彭梅梅，郭 爽，陳 琪，王 夢(mèng)，徐 禎，錢怡潔，毛 靖，許金國(guó)，季 德，陸兔林*，毛春芹*

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023

2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210029

黃連湯（Huanglian Decotion，HLD）出自東漢張仲景《傷寒論》，收錄于《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》，全方由黃連、甘草（炙）、干姜、桂枝（去皮）、人參、半夏（洗）、大棗（擘）7味藥組成，主治傷寒胸中有熱、胃中有邪氣、腹中痛、欲嘔吐者[1]。黃連湯具有明顯的特色與優(yōu)勢(shì)，目前仍廣泛應(yīng)用，現(xiàn)代臨床研究表明黃連湯及其加減方常用于治療胃腸疾病及其他疾病等[2-3]。質(zhì)量標(biāo)志物（quality marker，Q-Marker）這一概念最早于2016年由劉昌孝院士[4]提出，旨在解決中藥質(zhì)量控制指標(biāo)與中藥的有效性關(guān)聯(lián)度低、質(zhì)量控制指標(biāo)專屬性差等阻礙中藥質(zhì)量研究與行業(yè)發(fā)展的共性問題[5]。

本研究建立黃連湯基準(zhǔn)樣品特征圖譜，對(duì)共有峰進(jìn)行歸屬分析，明確“飲片-基準(zhǔn)樣品”的內(nèi)在關(guān)聯(lián)，以期形成穩(wěn)定可行的物質(zhì)基準(zhǔn)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)分析黃連湯發(fā)揮臨床療效的潛在Q-Marker，為全面控制和評(píng)價(jià)黃連湯的質(zhì)量提供方法依據(jù)，并為研究黃連湯治療疾病的藥效作用機(jī)制提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀，配備四元泵、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器，2998檢測(cè)器、Empower 3色譜工作站，美國(guó)Waters公司；FA1104型電子分析天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司，d＝0.1 mg；MS105DU型電子分析天平，梅特勒-托利多公司，d＝0.01 mg；Milli-Q Intergral水純化系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司；KQ-500E數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；砂鍋，江西舒雅陶瓷有限公司；電陶爐，中山市愛米生活電器有限公司。

1.2 試藥

對(duì)照品鹽酸小檗堿（批號(hào)110713-201814，質(zhì)量分?jǐn)?shù)86.7%）、鹽酸巴馬汀（批號(hào)110732-201611，質(zhì)量分?jǐn)?shù)86.8%）、鹽酸黃連堿（批號(hào)112026- 201601，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.1%）、甘草苷（批號(hào)111610- 201607，質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.1%）、甘草酸銨（批號(hào)110731- 201720，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.7%）、6-姜辣素（批號(hào)111833- 201806，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%）、桂皮醛（批號(hào)110710- 201217，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.5%）均購自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

磷酸二氫鉀、磷酸，色譜純，上海阿拉丁生化科技有限公司；乙腈，色譜純，默克股份有限公司；甲醇，色譜純，江蘇漢邦科技有限公司；其他試劑均為分析純。

黃連湯原料藥材購自道地產(chǎn)區(qū)或主產(chǎn)區(qū)，每個(gè)藥材不少于3個(gè)產(chǎn)地，總批次不少于15批；藥材基原、藥用部位、產(chǎn)地、采收加工均明確，均經(jīng)過南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳建偉教授鑒定。經(jīng)研究，除黑龍江及吉林通化人參藥材批次不符合規(guī)定外，其余藥材各產(chǎn)地質(zhì)量均符合《中國(guó)藥典》2020年版一部規(guī)定，藥材來源批號(hào)見表1。按照《中國(guó)藥典》2020年版及全國(guó)炮制規(guī)范將藥材炮制成對(duì)應(yīng)飲片，飲片經(jīng)檢測(cè)均符合《中國(guó)藥典》2020年版各飲片規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

按處方量分別稱取黃連41.40 g，甘草（水炙）41.40 g，干姜41.40 g，桂枝41.40 g，人參27.60 g，半夏（湯洗）60.00 g，大棗42.00 g于砂鍋中，加2000 mL水，浸泡60 min，以武火（2200 W）煮沸后，調(diào)節(jié)火力至文火（900 W）保持微沸，煎煮約60 min后，趁熱濾過，濾液放涼后加水調(diào)整體積至1200 mL[1]。

表1 黃連湯藥材來源信息Table 1 Source information of Huanglian Decoction

精密量取上述液體2 mL至10 mL量瓶中，加入甲醇7 mL，加水至刻度，使甲醇濃度為70%，稱定質(zhì)量，超聲30 min，放冷，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取各對(duì)照品適量，加入甲醇配制成分別含鹽酸小檗堿217.28 μg/mL、鹽酸黃連堿113.96 μg/mL、鹽酸巴馬汀103.18 μg/mL、甘草苷104.30 μg/mL、甘草酸單銨鹽173.60 μg/mL、桂皮醛34.30 μg/mL、6-姜辣素62.72 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱為Merck Purospher Star LP RP-18endcapped柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-水（含0.05 mol/L磷酸二氫鉀，磷酸調(diào)節(jié)pH值為3.0）；梯度洗脫：0～7 min，10%～22%乙腈；7～19 min，22%～23.5%乙腈；19～28 min，23.5%～24%乙腈；28～42 min，24%～35%乙腈；42～52 min，35%～63%乙腈；52～54 min，63%～10%乙腈；54～56 min，10%乙腈；體積流量1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣體積10 μL。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次。以穩(wěn)定性好，分離度高的小檗堿（12號(hào)峰）為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD，結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.39%，相對(duì)峰面積RSD＜2.46%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一份黃連湯基準(zhǔn)樣品，按“2.1”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以小檗堿為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD，結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.65%，相對(duì)峰面積RSD＜2.73%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件，分別于制樣后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣。以小檗堿為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD，結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.73%，相對(duì)峰面積RSD＜2.44%，表明樣品24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 基準(zhǔn)樣品特征圖譜建立及相似度評(píng)價(jià)

利用Excel中RANDBETWEEN函數(shù)生成隨機(jī)數(shù)，將黃連、甘草（水炙）、干姜、桂枝、人參、大棗、半夏（湯洗）7味飲片的不同批次隨機(jī)組合，按照“2.1”項(xiàng)下方法制備18批黃連湯基準(zhǔn)樣品（HLD1～HLD18）供試品溶液，并按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，將色譜圖依次導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012A）軟件，以HLD1號(hào)樣品的特征圖譜作為參照?qǐng)D譜，采用中位數(shù)法，進(jìn)行多點(diǎn)校正和色譜峰匹配，得到18批樣品疊加圖及共有模式圖，見圖1、2，確定了17個(gè)共有峰，經(jīng)與化學(xué)對(duì)照品的色譜行為進(jìn)行比較，鑒定出7個(gè)色譜峰，分別為5號(hào)峰甘草苷，10號(hào)峰黃連堿，11號(hào)峰巴馬汀，12號(hào)峰小檗堿，14號(hào)峰桂皮醛，15號(hào)峰甘草酸，17號(hào)峰6-姜辣素。與對(duì)照特征圖譜相比為參照?qǐng)D譜，設(shè)其相似度為1.000，計(jì)算18批黃連湯基準(zhǔn)樣品的相似度，結(jié)果HLD1～HLD18的相似度分別為0.997、0.997、0.998、0.998、0.999、0.997、0.998、0.998、0.996、0.997、0.998、0.996、0.997、0.999、0.996、0.995、0.997、0.994，可見各批次樣品特征圖譜相似度均大于0.95，基準(zhǔn)樣品特征圖譜相似度良好，表明基準(zhǔn)樣品的穩(wěn)定性較好，主要物質(zhì)群差異性小，形成的基準(zhǔn)樣品對(duì)照?qǐng)D譜能夠作為衡量黃連湯制劑的標(biāo)準(zhǔn)參照物。

2.6 基準(zhǔn)樣品共有峰的歸屬研究

按供試品制備方法，分別制備單味飲片供試品溶液、各陰性供試品溶液及黃連湯基準(zhǔn)樣品供試品溶液，照“2.3”項(xiàng)下特征圖譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，分別將7味飲片單味飲片供試品溶液、陰性供試品溶液和基準(zhǔn)樣品供試品溶液色譜圖進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果見圖3?？梢婞S連湯基準(zhǔn)樣品特征圖譜中共有10個(gè)峰來自黃連，3個(gè)峰來自甘草（水炙），1個(gè)峰來自干姜，3個(gè)峰來自桂枝，半夏（湯洗）、大棗、人參在此條件下沒有色譜信息。對(duì)黃連湯基準(zhǔn)樣品各共有峰進(jìn)行歸屬分析，共歸屬17個(gè)共有峰，經(jīng)對(duì)照品指認(rèn)7個(gè)色譜峰信息，指認(rèn)率為41.2%，結(jié)果見表2。其中1～3、6～9、10（黃連堿）、11（巴馬?。?、12（小檗堿）號(hào)峰來源于黃連；4、5（甘草苷）、15（甘草酸）號(hào)峰來源于甘草；13、14（桂皮醛）、16號(hào)峰來源于桂枝；17號(hào)峰（6-姜辣素）來源于干姜；人參、半夏、大棗在此色譜條件下沒有色譜信息，后續(xù)將進(jìn)行進(jìn)一步深入研究。

圖1 18批黃連湯基準(zhǔn)樣品 HPLC特征圖譜疊加圖Fig.1 Overlay of characteristic spectrums of 18 batches of HLD reference samples

圖2 黃連湯基準(zhǔn)樣品對(duì)照特征圖譜 (A) 和混合對(duì)照品 (B) 圖Fig.2 Characteristic spectrum of material reference of HLD (A) and mixed reference substances (B)

圖3 黃連湯基準(zhǔn)樣品色譜峰歸屬Fig.3 Attribution of chromatographic peaks of HLD reference samples

表2 黃連湯基準(zhǔn)樣品共有峰歸屬情況Table 2 Attribution of common peaks of HLD reference samples

各味藥材飲片特征圖譜中主要物質(zhì)群可以從飲片-基準(zhǔn)樣品較為完整地傳遞，且物質(zhì)群的歸屬關(guān)系清晰，說明黃連湯基準(zhǔn)樣品的物質(zhì)群可清晰的追溯到飲片，且色譜峰歸屬明確，指認(rèn)率較高。

2.7 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的黃連湯功效關(guān)聯(lián)物質(zhì)預(yù)測(cè)分析

2.7.1 基于可測(cè)性及可溯性的活性成分篩選 根據(jù)文獻(xiàn)研究，黃連為黃連湯君藥，其主要活性成分為生物堿類成分[6]，包含小檗堿、巴馬汀、黃連堿、非洲防己堿等，具有抗菌、降糖調(diào)脂、抗腫瘤、抗胃潰瘍等藥理作用[7-8]；甘草的主要活性成分為三萜類和黃酮類，甘草苷有清熱解毒的功效，甘草酸有抗炎鎮(zhèn)咳、免疫調(diào)節(jié)的作用[9]；干姜的主要有效成分為姜辣素類，具有止嘔等藥理作用[10]；桂枝的主要有效成分為揮發(fā)油類，具有抗菌抗炎、抗病毒等藥理作用[11]；人參的主要有效成分為多糖類、皂苷類，具有強(qiáng)心抗休克、抗心肌缺血等藥理作用[12]；半夏主要有效成分為生物堿類及有機(jī)酸類；大棗的有效成分為多糖類。

藥典標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下對(duì)于組方藥的控制主要為黃連的黃連堿、巴馬汀、小檗堿、表小檗堿，甘草的甘草苷及甘草酸，干姜的6-姜辣素，桂枝的桂皮醛，人參的人參皂苷Rg1、Re、Rb1?；谖墨I(xiàn)研究結(jié)合指紋圖譜及特征圖譜的可測(cè)性及可溯性，確定特征圖譜所指認(rèn)的黃連堿、巴馬汀、小檗堿、甘草苷、甘草酸、6-姜辣素、桂皮醛7個(gè)活性成分為候選化合物。通過Pubchem Compound化合物數(shù)據(jù)庫（https:// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取7個(gè)候選化合物的Canonical SMILES編號(hào)，為后續(xù)黃連湯“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建做準(zhǔn)備。

2.7.2 黃連湯活性靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 將7個(gè)成分的Canonical SMILES輸入swiss target prediction數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，并結(jié)合中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP，https://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），獲得7個(gè)化合物共涉及286個(gè)作用靶點(diǎn)蛋白，為相關(guān)通路的預(yù)測(cè)做準(zhǔn)備。

將篩選出的286個(gè)靶點(diǎn)，導(dǎo)入在線STRING 11.0分析數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org），選擇物種為“Homo sapiens”，選取最高置信度蛋白交互參數(shù)評(píng)分值＞0.9的蛋白互作數(shù)據(jù)，篩選到229個(gè)靶點(diǎn)，將結(jié)果以TSV文本格式導(dǎo)入Cytoscape 3.8.1軟件，并利用Cytoscape 3.8.1軟件中的“Network Analyzer”功能對(duì)蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?，?jì)算選取介數(shù)中心性（betweenness centrality）、接近中心性（closeness centrality）和度值（degree）3個(gè)重要拓?fù)鋮?shù)均大于中位數(shù)且度值≥16的靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)，經(jīng)篩選得到30個(gè)核心靶點(diǎn)，結(jié)果見圖4，圖中節(jié)點(diǎn)大小與度值成正比關(guān)系。其中度值最高的磷脂酰肌醇3-激酶催化亞基α（phosphatidylinositol 3′-kinase catalytic subunit α，PIK3CA）能與57個(gè)蛋白發(fā)生相互作用。

2.7.3 黃連湯活性成分富集分析 利用R軟件對(duì)黃連湯的30個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書（Kyotoencyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。背景數(shù)據(jù)庫和基因集限定物種為“Homo sapiens”，閾值設(shè)置為P＜0.05。前20條GO分析結(jié)果如圖5所示，主要涉及聚合酶II特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（RNA polymerase II-specific DNA- binding transcription factor binding）、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（DNA-binding transcription factor binding）、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性（protein serine/ threonine kinase activity）等過程。KEGG分析共得到139條具有顯著意義的通路，前20條與黃連湯相關(guān)度較高的通路如圖6所示，主要包括炎癥、感染、癌癥等。

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.4 PPI network

圖5 GO富集分析的生物過程條目氣泡圖Fig.5 Entry bubble diagram of biological process by GO enrichment analysis

圖6 核心靶點(diǎn)的KEGG分析Fig.6 KEGG analysis of core targets

圖7 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)Fig.7 “Component-target-pathway” network

2.7.4 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 將篩選到的黃連湯中的7個(gè)活性成分、30個(gè)核心靶點(diǎn)、排名前20條信號(hào)通路運(yùn)用Cytoscape 3.8.1軟件構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，見圖7。由網(wǎng)絡(luò)圖可以看 出，黃連湯中7個(gè)活性成分通過作用于多靶點(diǎn)在不同的信號(hào)通路中發(fā)揮作用，且成分、靶點(diǎn)、通路間存在錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系，黃連中的黃連堿、巴馬汀、小檗堿具有抗炎、抑菌功效，促使萎縮胃黏膜修復(fù)；桂枝中的桂皮醛及干姜中的萜類化合物抗氧化活性明顯能促使胃黏膜損傷程度減輕；干姜醇提取物、甘草中的甘草苷和甘草酸、半夏水煎醇沉液均可經(jīng)不同機(jī)制對(duì)胃黏膜幽門螺旋桿菌感染進(jìn)行抑制，具有良好的抗?jié)冏饔?；大棗多糖能促使胃腸道功能得到改善；顯示了中藥復(fù)方治療疾病作用機(jī)制的復(fù)雜性。

2.7.5 Q-Marker的分析 黃連湯主治上熱下寒諸癥，現(xiàn)代臨床主要治療胃腸道疾病?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)黃連湯可通過抗炎、調(diào)節(jié)胃腸蠕動(dòng)和調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)等多個(gè)方面改善胃腸道疾病，臨床療效顯著[13]。GO分析結(jié)果顯示，黃連湯對(duì)蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，非跨膜蛋白酪氨酸激酶活性以及G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合等途徑具有廣泛調(diào)節(jié)作用。KEGG分析結(jié)果表明，黃連湯主要對(duì)感染、炎癥及癌癥等相關(guān)信號(hào)通路起調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，原癌基因肉瘤基因（sarcoma gene，SRC）表達(dá)活性增強(qiáng)及PIK3CA突變可能導(dǎo)致結(jié)腸癌，SRC能激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT）和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（research of phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）等多條信號(hào)通路，其中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄激活物（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）可通過介導(dǎo)炎癥，介質(zhì)的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞等生物學(xué)行為，促進(jìn)腫瘤發(fā)生及相關(guān)炎癥的形成[14]，PI3K/Akt信號(hào)通路通過對(duì)自噬產(chǎn)生負(fù)調(diào)控作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和存活[15]。另有研究表明，糖脂代謝紊亂利于幽門螺旋桿菌感染和繁殖[16]，且可通過引起神經(jīng)病變和微循環(huán)障礙導(dǎo)致胃蠕動(dòng)障礙和胃黏膜萎縮[17]，其通過調(diào)節(jié)AGE-RAGE信號(hào)通路、耶爾森菌感染、巨噬細(xì)胞病毒感染等通路抑制病毒感染與繁殖。趨化因子與相關(guān)受體結(jié)合吸引白細(xì)胞移行到感染部位，在炎癥反應(yīng)中具有重要作用，已有研究證實(shí)趨化因子10和28，趨化因子受體4和6在慢性胃炎的胃黏膜組織中均高表達(dá)，另有研究表明T細(xì)胞受體信號(hào)通路在識(shí)別特異性抗原、激活T細(xì)胞、確保調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能方面具有重要作用。此外，腫瘤的發(fā)生與發(fā)展與炎癥微環(huán)境密切相關(guān)，慢性炎癥可能是介導(dǎo)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[18]，白細(xì)胞介素 2（interlenkin-2，IL-2）作為銜接炎癥與腫瘤的炎癥因子，與實(shí)質(zhì)受體結(jié)合為酪氨酸磷酸激酶，從而啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶介導(dǎo)的磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致STAT3磷酸化水平上調(diào)。

綜上所述，黃連湯通過7味藥間不同活性成分的協(xié)同作用，可能從以下方面發(fā)揮治療胃腸道疾病作用：下調(diào)SRC蛋白表達(dá)水平，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖；調(diào)節(jié)IL-2炎癥因子表達(dá)，抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶介導(dǎo)的磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)；下調(diào)STAT3磷酸化水平，抑制腫瘤相關(guān)炎癥形成；抑制PI3K/Akt信號(hào)通路活化，促進(jìn)細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡，降低促炎癥因子IL2釋放?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果與已有文獻(xiàn)結(jié)果較為接近，表明該方法具有一定的準(zhǔn)確性，同時(shí)契合中藥整體觀、系統(tǒng)性的理念，為進(jìn)一步闡明黃連湯物質(zhì)基礎(chǔ)及治療胃腸道疾病機(jī)制提供了參考。

由此可見，黃連湯中關(guān)鍵效應(yīng)成分可作用于多靶點(diǎn)，干預(yù)多個(gè)通路達(dá)到與臨床治療胃腸道疾病一致的療效，進(jìn)一步表明特征圖譜所選指標(biāo)成分的合理性。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從理論上證明了其有效性，結(jié)合前文及特征圖譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)黃連湯中的Q-Marker進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，黃連堿、巴馬汀、小檗堿、甘草苷、甘草酸、桂皮醛、6-姜辣素這7個(gè)成分基本符合Q-Marker的五原則，故預(yù)測(cè)其為黃連湯潛在的Q-Marker。

3 討論

中藥和復(fù)方制劑成分復(fù)雜，本研究以特征圖譜為指標(biāo)，考察飲片-基準(zhǔn)樣品的相關(guān)性及傳遞性。特征圖譜結(jié)果顯示主要物質(zhì)群可以從飲片-基準(zhǔn)樣品逐級(jí)較為完整地傳遞，且歸屬關(guān)系清晰。從色譜峰個(gè)數(shù)和峰強(qiáng)度進(jìn)行分析，黃連、桂枝與甘草對(duì)特征圖譜的貢獻(xiàn)最大；其次為干姜，其主要成分為揮發(fā)油，在本特征圖譜條件下可檢出1個(gè)色譜峰；半夏主要含淀粉和氨基酸、大棗主要含多糖和氨基酸，這幾類成分水溶性大，含量低，且不具備HPLC-UV檢測(cè)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，致使它們?cè)诖松V條件下不能檢出。方中人參主要含皂苷類物質(zhì)，為末端吸收，且該類成分不穩(wěn)定，在此色譜條件下未能檢測(cè)，建議對(duì)人參單獨(dú)建立特征圖譜[19]。

中藥質(zhì)量是中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的生命線，中藥質(zhì)量研究方面存在的諸多問題將制約中藥產(chǎn)業(yè)的健康與可持續(xù)發(fā)展[20]。Q-Marker的建立有利于中藥全程質(zhì)量控制及質(zhì)量溯源，是中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制的指標(biāo)?；谔卣鲌D譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，黃連湯中黃連堿、巴馬汀、小檗堿、甘草苷、甘草酸、桂皮醛、6-姜辣素7個(gè)成分均具有傳遞性和溯源性，且與功能屬性密切相關(guān)，可初步預(yù)測(cè)其為黃連湯的潛在Q- Marker。

本研究基于中藥化學(xué)與中藥藥理學(xué)，整合多學(xué)科技術(shù)方法，基于可測(cè)性、可追溯性、有效性開展黃連湯功效關(guān)聯(lián)物質(zhì)的系統(tǒng)辨識(shí)與確認(rèn)，為后期深入研究黃連湯的作用機(jī)制提供借鑒，也為黃連湯的質(zhì)量控制提供了更全面的參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突