng)下各成分第3個(gè)質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得牛蒡苷、黃芩苷、葛根素、隱綠原酸峰面積RSD分別為1.16%、0.92%、0.89%、1.03%，表明儀器精密度良好。

2.8.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品(S1)，按“2.8.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得牛蒡苷、黃芩苷、葛根素、隱綠原酸含量RSD分別為1.10%、0.37%、0.23%、0.66%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液(S1)，于0、5、10、15、20、25 h在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得牛蒡苷、黃芩苷、葛根素、隱綠原酸峰面積RSD分別為0.86%、0.12%、0.42%、1.12%，表明溶液在25 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8.2.5 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含量已知的樣品6份(S1)，按“2.8.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，每份精密量取1 mL至50 mL量瓶中，精密加入對(duì)照品溶液[牛蒡苷(0.208 9 mg/mL)5 mL、黃芩苷(0.242 6 mg/mL)10 mL、葛根素(0.101 9 mg/mL)3 mL、隱綠原酸(0.099 0 mg/mL)5 mL]，50%甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表4。

表4 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.8.3 樣品含量測(cè)定 取13批樣品，按“2.8.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見表5。

表5 各成分含量測(cè)定結(jié)果(mg/mL，n=3)

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 本實(shí)驗(yàn)采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)8種成分的紫外吸收光譜進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)在230 nm下色譜峰數(shù)目較多，而且除黃芩苷外均有較好的吸收；該處波長(zhǎng)雖為黃芩苷較低吸收，但可減少與其他色譜峰的差異，同時(shí)各成分色譜峰峰形、分離度均較好。因此，選擇230 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 耐用性考察 本實(shí)驗(yàn)考察了4種色譜柱(Agilent Extend-C18，5 μm，250 mm×4.6 mm；依利特Hypersil BDS C18，5 μm，250 mm×4.6 mm；Thermo BDS Hypersil C18，5 μm, 250 mm×4.6 mm；Thermo ODS C18，5 μm，250 mm×4.6 mm)，其中Agilent Extend、Thermo BDS Hypersil色譜柱重復(fù)性較好。然后，對(duì)新購(gòu)買的、使用不同年限的色譜柱進(jìn)行，發(fā)現(xiàn)其重復(fù)性均較好。

3.3 HPLC特征圖譜分析 對(duì)13批小兒解表口服液進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)不同生產(chǎn)年限樣品分別聚為一類，推測(cè)可能是由于原料受生長(zhǎng)環(huán)境、采收時(shí)間、加工貯存等因素的影響；另一方面，口服液長(zhǎng)時(shí)間放置容易出現(xiàn)沉淀，會(huì)帶來穩(wěn)定性方面的問題，隱綠原酸等酚酸類成分易分解轉(zhuǎn)化[16-17]，而黃芩苷等黃酮類成分溶解性較差，也可能影響穩(wěn)定性。另外，相同生產(chǎn)年限的不同批次樣品雖然個(gè)別共有峰略有差異，但其質(zhì)量基本穩(wěn)定。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了小兒解表口服液HPLC特征圖譜，確定了13個(gè)共有峰，通過與對(duì)照藥材比對(duì)歸屬了方中7個(gè)藥味，再與對(duì)照品比對(duì)指認(rèn)了其中8種成分，發(fā)現(xiàn)13批樣品相似度均大于0.98，表明特征圖譜能較全面反映制劑整體狀況。同時(shí)，建立了專屬性較強(qiáng)的牛蒡苷、黃芩苷、葛根素、隱綠原酸含量測(cè)定方法，可為小兒解表口服液的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。