張康 付燕 張業(yè)廷 宋文靜

1 四川師范大學(xué)體育教育研究中心（成都610101）

2 北京體育大學(xué)（北京100084）

3 西南民族大學(xué)體育學(xué)院（成都610225） 4 成都大學(xué)體育學(xué)院（成都610106）

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是繼阿爾茨海默氏癥（Alzheimer’s dementia，AD）之后最常見的神經(jīng)退行性疾病。其主要病理特征為黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性死亡，導(dǎo)致多巴胺耗竭和運(yùn)動(dòng)障礙[1]。除運(yùn)動(dòng)障礙外，認(rèn)知、嗅覺、抑郁以及視幻覺等非運(yùn)動(dòng)癥狀在PD 發(fā)病過程中也較常見。這些非運(yùn)動(dòng)癥狀往往在未表現(xiàn)出明顯運(yùn)動(dòng)障礙之前已經(jīng)出現(xiàn)，如：認(rèn)知功能下降，尤其是海馬依賴性記憶能力下降[2]。

多巴胺能神經(jīng)元主要分布于中腦黑質(zhì)、腹側(cè)被蓋區(qū)、下丘腦以及各腦室周圍。其中，黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元可以通過中腦邊緣系統(tǒng)途徑投射到海馬區(qū)，表明黑質(zhì)多巴胺分泌不足可能會(huì)影響海馬依賴性記憶能力[3]?；谟跋駥W(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，利用海馬皮質(zhì)厚度和海馬體積鑒別帕金森癡呆（Parkinson disease with demen?tia，PDD）的準(zhǔn)確率高達(dá)80%[4]。因此，黑質(zhì)及其神經(jīng)纖維支配的海馬區(qū)可能是PD 認(rèn)知功能下降的基礎(chǔ)。目前，為了更深入研究PD，研究者通過1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl- 1，2，3，6-tet?rahydropyridine，MPTP）染毒的方式成功模擬了PD 的發(fā)病特征，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于PD嚙齒類動(dòng)物模型的建立中[5]。許多研究者也證實(shí)了MPTP可以通過損傷黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元引起PD 癥狀，并且在MPTP 模型中通?？梢杂^察到與PD 相似的海馬依賴性記憶等認(rèn)知功能明顯受損[6]。

細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulat?ed kinase，ERK）是多巴胺及谷氨酸N-甲基-D-天門冬氨酸受體（N-Metllyl-D-Aspanate receptor，NMDAR）通路中共同的下游靶點(diǎn)，也是海馬依賴性記憶能力中不可或缺的信號(hào)分子之一[7，8]。體內(nèi)的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）與受體酪氨酸激酶B（Tropomyosin receptor kinase B，TrkB）結(jié)合可以激活ERK1/2 及其下游的環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP- response element binding protein，CREB），保護(hù)神經(jīng)元存活、神經(jīng)遞質(zhì)釋放以及突觸可塑性，調(diào)節(jié)海馬依賴性記憶能力[9]。此外，多巴胺（dopa?mine，DA）與多巴胺D2 受體（dopamine 2 receptor，D2R）結(jié)合，可以直接上調(diào)ERK1/2蛋白表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖[8]。目前，臨床研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PD 患者黑質(zhì)中存在較密集的磷酸化ERK1/2[10]。改善黑質(zhì)和海馬區(qū)ERK1/2 信號(hào)通路中磷酸化蛋白和總蛋白表達(dá)都可能是預(yù)防和延緩PD記憶能力下降的重要途徑。

PD記憶能力下降往往在治療過程中被低估，雖然記憶能力下降是PD迫切需要討論和解決的重要問題，但迄今為止，很少有研究從整體上解決PD患者的記憶問題。運(yùn)動(dòng)可以改善多種神經(jīng)退行性疾病引起的神經(jīng)元受損，在神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)元存活以及神經(jīng)可塑性中發(fā)揮著顯著效用。已有研究者嘗試從不同角度解釋體育鍛煉對(duì)多巴胺耗竭引起的海馬神經(jīng)發(fā)生以及海馬依賴性記憶能力產(chǎn)生積極效應(yīng)的原因，但黑質(zhì)和海馬CA1區(qū)ERK1/2信號(hào)通路在運(yùn)動(dòng)改善PD記憶能力中的作用尚未被研究。本研究主要通過觀察運(yùn)動(dòng)干預(yù)后小鼠記憶能力、突觸可塑性蛋白和黑質(zhì)、海馬CA1 區(qū)ERK1/2信號(hào)通路變化，探討運(yùn)動(dòng)預(yù)防和改善PD記憶能力的可能生物學(xué)機(jī)制；同時(shí)，通過阻斷ERK1/2 分子觀察黑質(zhì)和海馬CA1區(qū)ERK1/2信號(hào)通路在運(yùn)動(dòng)改善PD記憶能力中的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象及分組

36 只正常健康雌性C57BL/6 小鼠，體重19.02 ±0.98 g，于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室分6籠飼養(yǎng)，每籠6只。自然喂養(yǎng)7天后，隨機(jī)分為6組：生理鹽水對(duì)照組（SC組）、PD 模型組（PD 組）、生理鹽水+運(yùn)動(dòng)組（SE 組）、PD＋運(yùn)動(dòng)組（PDE組）、PD＋運(yùn)動(dòng)＋二甲基亞砜（dimethyl sulf?oxide，DMSO）組（PDED 組）和PD＋運(yùn)動(dòng)＋PD98059 組（PDEP 組），每組6只。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程保持飼養(yǎng)環(huán)境干凈整潔，通氣良好，飼養(yǎng)溫度保持在23℃± 2℃，濕度保持在40%～60%，每日保持12小時(shí)光照/黑暗循環(huán)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方案及模型評(píng)價(jià)

實(shí)驗(yàn)流程見圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程

1.2.1 PD模型構(gòu)建

PD、PDE、PDED和PDEP組小鼠按照30 mg/kg[11]的劑量每隔3.5 天腹腔注射MPTP 溶液1 次，2 次/周，共5周。SC 和SE 組在相同的時(shí)間段腹腔注射30 mg/kg 劑量的生理鹽水，2次/周，共5周。

1.2.2 跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)方案

SE、PDE、PDED 和PDEP 組小鼠進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)，跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)于MPTP 注射第一天開始，每天19:00～20:00 固定時(shí)間進(jìn)行。自然喂養(yǎng)結(jié)束后，第1 周為適應(yīng)跑臺(tái)階段，采用較低運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度進(jìn)行。其中，第1～2 天跑速為6 m/min，第3～4 天跑速為8 m/min，第5 天為10 m/min，每天運(yùn)動(dòng)時(shí)間均為60 min。第2 周循序漸進(jìn)增加跑臺(tái)速度，最終跑速設(shè)定為12 m/min[12]，運(yùn)動(dòng)60 min/天，共5天/周，持續(xù)6周。八臂迷宮實(shí)驗(yàn)期間小鼠持續(xù)運(yùn)動(dòng)1 周；整個(gè)干預(yù)過程中跑臺(tái)坡度始終設(shè)置為0°。

1.2.3 ERK1/2信號(hào)阻斷

PDEP 組按照10 ml/kg 體重腹腔注射PD98059 溶液阻斷ERK1/2信號(hào)分子[13，14]，PDED組腹腔注射同等劑量10% DMSO 溶液作為對(duì)照。PD98059和DMSO 的注射時(shí)間選擇每次運(yùn)動(dòng)干預(yù)前2小時(shí)進(jìn)行。

1.2.4 PD模型評(píng)價(jià)

PD 模型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：運(yùn)動(dòng)干預(yù)結(jié)束后，通過震顫麻痹評(píng)分量表將小鼠的震顫麻痹分為0～4等級(jí)，0級(jí)：無任何癥狀；1級(jí)：出現(xiàn)弓背、豎毛、間歇性小震顫，但活動(dòng)自如；2級(jí)：吞咽頻繁，頻繁性震顫，后肢張開，活動(dòng)逐漸受限；3 級(jí)：出現(xiàn)流涎、持續(xù)性震顫，四肢僵硬，活動(dòng)受限；4 級(jí)，因全身麻痹而死亡[15]。通過黑質(zhì)酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）染色判斷PD 模型小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的功能受損情況。

1.3 測(cè)試方法、指標(biāo)

1.3.1 八臂迷宮測(cè)試小鼠記憶能力

八臂迷宮是用來評(píng)價(jià)藥物或大腦受損狀態(tài)下學(xué)習(xí)和記憶表現(xiàn)的一種有效方式。八臂迷宮實(shí)驗(yàn)包括訓(xùn)練和測(cè)試兩個(gè)階段。訓(xùn)練階段：禁食12 小時(shí)，保持體重在80%～85%之間。迷宮中央?yún)^(qū)和各臂均放置3～4粒直徑約為2 mm 的圓形食物，將3～4 只小鼠放入中央?yún)^(qū)30 s后，打開各臂通道自由活動(dòng)10 min，2次/天。之后，將每只小鼠單獨(dú)放入迷宮，在1、3、5、7號(hào)臂食盒的近端放一粒食物，小鼠吃盡食物或停留10 min 取出小鼠，2次/天。

測(cè)試階段：1、3、5、7 號(hào)臂中放入一粒直徑約為2 mm的圓形食物，將小鼠放入中央?yún)^(qū)30 s后自由活動(dòng)并尋找食物10 min，當(dāng)吃盡各臂食物或10 min之內(nèi)未吃完食物，系統(tǒng)均自動(dòng)終止實(shí)驗(yàn)。計(jì)算機(jī)自動(dòng)輸出檢測(cè)指標(biāo)：①工作記憶錯(cuò)誤：同一次訓(xùn)練中小鼠重復(fù)進(jìn)入已經(jīng)吃過食物的臂；②工作記憶錯(cuò)誤率：工作記憶錯(cuò)誤與總的入臂次數(shù)之比；③參考記憶錯(cuò)誤：小鼠進(jìn)入不曾放過食物的臂；④參考記憶錯(cuò)誤率：參考記憶錯(cuò)誤與總的入臂次數(shù)之比。

1.3.2 取材

行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，斷頸處死。取小鼠完整腦組織，放入液氮速凍，－80℃冰箱保存，待制作黑質(zhì)、海馬部位的切片。根據(jù)腦立體定位圖譜，黑質(zhì)切片選取前囟－4.8 mm 到－6.3 mm，海馬CA1 區(qū)選取約前囟－2.12 mm，切片約10 mm。

1.3.3 TH免疫組化染色

利用免疫組化染色觀察小鼠腦組織切片中黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞的變化。腦組織切片脫蠟后放入染色缸，3%甲醛雙氧水室溫10 min；0.1%磷酸緩沖鹽（PBS）清洗切片3 次，5 min/次。洗凈的切片放入0.01 M 檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0），加熱直至沸騰5 min，重復(fù)1次。PBS清洗3×5 min/次，滴加10%山羊血清封閉液封20 min，滴加TH一抗（濃度1︰800），4℃孵育過夜。滴加生物素化山羊抗兔二抗，37℃孵化30 min；0.1%PBS清洗3×5 min/次；DAB顯色、復(fù)染；中性樹膠封片，自然晾干。將載玻片放入蔡司光學(xué)顯微鏡上進(jìn)行掃描成像，并使用MBF生物科學(xué)數(shù)字顯微鏡攝像機(jī)（Willis?ton，VT）在計(jì)算機(jī)上進(jìn)行成像；在100倍放大倍數(shù)下，通過人工計(jì)數(shù)每張拍照?qǐng)D像來統(tǒng)計(jì)TH細(xì)胞的數(shù)量。

1.3.4 免疫熒光染色

利用免疫熒光觀察小鼠腦組織切片中黑質(zhì)和海馬CA1 區(qū)中ERK1/2、CREB、突觸素（synaptophysin，SYN）和突觸后致密蛋白95（postsynaptic density-95，PSD-95）PSD-95 蛋白表達(dá)。脫蠟至水；0.01 M 檸檬酸鹽緩沖液（pH=6.0）中加熱至沸騰，重復(fù)1 次；PBS 清洗5 min/次，反復(fù)清洗3次。37℃室溫下使用10%山羊血清封閉30 min；滴加一定比例ERK1/2、CREB、SYN 和PSD-95 一抗（濃度：1︰50、1︰50、1︰400 和1︰100），4℃過夜。PBS 清洗3×5 min/次；滴加二抗，37℃孵育30 min。PBS 清洗切片3×5 min/次；滴加4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-Diamidino-2-Phenylindole，Di?hydrochloride，DAPI）染液，37℃孵育30 min；PBS 清洗切片3×5 min/次；用抗熒光衰減封片劑封片。采用免疫熒光顯微鏡觀察并采集黑質(zhì)及海馬區(qū)的圖像并分析結(jié)果；使用image J 軟件測(cè)量平均熒光強(qiáng)度值，對(duì)黑質(zhì)和海馬神經(jīng)元蛋白表達(dá)進(jìn)行半定量分析。特定區(qū)域熒光強(qiáng)度公式為：平均熒光強(qiáng)度=該區(qū)域熒光強(qiáng)度總和/該區(qū)域面積。

1.4 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

MPTP（proteintech 公司），Anti-Tyrosine Hydroxy?lase 抗體（abcam 公司），ERK1/2 Antibody（proteintech公司），Anti-SYN Antibody（abcam公司），PSD-95 Anti?body（proteintech 公司），CERB Antibody（proteintech 公司），β-actin 兔克隆抗體（abcam 公司），冰凍切片機(jī)（Leica 公司），蓋玻片（江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司），載玻片（江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司），熒光顯微鏡（德國(guó)Leica公司）等。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0對(duì)各組小鼠行為學(xué)和分子生物學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間采用多因素方差分析（ANOVA）法分析不同指標(biāo)的差異性，采用最小顯著性差異（LSD）法對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模后PD小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元及行為學(xué)比較

通過震顫麻痹評(píng)分表對(duì)PD組小鼠進(jìn)行評(píng)級(jí)發(fā)現(xiàn)，PD 小鼠成模率約83.33%。具體表現(xiàn)為，約66.67%的小鼠表現(xiàn)出第二等級(jí)的典型特征：豎毛、豎尾、流涎、持續(xù)震顫、四肢僵硬；16.67%的小鼠表現(xiàn)出第一等級(jí)特征：豎毛、間歇性小震顫和弓背。從黑質(zhì)TH 染色結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，與SC組相比，PD組黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞數(shù)量平均減少約45.75%（8.23 ± 1.21 vs.17.99 ± 0.95，P<0.01），SE組和PDE組小鼠黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞數(shù)量比SC組和PD 組小鼠明顯增加（26.31 ± 2.14 vs.17.99 ±0.95，13.85 ± 1.27 vs.8.23 ± 1.21，P<0.05）。見圖2。

圖2 SC、PD、SE和PDE組小鼠黑質(zhì)TH染色（標(biāo)尺：100μm）

2.2 八臂迷宮測(cè)試中各組小鼠記憶能力比較

由表1 可知，與SC 組相比，PD 組小鼠工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)和工作記憶錯(cuò)誤率顯著升高（P<0.05）；SE 組小鼠工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)和工作記憶錯(cuò)誤率與SC 組相比僅表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)。與PD組小鼠相比，PDE組小鼠工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)和工作記憶錯(cuò)誤率均顯著降低（P<0.01）；與PDE組相比，PDED組小鼠工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)和工作記憶錯(cuò)誤率均未表現(xiàn)出顯著差異。PDEP 組小鼠與PDED 組小鼠之間工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)和工作記憶錯(cuò)誤率也未顯示顯著差異，但從數(shù)據(jù)來看，PDEP 小鼠工作記憶錯(cuò)誤率平均增加幅度更大。

表1 八臂迷宮測(cè)試中各組小鼠記憶能力比較（n=6）

PD 組小鼠參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)顯著高于SC 組（P<0.05）；參考記憶錯(cuò)誤率未表現(xiàn)出顯著變化。PDE 組小鼠參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)和參考記憶錯(cuò)誤率比PD 組均顯著降低（P<0.05）；與SC 組相比，SE 組小鼠參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)和參考記憶錯(cuò)誤率均表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，但不顯著。PDED 組小鼠參考記憶錯(cuò)誤率明顯高于PDE 組（P<0.05），PDED組與PDEP組之間未表現(xiàn)出顯著差異；但從數(shù)據(jù)來看，PDEP組小鼠參考記憶錯(cuò)誤率和參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)均存在增加的趨勢(shì)。

2.3 各組小鼠黑質(zhì)、海馬CA1 區(qū)SYN 和PSD-95 蛋白表達(dá)比較

如圖3、圖4、表2所示，與SC 組相比，PD 組小鼠黑質(zhì)SYN和PSD-95染色面積明顯減少，但蛋白表達(dá)僅表現(xiàn)出了下降的趨勢(shì)。與PD 組相比，PDE 組小鼠黑質(zhì)SYN和PSD-95染色面積增加，但蛋白表達(dá)未表現(xiàn)出顯著變化，僅表現(xiàn)出升高的趨勢(shì)。與PDE 組相比，PDED組小鼠黑質(zhì)SYN 和PSD-95 染色面積及蛋白表達(dá)均無顯著差異。與PDED組相比，PDEP組小鼠黑質(zhì)PSD-95蛋白表達(dá)顯著下降（P<0.01）。

表2 各組小鼠黑質(zhì)、海馬CA1區(qū)SYN和PSD-95蛋白表達(dá)比較（n=6）

圖3 各組小鼠黑質(zhì)、海馬CA1區(qū)SYN蛋白表達(dá)比較（綠色為SYN染色，藍(lán)色為DAPI染色）

圖4 各組小鼠黑質(zhì)、海馬CA1區(qū)PSD-95蛋白表達(dá)比較（綠色為PSD-95染色，藍(lán)色為DAPI染色）

與SC 組比，PD 組小鼠海馬CA1 區(qū)SYN 和PSD-95染色面積明顯減少，但蛋白表達(dá)僅表現(xiàn)出了下降的趨勢(shì)；SE 組小鼠海馬CA1 區(qū)SYN 和PSD-95 染色面積明顯增加，蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01）。與PD 組相比，PDE 組小鼠SYN 染色面積明顯增加，蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01），PSD-95未表現(xiàn)出顯著變化。與PDE組相比，PDED小鼠海馬CA1區(qū)SYN蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.01）。與PDED組相比，PDEP組SYN蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.01），PSD-95未顯示出顯著差異。

2.4 各組小鼠黑質(zhì)、海馬CA1 區(qū)ERK1/2、CREB 蛋白表達(dá)比較

如圖5、圖6、表3所示，與SC 組相比，PD 組小鼠黑質(zhì)ERK1/2 和CREB 免疫熒光染色面積均明顯減少，蛋白表達(dá)均顯著降低；SE組小鼠黑質(zhì)ERK1/2免疫熒光染色面積明顯增加，蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01）。與PD組相比，PDE 組黑質(zhì)ERK1/2 和CREB 免疫熒光染色面積均明顯增加，蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01）。與PDE組相比，PDED 組小鼠黑質(zhì)ERK1/2 和CREB 免疫熒光染色面積和蛋白表達(dá)均未表現(xiàn)出顯著變化。PDEP 組比PDED 組黑質(zhì)ERK1/2 和CREB 蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.01和P<0.05）。

表3 各組小鼠黑質(zhì)、海馬CA1區(qū)ERK1/2信號(hào)通路中的相關(guān)蛋白表達(dá)比較（n=6）

圖5 各組小鼠黑質(zhì)、海馬CA1區(qū)ERK1/2蛋白表達(dá)比較（綠色為ERK1/2染色，藍(lán)色為DAPI染色）

圖6 各組小鼠黑質(zhì)、海馬CA1區(qū)CREB蛋白表達(dá)比較（綠色為CREB染色，藍(lán)色為DAPI染色）

與SC組相比，PD組小鼠海馬CA1區(qū)CREB免疫熒光染色面積明顯減少，蛋白表達(dá)顯著減少（P<0.01），ERK1/2 僅表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)；SE 組小鼠海馬CA1 區(qū)ERK1/2免疫熒光染色面積明顯增加，蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01）。與PD 組相比，PDE 組小鼠海馬CA1 區(qū)ERK1/2免疫熒光染色面積明顯增加，蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01）；CREB 變化不顯著，僅表現(xiàn)出升高的趨勢(shì)。與PDED 組相比，PDEP 組小鼠CA1 區(qū)ERK1/2 和CREB免疫熒光染色面積明顯減少，蛋白表達(dá)顯著減少（P<0.01）；PDED組與PDE組之間無顯著差異。

3 討論

TH 是兒茶酚胺（catecholamine，CA）（多巴胺、去甲腎上腺素和腎上腺素等）生物合成的起始和限速酶[16]，參與了PD等多種CA疾病的發(fā)病機(jī)制，對(duì)于依賴于CA細(xì)胞活性的神經(jīng)元功能至關(guān)重要。通過TH染色觀察黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的完整性是目前判斷PD 病理進(jìn)程的“金標(biāo)準(zhǔn)”[17]。目前，睪丸激素已被認(rèn)為是導(dǎo)致PD 的潛在危險(xiǎn)因素，因此本研究采用與Lu[17]、Gong[18]、Torres[19]等研究相同的雌性小鼠作為研究對(duì)象。本研究結(jié)果顯示，正常小鼠黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞較多，MPTP處理的小鼠黑質(zhì)TH 陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯降低，說明MPTP染毒誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生了與PD 相似的多巴胺能神經(jīng)元功能異常。以往研究指出，MPTP處理后小鼠黑質(zhì)致密部TH 減少54.0% ± 4.3%[20]。Churchill 等[21]也發(fā)現(xiàn)MPTP處理的小鼠黑質(zhì)致密部TH 計(jì)數(shù)下降50%，4 周后下降55%，均與本研究結(jié)果相近。本研究中經(jīng)過跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)的PD 模型小鼠黑質(zhì)TH 陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于PD 模型組，說明跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可以有效抑制多巴胺能神經(jīng)元功能受損，延緩PD的發(fā)展速度?；谌梭w或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究均發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)可以有效緩解PD導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)行為障礙和黑質(zhì)TH活性降低或數(shù)量減少。Cugusi等[22]研究發(fā)現(xiàn)，跑步機(jī)運(yùn)動(dòng)可以顯著改善PD 患者的步行距離、下肢肌肉力量、平衡能力、活動(dòng)安全性、抑郁和冷漠等癥狀，揭示了跑步機(jī)運(yùn)動(dòng)在改善PD患者運(yùn)動(dòng)癥狀和非運(yùn)動(dòng)癥狀方面的有效性。Koo 等[23]究發(fā)現(xiàn)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)能夠促進(jìn)PD 小鼠黑質(zhì)TH 表達(dá)，抑制多巴胺能神經(jīng)元的丟失。因此，運(yùn)動(dòng)在延緩或改善PD 病程中具有重要價(jià)值，可以作為PD治療中的一種重要的輔助手段。

此外，本研究結(jié)果還顯示PD組小鼠的工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)、工作記憶錯(cuò)誤率和參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)明顯高于生理鹽水對(duì)照組，運(yùn)動(dòng)干預(yù)的PD組小鼠工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)、工作記憶錯(cuò)誤率、參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)以及參考記憶錯(cuò)誤率比PD 組小鼠明顯降低，說明PD 小鼠表現(xiàn)出了明顯的記憶能力減退，跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可以有效改善PD小鼠和正常小鼠的記憶能力。這一結(jié)果與許多國(guó)外臨床研究的結(jié)論相同。如：Bello等[24]研究證實(shí)，跑步機(jī)運(yùn)動(dòng)能夠有效提高PD患者的認(rèn)知任務(wù)成績(jī)。Cruise等[25]發(fā)現(xiàn)有氧運(yùn)動(dòng)可以選擇性改善PD 患者的認(rèn)知功能，如：工作記憶和執(zhí)行功能?，F(xiàn)在越來越多的證據(jù)表明，記憶能力與突觸可塑性有關(guān)，突觸功能減退或突觸相關(guān)蛋白表達(dá)下降是早期神經(jīng)退行性疾病常見的病理特征[26]。SYN 和PSD-95 蛋白是神經(jīng)元突觸的一種特異性突觸前標(biāo)志蛋白和突觸后致密蛋白，參與突觸生長(zhǎng)、發(fā)育以及重塑，在各種記憶中發(fā)揮著不可或缺的作用[17，27，28]。一些基于PD 動(dòng)物模型的研究發(fā)現(xiàn)，PD 小鼠海馬突觸結(jié)構(gòu)、功能可塑性受損和突觸標(biāo)志蛋白表達(dá)失調(diào)。Qu等[29]在MPTP 誘導(dǎo)的PD小鼠中發(fā)現(xiàn)海馬DG區(qū)和CA3區(qū)苔蘚纖維強(qiáng)度明顯降低，突觸可塑性受損，認(rèn)為其機(jī)制可能涉及到MPTP 下調(diào)了SYN 和PSD-95 等的表達(dá)，以及降低BDNF-TrkB 通路的活性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PD 小鼠黑質(zhì)和海馬CA1 區(qū)SYN 和PSD-95 表達(dá)均表現(xiàn)出了降低的趨勢(shì)，跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)明顯增強(qiáng)了海馬CA1區(qū)SYN蛋白表達(dá)，同時(shí)，黑質(zhì)SYN、PSD-95蛋白表達(dá)存在上調(diào)的趨勢(shì)，說明跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)具有增強(qiáng)PD小鼠黑質(zhì)和海馬CA1區(qū)突觸可塑性的潛力，最終導(dǎo)致PD小鼠記憶能力得到改善。雖然運(yùn)動(dòng)干預(yù)的正常小鼠工作記憶和參考記憶錯(cuò)誤次/率僅表現(xiàn)出了下降的趨勢(shì)，但海馬CA1 區(qū)SYN 和PSD-95 蛋白表達(dá)均顯著升高。本研究考慮到PD 的運(yùn)動(dòng)障礙，選擇較小運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度干預(yù)，因此，可能較小強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)引起的正常小鼠突觸可塑性的改變程度未能達(dá)到記憶能力改善的閾值，新生成的神經(jīng)元突觸或者增強(qiáng)的突觸功能達(dá)不到改善記憶能力的效果，后期將對(duì)不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的干預(yù)效果進(jìn)行進(jìn)一步研究。Klein[2]在研究中也發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)可以改善MPTP 小鼠Morris 水迷宮測(cè)試的認(rèn)知功能，但隨著蛋白或基因表達(dá)的升高將出現(xiàn)天花板效應(yīng)，升高到一定水平后，運(yùn)動(dòng)不再有助于認(rèn)知行為的進(jìn)一步改善，該研究與本研究結(jié)果相似。以往關(guān)于PD黑質(zhì)、海馬突觸可塑性和認(rèn)知功能機(jī)制的研究指出，PD記憶能力和突觸可塑性的改變與BDNF 表達(dá)上調(diào)有關(guān)。Hirsch 等[30]系統(tǒng)回顧了2017年6月之前收錄在MEDLINE、EMBASE、Cochrane Library、PsycINFO 和PubMed 等數(shù)據(jù)庫中關(guān)于運(yùn)動(dòng)與PD 患者血清腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neu?rotrophic factor，BDNF）的研究，其中兩項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)和四項(xiàng)預(yù)實(shí)驗(yàn)研究提供了運(yùn)動(dòng)療法增加PD 患者血清BDNF的直接證據(jù)。基于MPTP小鼠的文獻(xiàn)均證實(shí)，振動(dòng)和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)均能夠上調(diào)PD 小鼠腦組織BDNF 表達(dá)，預(yù)防多巴胺能神經(jīng)元功能受損，并提出運(yùn)動(dòng)時(shí)間越長(zhǎng)對(duì)細(xì)胞水平的增益效果越明顯[31，32]。因此，本研究認(rèn)為BDNF及其下游因子的改變可能是運(yùn)動(dòng)改善PD記憶能力的重要原因。

ERK1/2 信號(hào)通路是BDNF 下游調(diào)控神經(jīng)元存活、神經(jīng)遞質(zhì)釋放以及突觸可塑性的重要途徑，也是目前研究最多的信號(hào)通路之一。越來越多的證據(jù)表明，PD與ERK1/2 活性密切相關(guān)，甚至一些研究者將PD 歸因于ERK 基因表達(dá)的依賴性變化[33]。靜息狀態(tài)下，ERK位于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)ERK被激活時(shí)可以迅速磷酸化，進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控其他轉(zhuǎn)錄因子的活性，影響SYN和PSD-95等特異性蛋白表達(dá)，引起細(xì)胞能量代謝、生理生化功能改變，進(jìn)而發(fā)揮維持神經(jīng)元發(fā)育和突觸可塑性穩(wěn)態(tài)的作用[34]。Liang等[35]觀察MPTP誘導(dǎo)的亞急性PD模型小鼠發(fā)現(xiàn)，中腦p-ERK1/2/ERK1/2表達(dá)顯著降低，治療后隨著PD 癥狀的改善，p-ERK1/2/ERK1/2 表達(dá)明顯升高。但也有研究得出不同的結(jié)論，Siracusa 等[36]觀察MPTP誘導(dǎo)的亞急性PD模型小鼠發(fā)現(xiàn)，PD模型小鼠多巴胺能神經(jīng)元p-ERK1/2 蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，認(rèn)為PD癥狀的改善與p-ERK1/2 蛋白表達(dá)下降有關(guān)。ERK1/2磷酸化水平的改變涉及p-ERK1/2 蛋白的改變和ERK1/2蛋白的改變。我們推測(cè)，PD腦組織中p-ERK1/2/ERK1/2 的改變不僅僅是p-ERK1/2 發(fā)生了改變，ERK1/2信號(hào)通路中相關(guān)因子的改變?cè)诟纳芇D癥狀中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。以往較少有研究從ERK1/2 通路入手探討ERK1/2 信號(hào)通路中相關(guān)因子表達(dá)的改變是否是PD 認(rèn)知癥狀改變的潛在原因。本研究針對(duì)ERK1/2表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)、分析，研究結(jié)果顯示，與生理鹽水對(duì)照組相比，PD 模型小鼠黑質(zhì)和海馬CA1 區(qū)CREB蛋白表達(dá)和黑質(zhì)ERK1/2蛋白表達(dá)均顯著降低，跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)的PD模型小鼠黑質(zhì)ERK1/2、CREB以及海馬CA1區(qū)ERK1/2蛋白表達(dá)明顯升高，說明運(yùn)動(dòng)有效地增強(qiáng)了PD模型小鼠黑質(zhì)和海馬CA1 區(qū)ERK1/2 信號(hào)通路中相關(guān)因子表達(dá)。最近的一項(xiàng)研究顯示，ERK1/2-CREB信號(hào)通路參與促進(jìn)海馬神經(jīng)元樹突棘絲狀偽足、蘑菇狀突起及谷氨酸能興奮性突觸的形成[37]。阻斷ERK1/2 信號(hào)可以減少新的樹突棘和偽足的形成，抑制長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（long-term potentiation，LTP）[38，39]。因此，PD 模型小鼠記憶能力和突觸可塑性的改善可能是運(yùn)動(dòng)上調(diào)了黑質(zhì)和海馬CA1區(qū)ERK1/2信號(hào)通路中相關(guān)因子表達(dá)。

為了進(jìn)一步證實(shí)ERK1/2 信號(hào)通路在跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)改善PD小鼠記憶能力中的作用，本研究采用PD98059抑制ERK1/2 分子觀察PD 小鼠記憶能力以及黑質(zhì)、海馬CA1 區(qū)SYN 和PSD-95 蛋白變化，結(jié)果顯示ERK1/2 分子阻斷后，跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)的PD小鼠黑質(zhì)和海馬CA1區(qū)SYN或PSD-95蛋白表達(dá)顯著降低，工作記憶和參考記憶錯(cuò)誤率存在降低的趨勢(shì)；注射10%DMSO溶液的小鼠與僅進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)的PD 小鼠相比無顯著差異，海馬CA1區(qū)SYN蛋白下調(diào)，說明10%DMSO溶液對(duì)小鼠記憶能力結(jié)果的影響較小，ERK1/2信號(hào)通路在跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)改善PD 小鼠黑質(zhì)和海馬CA1 區(qū)突觸可塑性和記憶能力中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，進(jìn)一步證實(shí)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可以通過上調(diào)ERK1/2信號(hào)通路中相關(guān)因子表達(dá)，改善黑質(zhì)和海馬CA1區(qū)突觸可塑性，增強(qiáng)PD小鼠記憶能力。ERK1/2分子阻斷后小鼠參考記憶和工作記憶僅表現(xiàn)出了增強(qiáng)的趨勢(shì)?？赡苁怯捎赑D是一種多系統(tǒng)的退行性疾病，除黑質(zhì)和海馬投射路徑外，額葉ERK1/2蛋白表達(dá)異常等也是導(dǎo)致PD認(rèn)知功能受損的關(guān)鍵原因。Luo等[40]也發(fā)現(xiàn)ERK激酶抑制劑PD98095定點(diǎn)注射前額葉內(nèi)可以顯著抑制ERK1/2 和CREB 標(biāo)記細(xì)胞數(shù)量，并嚴(yán)重?fù)p害大鼠長(zhǎng)期回避恐懼記憶的恢復(fù)。因此，推測(cè)PD小鼠記憶能力的下降與改善可能也與額葉功能有關(guān)，且記憶能力受損的不同階段可能涉及到不同的神經(jīng)機(jī)制，對(duì)此，尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

4 結(jié)論

慢性MPTP 染毒誘導(dǎo)的PD 小鼠具備了PD 典型的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元功能受損，表現(xiàn)出工作記憶和參考記憶減退。跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可以通過調(diào)節(jié)ERK1/2 信號(hào)通路，改善黑質(zhì)和海馬CA1 區(qū)突觸可塑性，增強(qiáng)PD 小鼠記憶能力。