劉建庭，仉 瑜，卜睿臻，趙鴻鵬，趙 宇，張洪兵，許 浚，張鐵軍，王 磊*，劉昌孝*

1.天津藥物研究院 釋藥技術與藥代動力學國家重點實驗室，天津 300462

2.天津藥物研究院 天津市中藥質量標志物重點實驗室，天津 300193

3.天津中醫(yī)藥大學，天津 301617

4.天津達仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司，天津 300112

風濕、類風濕性疾病、關節(jié)炎屬于慢性病，在傳統(tǒng)醫(yī)學中屬于痹癥，傳統(tǒng)觀念中痹癥的產生是由“皆因體虛，腠理空虛，受風寒濕氣而成”，故治療以益氣養(yǎng)血、祛風除濕、散寒通絡和活血止痛為治療原則[1]。痹祺膠囊來源于漢代名醫(yī)華佗的“一粒仙丹”，由馬錢子粉、黨參、白術、茯苓、丹參、三七、川芎、牛膝、地龍與甘草10味藥組成，具有益氣養(yǎng)血、祛風除濕、活血止痛的功效。其中馬錢子粉為君藥，起通痹消痛之功效；黨參、白術、茯苓與丹參為臣藥，黨參補血益氣，白術祛風寒濕痹，茯苓健脾益氣，丹參養(yǎng)血和血；三七、川芎、牛膝、地龍為佐藥，其中三七止血化瘀、消腫止痛，川芎活血行氣、祛風止痛，牛膝、地龍活血化瘀、通絡止痛；甘草為使藥，調和諸藥之功效，充分體現(xiàn)君臣佐使的處方原則[2-3]?，F(xiàn)代藥理研究已證明痹祺膠囊具有鎮(zhèn)痛抗炎作用，臨床上用于治療風濕、類風濕性關節(jié)炎和腰椎間盤突出等癥[4]。為進一步闡明痹祺膠囊組方的科學性及藥效成分，本實驗采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜聯(lián)用技術（UPLC-Q/TOF-MS）技術，對痹祺膠囊及其入血成分進行了研究，以確定痹祺膠囊的藥效物質基礎，為痹祺膠囊的后續(xù)研究提供理論基礎。

1 材料與儀器

1.1 儀器

Acquity UPLC超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Xevo G2 Q-TOF高分辨質譜（美國Waters公司）；AB204-N電子天平（德國Meteler公司）；BT25S電子天平（德國 Sartorius公司）；超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技公司）；VORTEX-5旋渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造公司）。

1.2 試劑與材料

對照品士的寧（批號110705-200306）、馬錢子堿（批號110706-200505）、人參皂苷Rb1（批號110704-201827）、人參皂苷Rd（批號111818- 201603）、人參皂苷Re（批號110754-202028）、人參皂苷Rg1（批號110703-201731）、三七皂苷R1（批號110745-201921）、阿魏酸（批號110773-200611）、蛻皮甾酮（批號111638-200402）均購自中國食品藥品檢定研究院；對照品甘草次酸（批號MUST- 16032217）、丹酚酸B（批號MUST-17040503）、丹參酮IIA（批號MUST-17101811）、迷迭香酸（批號MUST-18053110）、丹參素（批號MUST-18060920）、茯苓酸（批號MUST-18072910）、Z-藁本內酯（批號MUST-19041005）均購自成都曼斯特生物科技；對照品白術內酯II（批號M22A10S95762）、白術內酯III（批號M13D10S105676）、黨參炔苷（批號P13M11L112809）、洋川芎內酯 I（批號P27A11F122339）、甘草酸（批號Y02J11L113432）、去氫土莫酸（批號Z27M10S89331）均購自上海源葉生物科技有限公司；所有對照品質量分數(shù)均＞95%。甲醇、乙腈、甲酸為色譜純，購自天津康科德科技有限公司；純凈水購自杭州娃哈哈飲用水有限公司；痹祺膠囊（批號311574）由天津達仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司提供。

雄性SD大鼠，SPF級，體質量（200±20）g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，動物許可證號SCXK（京）2019-0010。動物倫理批準單位天津天誠新藥評價有限公司（動物倫理批準號 2021031901）。

2 方法

2.1 動物實驗

取痹祺膠囊內容物適量，加入0.3%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）混勻制成質量濃度為0.3 g/mL混懸液，作為痹祺膠囊大鼠ig溶液。

雄性SD大鼠，飼養(yǎng)于室溫25 ℃、濕度50%、12 h晝夜交替的環(huán)境，自由采食、飲水飼養(yǎng)適應1周。實驗前禁食12 h，但不禁水，隨機分為2組并稱定體質量，空白對照組按10 mL/kg ig給予0.3% CMC-Na溶液，痹祺膠囊給藥組按10 mL/kg的劑量ig痹祺膠囊溶液。給藥1、2和4 h后，以10%水合氯醛麻醉，肝門靜脈取血置于肝素化試管中，在3000 r/min離心10 min分離血漿，置-20 ℃冰箱中保存，備用。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取對照品士的寧、馬錢子堿、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、三七皂苷R1、茯苓酸、去氫土莫酸、洋川芎內酯I、藁本內酯、阿魏酸、丹參素、丹酚酸B、丹參酮IIA、甘草酸、迷迭香酸、甘草次酸、白術內酯II、白術內酯III、黨參炔苷、蛻皮甾酮適量，加甲醇溶解制備成各質量濃度約為10 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 體外樣品的制備 取痹祺膠囊內容物0.30 g，精密稱定，置于5 mL量瓶中，加入75%甲醇，密塞，超聲處理40 min，放冷，搖勻，0.22 μm濾膜濾過，續(xù)濾液供UPLC-Q/TOF-MS檢測分析。

2.2.3 血漿樣品的制備 取給藥后各時間點血漿樣品等體積混勻，取600 μL置于EP管中，加入4倍量甲醇，渦旋1 min混勻沉淀蛋白，于4 ℃條件下13 000 r/min離心10 min，上清液4 ℃下N2吹干，殘渣以150 μL 75%甲醇渦旋1 min復溶，13 000 r/min離心10 min，吸取上清液供UPLC-Q/TOF-MS檢測分析?？瞻籽獫{進行同樣操作。

2.3 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為乙腈（A）-含0.1%甲酸的水溶液（B）；體積流量0.2 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量5 μL；梯度洗脫：0～4 min，5%～14%A；4～11 min，14%～23%A；11～18 min，23%A；18～21 min，23%～30%A；21～27 min，30%～40%A；27～29 min，40%～50%A，29～40 min，50%～55%A；40～50 min，55%～95%A；50～55 min，95%A。

2.4 質譜條件

質譜分析采用Waters Xevo G2 Q-Tof高分辨質譜，配備電噴霧離子源（ESI），毛細管電壓，正離子模式為3.0 kV，負離子模式為2 kV。離子源溫度110 ℃，樣品錐孔電壓30V，錐孔氣體積流量50 L/h，氮氣脫氣溫度350 ℃，脫氣體積流量800 L/h，掃描范圍m/z50～2000，內參校準液亮氨酸腦啡肽用于分子量實時校正。

2.5 數(shù)據(jù)庫的建立

針對痹祺膠囊是含有10味中藥的復方，成分復雜，通過查閱數(shù)據(jù)庫的文獻，針對全方及各單味藥的化學成分進行了總結，將各單味藥的成分進行匯總，包括分子式、分子結構式、相對分子質量、分子離子、藥材來源、中英文名稱等。建立1個專屬于痹祺膠囊的數(shù)據(jù)庫，對UPLC-Q/TOF-MS采集的數(shù)據(jù)進行對比分析，快速鑒定出已知化合物。

3 結果

采用“2.3”“2.4”項的UPLC-Q/TOF-MS條件，對痹祺膠囊、大鼠空白血漿及給藥血漿樣品進行檢測分析。正、負離子模式下，痹祺膠囊制劑、大鼠空白血漿和給藥大鼠血漿樣品的基峰色譜圖（BPI）如圖1、2所示。

圖1 正離子模式下BPI色譜圖Fig.1 BPI chromatogram in positive ion mode

圖2 負離子模式下BPI色譜圖Fig.2 BPI chromatogram in negative ion mode

在痹祺膠囊樣品中共鑒定出280個化學成分，其中來源于馬錢子的有17個、黨參的有7個、白術的有11個、茯苓的有21個、丹參的有53個、三七的有41個、川芎的有39個、牛膝的有22個、地龍的有17個及甘草的有59個。UPLC-Q/TOF-MS數(shù)據(jù)見表1，TOF-MS的測得值與理論值比較，精確質量數(shù)的誤差均小于1×10-5。在已鑒定的化合物中，22個經與對照品比對保留時間、質譜數(shù)據(jù)，得到進一步確證。

馬錢子中的主要有效成分是生物堿類化合物[5-6]，以馬錢子堿與士的寧為例，馬錢子堿的準分子離子 [M＋H]+m/z395.19容易丟失C4H9N，產生m/z324.12的碎片離子，或連續(xù)丟失C2H4與NH3，分別產生m/z367.16和m/z350.13的碎片離子。士的寧的準分子離子為 [M＋H]+m/z335.17，丟失C2H4產生m/z307.14的碎片離子，繼續(xù)丟失C2H5N與C5H4O而分別產生m/z264.10和m/z184.07的碎片離子。裂解途徑見圖3和4。

表1 痹祺膠囊LC-MS數(shù)據(jù)Table 1 LC-MS data of Biqi Capsule

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

炔苷是黨參中主要的化學成分[7-8]，在質譜中形成 [M＋HCOO]-m/z441.179 3的準分子離子，丟失糖基后形成m/z215.10的碎片離子，繼續(xù)丟失末尾的CH2O，產生m/z185.09的碎片離子，或是丟失炔基側的長鏈和糖基，產生m/z143.07的碎片離子，再丟失H2O形成m/z125.06的碎片離子。裂解途徑見圖5。

白術內酯III是白術的活性成分[9-10]，在質譜中顯示 [M＋H]+m/z249.145 7的準分子離子，丟失H2O形成m/z231.13的碎片離子，分別發(fā)生完全或不完全環(huán)斷裂，產生m/z163.07和m/z189.09的碎片離子，在發(fā)生內酯環(huán)上酯鍵斷裂，產生m/z203.14和m/z119.08的碎片離子。裂解途徑見圖6。

圖3 馬錢子堿質譜裂解途徑Fig.3 Fragmentation pathways of brucine by mass spectrometry

圖4 士的寧質譜裂解途徑Fig.4 Fragmentation pathways of strychnine by mass spectrometry

圖5 黨參炔苷質譜裂解途徑Fig.5 Fragmentation pathways of lobetyolin by mass spectrometry

圖6 白術內酯III質譜裂解途徑Fig.6 Fragmentation pathways of atractylodes III by mass spectrometry

茯苓酸是茯苓的特征性成分[11-12]，在質譜中顯示 [M－H]-m/z527.37的準分子離子，易脫去H2O與CO2形成m/z465.33的碎片離子，進一步失去CH3COOH形成m/z405.31的碎片離子。裂解途徑見圖7。

丹參的化學成分主要包括二萜醌類和丹酚酸類成分[13-16]。丹參酮IIA在質譜中分子離子 [M＋H]+m/z295.13連續(xù)丟失H2O和CO形成m/z277.12和m/z249.12的碎片離子，再分別裂解失去CH3產生m/z262.09和m/z234.10的碎片離子。丹酚酸B的準分子離子 [M－H]-m/z717.14丟失丹參素，產生m/z519.09的碎片離子，丟失咖啡酸與丹參素，產生m/z339.05的碎片離子。此外，還容易丟失H2O、CO2及CO等產生一系列碎片離子。裂解途徑見圖8和9。

圖7 茯苓酸質譜裂解途徑Fig.7 Fragmentation pathways of pachymic acid by mass spectrometry

圖8 丹參酮IIA質譜裂解途徑Fig.8 Fragmentation pathways of tanshinone IIA by mass spectrometry

圖9 丹酚酸B質譜裂解途徑Fig.9 Fragmentation pathways of salvianolic acid B by mass spectrometry

三七含有大量皂苷類成分，以三七皂苷R1為例[17]，準分子離子 [M－H]-m/z931.52脫去木糖產生[M－H－xyl]-m/z799.48的碎片離子，再連續(xù)脫去葡萄糖分別產生 [M－H－xyl－glc]-m/z637.42、[M－H－xyl－glc－glc]-m/z475.37的碎片離子。裂解方式見圖10。

川芎的化學成分分為2大類，有機酸類和苯酞類成分[18-19]。以阿魏酸為例，準分子離子為 [MH]-m/z193.050 1，易于丟失甲基形成m/z178.02的碎片離子，發(fā)生羧基斷裂丟失CO2形成m/z134.03和m/z149.05的特征碎片離子。藁本內酯是川芎中含量較高的苯酞類成分，準分子離子 [M＋H]+m/z191.106 4丟失H2O、CO后，形成m/z173.09和m/z145.10的碎片離子，進而丟失側鏈上的C2H4，形成m/z117.06的碎片離子。裂解方式見圖11和12。

牛膝中主要含有以齊墩果酸為苷元的皂苷類成分[20-21]，以牛膝皂苷C為例，在質譜中顯示 [MH]-m/z953.440 2的準分子離子，丟失3位糖基末尾上的支鏈，形成m/z835.44的碎片離子，分別丟失28位的葡萄糖或者繼續(xù)丟失3位糖基上的支鏈，產生m/z793.43和m/z673.39的碎片離子，最終產生m/z455.35的齊墩果酸母核的特征碎片離子。此外，甾酮類成分是牛膝中另一類活性成分，結構類型主要為四環(huán)三萜類。以蛻皮甾酮為例，在質譜中顯示 [M＋HCOO]-m/z525.308 1的準分子離子，其 [MH]-m/z479.30丟失20位的側鏈，形成m/z319.19的碎片離子，失去H2O后產生m/z301.01的碎片離子。裂解方式見圖13和14。

圖10 三七皂苷R1質譜裂解途徑Fig.10 Fragmentation pathways of notoginsenoside R1 by mass spectrometry

圖11 阿魏酸質譜裂解方式Fig.11 Fragmentation pathways of ferulic acid by mass spectrometry

圖12 藁本內酯質譜裂解方式Fig.12 Fragmentation pathways of ligustilide by mass spectrometry

圖13 牛膝皂苷C質譜裂解途徑Fig.13 Fragmentation pathways of achyranthoside C by mass spectrometry

圖14 蛻皮甾酮質譜裂解途徑Fig.14 Fragmentation pathways of ecdysterone by mass spectrometry

甘草中黃酮類成分種類豐富，包括查耳酮類、二氫黃酮類黃酮及黃酮醇類等，多以糖苷形成出現(xiàn)[22-24]。以甘草苷為例，在質譜中顯示 [M－H]-m/z417.118 6的準分子離子，二級譜圖中主要出現(xiàn)脫去葡萄糖基的碎片離子m/z255.06，C環(huán)上發(fā)生RDA裂解得到的m/z135.01的特征碎片，進一步丟失O形成m/z119.08的碎片離子。三萜類成分是甘草化學成分的重要組成部分，主要為甘草酸類衍生物，以甘草酸為例，在質譜中顯示 [M＋H]+m/z823.411 4的準分子離子，易脫去葡萄糖醛酸得到m/z647.38的碎片離子，失去2個葡萄糖醛酸得到m/z471.34的碎片離子，再進一步失去H2O，得到m/z453.33碎片離子。裂解方式見圖15和16。

通過比對分析痹祺膠囊制劑、血漿樣品的數(shù)據(jù)，同時存在于痹祺膠囊制劑與給藥血漿樣品中的離子，被認為是潛在的以原型形式吸收的藥物成分。結合痹祺膠囊制劑所含化學成分研究結果，分析質譜裂解規(guī)律，在給予痹祺膠囊的大鼠血漿中共鑒定得到59個吸收原型成分，通過篩選僅在給藥血漿樣品中出現(xiàn)的離子信號，最終在大鼠血漿中共鑒定得到22個代謝物，代謝途徑主要為還原、羥基化、甲基化、葡萄糖醛酸結合和硫酸酯共價結合。其UPLC-Q/TOF-MS數(shù)據(jù)見表2。以M1、M2、M13等為例說明代謝物解析過程。

圖15 甘草苷質譜裂解途徑Fig.15 Fragmentation pathways of liquiritin by mass spectrometry

圖16 甘草酸質譜裂解途徑Fig.16 Fragmentation pathways of glycyrrhizic acid by mass spectrometry

M1在質譜圖中顯示出準分子離子 [M＋H]+m/z351.171 5，確定分子式為C21H22N2O3，比士的 寧的準分子離子多16（O），二級質譜中可見m/z184.07和m/z156.07的碎片離子，與士的寧的裂解方式相同，推測M1為士的寧的羥基化代謝產物。

M2的保留時間為5.52 min，在質譜中顯示準分子離子為 [M－H]-m/z273.006 9，確定分子式為C10H10O7S，碎片離子m/z193.05為m/z273.006 9丟失SO3而形成，且與阿魏酸準分子離子相同，提示可能經過硫酸酯結合代謝途徑，碎片離子m/z178.02、m/z160.08與阿魏酸質譜信息一致，初步鑒定M2為阿魏酸的硫酸酯結合物。

M13在質譜圖中顯示出準分子離子 [M－H]-m/z207.101 6，確定分子式為C12H16O3，比6,7-環(huán)氧藁本內酯的準分子離子多2（H2），二級質譜中可見m/z205.08和m/z163.11的碎片離子，推測M13為6,7-環(huán)氧藁本內酯的還原產物。M4、M5的保留時間分別為8.83 min和9.11 min，在質譜中顯示準分子離子為 [M＋H]+m/z433.11，確定分子式為C21H20O10，比甘草素的準分子離子多176，提示可能經過葡萄糖醛酸結合代謝途徑，并且二級質譜中可見m/z257.08和m/z137.02的碎片離子，這與甘草素的質譜信息相同，推測M4、M5為甘草素的葡萄糖醛酸結合物。

4 討論

中藥經歷現(xiàn)代制藥工藝過程的物質傳遞與化學變化，最終以復方制劑的形式通過藥物體內傳輸發(fā)揮臨床療效，其功效是化學物質基礎經過質量傳遞和代謝轉化后生物效應的綜合體現(xiàn)。因此，從中藥的有效性角度認識和評價其質量，必須明確“藥材成分組-制劑成分組-血行成分組”的傳遞-轉化過程，能為中藥藥效物質基礎的傳遞過程提供清晰的路徑，是質量標志物發(fā)現(xiàn)及確定的重要依據(jù)[17]。

本實驗運用UPLC-Q/TOF-MS技術方法，優(yōu)化液相色譜、質譜分離檢測條件，分析痹祺膠囊所含化學成分，經與對照品和文獻數(shù)據(jù)比對，分析其質譜裂解規(guī)律，在痹祺膠囊樣品溶液中共鑒定得到280個化學成分，化合物種類復雜多樣，通過與原料藥材指紋譜比較，分析制劑化學成分歸屬，來源于馬錢子粉的17個主要為生物堿類成分、黨參的7個主要為炔苷類和脂肪酸類成分、白術的11個主要為內酯類成分、茯苓的21個主要為三萜酸類成分、丹參的53個主要為丹酚酸類和二萜醌類成分、三七的41個主要為皂苷類成分、川芎的39個主要為酚酸類和苯酞類成分、牛膝的22個主要為三萜皂苷類和甾酮類成分、地龍的17個主要為核苷類和有機酸類成分，以及甘草的59個主要為黃酮類和三萜類成分。

在制劑物質基礎研究的基礎上，進一步建立給藥血漿的血行指紋譜，通過比對痹祺膠囊制劑、大鼠給藥血漿及空白血漿樣品的色譜圖，篩選分析血

表2 痹祺膠囊大鼠血漿原型成分和代謝物LC-MS數(shù)據(jù)Table 2 LC-MS data of prototype components and metabolites of Biqi Capsule in rat plasma

續(xù)表2

中移行的原型藥物成分及代謝物，結果在大鼠血漿中共鑒定得到81個痹祺膠囊相關的外源性化合物，包括59個吸收原型藥物成分和22個代謝產物，代謝途徑主要為羥基化、還原、甲基化、葡萄糖醛酸結合和硫酸酯共價結合，它們可能是復方潛在的真正活性成分并與藥理作用直接相關，為痹祺膠囊的深入分子作用機制研究及全面質量控制奠定了基礎。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突