楊建波，高慧宇，王雪婷，宋云飛，段寶忠，程顯隆，魏 鋒*，王 瑩，汪 祺，胡笑文，馬雙成*

1.中國(guó)食品藥品檢定研究院 中藥民族藥檢定所，北京 100050

2.大理大學(xué)藥學(xué)院，云南 大理 671000

何首烏為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorumThunb.的干燥塊根，生何首烏味苦、甘、澀，微溫，歸肝、心、腎經(jīng)，具有解毒、消癰、截瘧、潤(rùn)腸通便等功效，可用于瘡癰、風(fēng)疹瘙癢和潤(rùn)腸通便等[1]，主要分布于我國(guó)貴州、四川、云南、安徽和廣東等地，其中廣東肇慶市德慶縣為傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)[2-3]。何首烏被廣泛應(yīng)用于處方藥、非處方藥和保健食品中，含有何首烏的藥品約有500余種、保健食品約有200余種[4]。然而，近年來，國(guó)內(nèi)外關(guān)于服用何首烏及其相關(guān)制劑引發(fā)的不良反應(yīng)，尤其肝損傷的不良反應(yīng)報(bào)道較多，其安全性問題已經(jīng)引起國(guó)內(nèi)外高度關(guān)注[5-6]。

目前，從何首烏中提取分離得到約200個(gè)單體化合物，主要為蒽醌（單核蒽醌和雙核蒽醌）類、二苯乙烯類、萘類、黃酮類和其他類成分[7-13]，其中雙核蒽醌為本課題組首次從何首烏中分離得到，主要有polygonumnolide A1～A4、polygonumnolide B1～B3[9]、polygonumnolide C1～C4[10]、polygonumnolide E[11]、順式-大黃素二蒽酮和反式-大黃素二蒽酮[13]。何首烏中潛在的肝毒性成分，可能為蒽醌類（包括大黃素等單核蒽醌和大黃素二蒽酮等雙核蒽醌）、二苯乙烯苷類和沒食子酸類等成分[5,14-16]。其中關(guān)于何首烏中二蒽酮成分為其潛在肝毒性成分，為本項(xiàng)目組首次報(bào)道。所以，一方面為了進(jìn)一步豐富何首烏中的化學(xué)成分種類；另一方面，也為了繼續(xù)尋找何首烏中潛在的肝毒性成分。本課題組繼續(xù)對(duì)何首烏70%乙醇提取部分進(jìn)行化學(xué)成分研究，分離得到8個(gè)化合物，分別鑒定為(E)-2- (4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-[N-2-(4-hydroxyphenyl) ethyl]carbamoyl-5-[N-2-(4-hydroxyphenyl)ethyl] carbamoylethenyl-7-methoxybenzofuran（1）、cannabisin D（2）、grossamide（3）、eleutherinol（4）、isolariciresinol（5）和N,N-二甲基-色氨酸甲酯（N,N-dimethyl-tryptophan methyl ester，6）、N-反式-阿魏酰酪胺（N-trans-feruloyltyramine，7）和N-反式阿魏酰-3-甲氧基酪胺（N-trans-feruloyl-3-methyl dopamine，8）。其中，化合物1為新的木脂素酰胺類化合物，命名為何首烏庚素?；衔?～6均為首次從該藥材中分離得到，并通過二維核磁譜補(bǔ)充了化合物4和6的核磁數(shù)據(jù)。化合物1對(duì)正常人L02肝細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用。

1 儀器與材料

島津UV-2700型紫外可見分光光度計(jì)（日本島津儀器有限公司）；IM-PACT400型傅里葉變換紅外光譜儀（美國(guó)尼高力公司）；布魯克Avance-500和600型核磁共振波譜儀（德國(guó)布魯克公司）；安捷倫HP1200高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；島津LC-6AD型制備高效液相色譜儀（日本島津公司）；C18反相填料（日本YMC公司）；MCI GEL CHP20P填料（日本三菱化學(xué)公司）；EYELASB-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本EYELA公司）；DM-8型大孔吸收樹脂（津達(dá)正源化工）；酶標(biāo)儀（Bio-Tek）；二氧化碳培養(yǎng)箱（Bio-Tek）；QUINTIX313-1CN型萬分之一電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；正常人L02肝細(xì)胞，上海陶術(shù)生物科技有限公司；高糖DMEM培養(yǎng)基（貨號(hào)06-1055-57-1ACS，BI公司）、RPMI1640（貨號(hào)01-100-1ACS，BI公司）、FBS（貨號(hào)FB-1058/500，Biosera公司）、CCK-8試劑盒（貨號(hào)C0005，上海陶素生化科技有限公司）；0.25%胰酶- EDTA（貨號(hào)325-043-CL，維森特生物技術(shù)公司）；常規(guī)試劑為分析純，高效液相用試劑為色譜純。

實(shí)驗(yàn)用何首烏樣品于2013年10月采集于廣東省肇慶市德慶縣，經(jīng)中國(guó)食品藥品檢定研究院張繼副研究員鑒定為何首烏P.multiflorumThunb.的干燥塊根，樣品標(biāo)本（No.060104）保存于中國(guó)食品藥品檢定研究院。

2 提取與分離

取何首烏干燥塊根28 kg，粉碎，用70%乙醇加熱回流提取3次，每次2 h，提取液減壓回收溶劑得浸膏4.0 kg。將浸膏于1.5 L水中混懸，用二氯甲烷萃取，剩余水部分，再加水稀釋至10 L，過DM-8型大孔吸附樹脂，依次用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇洗脫，得到5個(gè)不同組分，分別為水洗脫部分（組分A，2.0 kg）、25%乙醇（組分B，62.0 g）、40%乙醇（組分C，200.0 g）、55%乙醇（組分D，38.0 g）和95%乙醇洗脫部分（組分E，55.0 g）。組分B（62.0 g）經(jīng)ODS中壓柱色譜，依此用10%～100%甲醇洗脫，再經(jīng)過反相硅膠薄層色譜檢測(cè)、合并，共獲得20個(gè)亞組分，分別為B1～B20。其中亞組分B2（3.5 g），經(jīng)過半制備液相分離純化，流動(dòng)相 [乙腈-水（35∶65）]，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，體積流量為5.0 mL/min，得到化合物7（tR＝28 min，29.0 mg）、8（tR＝34 min，7.5 mg）。其中亞組分B5（5.0 g），經(jīng)過半制備液相分離純化，流動(dòng)相[甲醇-水（32∶68），檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，體積流量為5.0 mL/min，得到化合物5（tR＝33.0 min，3.0 mg）、6（tR＝41.0 min，3.5 mg）。組分B10（6.5 g），用水溶解，過MCI樹脂，依此用不同濃度甲醇洗脫，得到5個(gè)不同組分，依此為水洗脫部分（組分B10A）、30%甲醇（組分B10B）、50%甲醇（組分B10C）、70%甲醇（組分B10D）和100%甲醇洗脫（組分B10E）。組分B10B，經(jīng)過半制備液相分離純化，流動(dòng)相 [乙腈-水（30∶70）]，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，體積流量為5.0 mL/min，得到化合物2（tR＝32.0 min，2.5 mg）和3（tR＝39.0 min，3.0 mg）。組分B10C，經(jīng)過半制備液相分離純化，流動(dòng)相 [乙腈-水（40∶60）]，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，體積流量為5.0 mL/min，得到化合物1（tR＝35.0 min，4.0 mg）和4（tR＝43.0 min，3.0 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：淡黃色無定形粉末。HR-ESI-MS顯示準(zhǔn)分子離子峰m/z: 623.237 9 [M＋H]+（計(jì)算值623.238 8），提示該化合物分子式為C36H34N2O8，不飽和度為21。UV光譜顯示其在224、252、310 nm處有最大吸收；IR光譜在3459、1657、1609、1538 cm-1有吸收峰，提示其含有羥基和酰胺基[12]。

1H-NMR（表1）和1H-1H COSY譜（圖1）中顯示該化合物含有2個(gè)酰胺基 [δH8.10 (t,J= 4.8 Hz,α-NH),3.37 (2H,m,H-8′′),2.67 (2H,t,J= 7.2 Hz,H-7′′); 8.50 (t,J= 4.8 Hz,β-NH),3.49 (2H,m,H-8′′′),2.77 (2H,t,J= 7.2 Hz,H-7′′′)]；2組AA′BB′偶合系統(tǒng)的芳香氫信號(hào) [δH7.03 (2H,d,J= 8.4 Hz,H-2′′/6′′),6.69 (2H,d,J= 8.4 Hz,H-3′′/5′′); 7.06 (2H,d,J= 8.4 Hz,H-2′′′/6′′′),6.89 (2H,d,J= 8.4 Hz,H-3′′′/5′′′)]；1組ABX偶合系統(tǒng)的芳香氫信號(hào) [δH7.46 (1H,d,J= 1.8 Hz,H-2′),7.31 (1H,dd,J= 8.4,1.8 Hz,H-6′),6.89 (1H,d,J= 8.4 Hz,H-5′) ]；1組AX偶合系統(tǒng)的芳香氫信號(hào) [δH7.17 (1H,s,H-2),7.24 (1H,s,H-6)]；1組反式雙鍵 [δH7.49 (1H,d,J= 15.6 Hz,H-7)，6.64 (1H,d,J= 15.6 Hz,H-8)] 和2個(gè)甲氧基 [δH4.01 (3H,s,Me-3)，3.81 (3H,s,Me-3′)]。化合物1的13C-NMR、HSQC以及DEPT數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)有36個(gè)碳信號(hào)，其中15個(gè)季碳，包括2個(gè)羰基信號(hào) [δC165.0(C-9),163.1(C-9′)]；4個(gè)亞甲基信號(hào)，包括2組AX偶合系統(tǒng)的脂肪族亞甲基的碳信號(hào) [δC34.4 (C-7′′) 和40.7 (C-8′′)；34.1 (C-7′′′) 和40.9 (C-8′′′)]；15個(gè)次甲基信號(hào)，包括2組AA′BB′偶合系統(tǒng)的芳香環(huán)上的碳信號(hào) [δC115.1 (C-3′′/5′′) 和129.5 (C-2′′/6′′)；115.2 (C-3′′′/5′′′) 和129.5 (C-2′′′/6′′′)]；1組ABX偶合系統(tǒng)的芳香環(huán)上的碳信號(hào)δC110.7 (C-2′),115.8 (C-5′),120.5 (C-6′)；1組AX偶合系統(tǒng)的芳香環(huán)上的碳信號(hào)δC106.2 (C-2),112.1 (C-6) 和1組反式雙鍵的碳信號(hào)δC138.9 (C-7),121.6 (C-8) 以及2個(gè)甲氧基碳信號(hào)δC55.9 (C-3),55.6 (C-3′)。

表1 化合物1的氫譜和碳譜數(shù)據(jù) (600/150 MHz,DMSO-d6)Table 1 1H and 13C-NMR spectral data of compound 1 (600/150 MHz,DMSO-d6)

圖1 化合物1的結(jié)構(gòu)和1H-1H COSY、HMBC圖譜Fig.1 Structure and 1H-1H COSY,HMBC correlations of compound 1

在HMBC圖譜中（圖1），δH7.31 (H-6′) 與δC147.6 (C-7′) 相關(guān)，δH6.89 (H-5′) 與δC148.4 (C-3′)相關(guān)，說明化合物1的A′苯環(huán)中C-1′位連接在C環(huán)的C-7′位。δH3.49 (H-8′′′) 與δC163.1 (C-9′)，129.7 (C-1′′′) 相關(guān)，δH2.77 (H-7′′′) 與δC115.2 (C-3′′′) 相關(guān)，說明化合物1的B′苯環(huán)中C-1′′′位連接在C-7′′′位，C-9′連接在C環(huán)的C-8′位。δH7.17 (H-2) 與δC142.2 (C-4) 相關(guān)，δH7.24 (H-6) 與δC120.0 (C-8′)相關(guān)，δH7.49 (H-7) 與δC112.1 (C-6)，165.0(C-9)相關(guān)，δH6.64 (H-8) 與δC131.6 (C-1) 相關(guān)，說明C-7為連接在A環(huán)的C-1位，C-9連接在C環(huán)的C-8位。δH3.37 (H-8′′) 與δC165.0 (C-9)，129.7 (C-1′′) 相關(guān)，δH2.67 (H-7′′) 與δC115.1 (C-3′′) 相關(guān)，說明化合物1的B苯環(huán)中C-1′′位連接在C-7′′位。δH4.01 (Me-3) 與δC144.7 (C-3) 相關(guān)，δH3.81 (Me-3′) 與δC148.4 (C-3′) 相關(guān)，說明化合物1的B苯環(huán)中C-1′′位連接在C-7′′位。

綜合上述信息，確定化合物1為N-反式-阿魏酰酪胺的二聚體，結(jié)構(gòu)為(E)-2-(4-hydroxy-3- methoxyphenyl)-3-[N-2-(4-hydroxyphenyl)ethyl]carba moyl-5-[N-2-(4-hydroxyphenyl)ethyl]carbamoylethenyl- 7-methoxybenzofuran，為1個(gè)新化合物，命名為何首烏庚素。

化合物2：淡黃色固體粉末。ESI-MSm/z:625.3 [M＋H]+。1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ: 7.23 (1H,s,H-4),6.96 (2H,d,J= 8.4 Hz,H-2′′,6′′),6.84 (1H,s,H-5),6.86 (2H,d,J= 8.4 Hz,H-2′′′,6′′′),6.70 (1H,d,J= 1.8 Hz,H-2′),6.65 (2H,d,J= 8.4 Hz,H-3′′′,5′′′),6.62 (2H,d,J= 8.4 Hz,H-3′′,5′′),6.55 (1H,d,J= 8.4 Hz,H-5′),6.50 (1H,s,H-8),6.25 (1H,dd,J= 8.4,1.8 Hz,H-6′),4.23 (1H,d,J= 2.4 Hz,H-1),3.78 (3H,s,3-OMe),3.68 (3H,s,3′-OMe),3.60 (1H,d,J= 2.4 Hz,H-2),3.24 (2H,m,H-8′′),3.10 (2H,m,H-8′′′),2.61 (2H,t,J= 7.8 Hz,H-7′′),2.43 (2H,t,J= 7.2 Hz,H-7′′′)；13C-NMR (150 MHz,DMSO-d6)δ: 170.9 (C-2a),167.6 (C-3a),155.6 (C-4′′),155.6 (C-4′′′),147.7 (C-6),147.2 (C-3′),146.2 (C-7),145.0 (C-4′),135.0 (C-1′),131.7 (C-4),131.3 (C-8a),129.6 (C-1′′),129.5 (C-1′′′),129.5 (C-2′′),129.5 (C-2′′′),129.5 (C-6′′),129.5 (C-6′′′),126.5 (C-3),122.9 (C-4a),119.6 (C-6′),116.2 (C-5′),115.1 (C-3′′),115.1 (C-3′′′),115.0 (C-5′′),115.0 (C-5′′′),112.1 (C-8),111.8 (C-5),55.7 (3-OMe),55.6 (3′-OMe),47.8 (C-2),41.2 (C-1),40.9 (C-a′),40.4 (C- a),34.3 (C-β),34.3 (C-β′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照[17]，鑒定化合物2為cannabisin D。

化合物3：淡黃色固體粉末。ESI-MSm/z:623.2 [M－H]-；1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ: 7.35 (1H,d,J= 15.6 Hz,H-1′′′′),7.05 (1H,s,H-6),7.01 (2H,d,J= 8.4 Hz,H-2′′′′′,6′′′′′),6.89 (1H,d,J= 1.8 Hz,H-2′),6.79 (1H,d,J= 8.4 Hz,H-5′),6.72 (1H,dd,J= 8.4,1.8 Hz,H-6′),6.78 (2H,d,J= 8.4 Hz,H-3′′′,5′′′),6.73 (2H,d,J= 8.4 Hz,H-2′′′,6′′′),6.69 (2H,d,J= 8.4 Hz,H-3′′′′′′,5′′′′′′),6.46 (2H,d,J= 15.6 Hz,H-2′′′′),6.39 (1H,s,H-4),5.88 (1H,d,J= 8.4 Hz,H-2),4.18 (1H,d,J= 8.4 Hz,H-3),3.91 (3H,s,7-OMe),3.83 (3H,s,3′-OMe),3.66 (2H,m,H-1′′),3.62 (2H,m,H-1′′′′′),2.64 (2H,t,J= 7.8 Hz,H-2′′),2.58 (2H,t,J= 7.8 Hz,H-2′′′′′)；13C-NMR (150 MHz,DMSO-d6)δ: 169.9 (3-CONR),165.7 (2′′′′-CONR),156.1 (C-4′′′′′′),156.1 (C-4′′′),149.2 (C-8),148.1 (C-3′),147.3 (C-4′),144.5 (C-7),141.1 (C-1′′′′),131.1 (C-1′),130.3 (C-1′′′′′′),130.0 (C-2′′′,6′′′),129.9 (C-1′′′),129.8 (C-2′′′′′′,6′′′′′′),129.7 (C-5),129.0 (C-9),119.3 (C-6′),119.0 (C-4),118.8 (C-2′′′′),116.4 (C-3′′′,5′′′),115.6 (C-3′′′′′′,5′′′′′′),115.5 (C-5′),110.8 (C-6),110.4 (C-2′),88.2 (C-2),56.3 (C-3),56.2 (3′-OMe),56.2 (7-OMe),41.3 (C-1′′′′′),41.1 (C-1′′),34.9 (C-2′′′′),34.7 (C-2′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照基本一致[18-19]，故確定化合物3為grossamide。

化合物4：淡黃色固體粉末。ESI-MSm/z:257.0 [M＋H]+；1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ: 7.20 (1H,s,H-4),6.58 (1H,s,H-5),6.57 (1H,s,H-7),6.18 (1H,s,H-12),2.72 (3H,s,3-Me),2.38 (3H,s,13-Me)；以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致[20]，但是未見該化合物的碳譜文獻(xiàn)報(bào)道，通過二維譜對(duì)化合物碳譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了歸屬，具體如下：13C-NMR (150 MHz,DMSO-d6)δ: 178.9 (C-11),163.8 (C-1),163.8 (C-13),159.7(C-6),157.1 (C-8),139.0 (C-10),134.7 (C-3),125.1 (C-4),116.6 (C-2),112.4 (C-12),107.5 (C-9),103.3 (C-7),101.5 (C-5),23.4 (Me-3),19.9 (Me-13)。故鑒定化合物4為eleutherinol。

化合物5：淡黃色固體粉末。ESI-MSm/z:361.2 [M＋H]+；1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ: 6.69 (1H,d,J= 1.8 Hz,H-2),6.75 (1H,d,J= 7.8 Hz,H-5),6.63 (1H,dd,J= 1.8,7.8 Hz,H-6),3.82 (1H,m,H-7),1.78 (1H,m,H-8),3.41 (1H,dd,J= 3.6,10.8 Hz,H-9α),3.68 (1H,dd,J= 5.4,10.8 Hz,H-9β),6.67 (1H,s,H-2′),6.19 (1H,s,H-5′),2.79 (1H,d,J= 7.8 Hz,H-7′),2.02 (1H,m,H-8′),3.66 (1H,dd,J= 4.8,7.8 Hz,H-9′α),3.72 (1H,dd,J= 4.8,10.8 Hz,H-9′β),3.78 (3H,s,3-OMe),3.82 (3H,s,3′-OMe)；13C-NMR (150 MHz,CD3OD)δ: 149.0 (C-3),147.2 (C-3′),146.0 (C-4),145.3 (C-4′),138.6 (C-1),134.2 (C-6′),129.0 (C-1′),123.2 (C-6),117.4 (C-5′),116.0 (C-5),113.8 (C-2),112.4 (C-2′),65.9 (C-9′),62.2 (C-9),56.4 (3′-OMe),56.3 (3-OMe),48.1 (C-7),48.0 (C-8),40.0 (C-8′),33.6 (C-7′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照[21-22]，確定化合物5為isolariciresinol。

化合物6：白色固體粉末。HR-ESI-MSm/z:247.143 9 [M＋H]+（計(jì)算值247.144 1），分子式為C14H18O2N2；1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ: 7.63 (1H,d,J= 8.4 Hz,H-2),7.34 (1H,d,J= 8.4 Hz,H-5),7.18 (1H,s,H-7),7.11 (1H,t,J= 8.4 Hz,H-4),7.05 (1H,t,J= 8.4 Hz,H-3),3.88 (1H,t,J= 7.2 Hz,H-10),3.41 (2H,d,J= 7.2 Hz,H-9),3.25 (9H,s,Me-12,13,14)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的核磁數(shù)據(jù)基本一致[23-24]，但是未見該化合物的碳譜文獻(xiàn)報(bào)道，通過二維譜對(duì)化合物碳譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了歸屬，具體如下：13C-NMR (150 MHz,CD3OD)δ: 171.7 (C-11),138.1 (C-6),128.3 (C-1),122.6 (C-4),125.1 (C-7),120.0 (C-3),119.1 (C-2),112.4 (C-5),109.0 (C-8),80.6 (C-10),52.7 (C-12),52.7 (C-13),52.6 (C-14),24.6 (C-9)。故鑒定化合物6為N,N-二甲基-色氨酸甲酯。

化合物7：白色固體粉末。ESI-MSm/z:314.14 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 7.26 (1H,d,J= 15.7 Hz,H-7),7.07 (1H,d,J= 2.0 Hz,H-2),7.00 (2H,d,J= 7.8 Hz,H-2′,6′),6.94 (1H,dd,J= 8.4,2.0 Hz,H-6),6.74 (1H,d,J= 8.4 Hz,H-5),6.64 (2H,d,J= 7.8 Hz,H-3′,5′),6.38 (1H,d,J= 15.7 Hz,H-8),3.76 (3H,s,3-OMe),3.28 (2H,m,H-8′),2.60 (2H,t,J= 7.4 Hz,H-7′)；13C-NMR (150 MHz,DMSO-d6)δ: 165.8 (C-9),156.2 (C-3),148.3 (C-4'),148.8 (C-4),139.4 (C-7),130.1 (C-1'),130.0 (C-2',C-6'),127.0 (C-1),122.0 (C-6),119.6 (C-8),116.2 (C-5),115.6 (C-3',5'),111.3 (C-2),56.0 (3-OMe),41.2 (C-8'),35.0 (C-7')。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照[25-26]，故鑒定化合物7為N-反式-阿魏酰酪胺。

化合物8：白色固體粉末。ESI-MSm/z:344.13 [M＋H]+；1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ: 7.44 (1H,d,J= 15.6 Hz,H-7′),7.10 (1H,s,H-2′),7.00 (1H,d,J= 7.8 Hz,H-6′),6.81 (1H,s,H-2),6.79 (1H,d,J= 7.8 Hz,H-5),6.71 (1H,d,J= 7.8 Hz,H-5′),6.64 (1H,d,J= 7.8 Hz,H-6),6.41 (1H,d,J= 15.6 Hz,H-8′),3.86 (3H,s,3′-OMe),3.82 (3H,s,3-OMe),3.48 (2H,t,J= 7.2 Hz,H-8) ,2.76 (2H,t,J= 7.2 Hz,H-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照[25]，故鑒定化合物8為N-反式阿魏酰-3-甲氧基酪胺。

4 生物合成途徑

本項(xiàng)目組從何首烏中，首次分離得到N-反式-阿魏酰酪胺的3個(gè)二聚體和1個(gè)三聚體[13]，發(fā)現(xiàn)其均為何首烏中微量成分，初步推測(cè)這些聚合物在何首烏中可能的生物合成途徑，見圖3。

5 對(duì)正常人L02肝細(xì)胞活性的影響

5.1 細(xì)胞培養(yǎng)

參考文獻(xiàn)方法[27-28]：取正常人L02肝細(xì)胞，在37 ℃和5%二氧化碳條件下，培養(yǎng)于含10%的胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿80%～90%，用0.25%胰酶消化細(xì)胞，然后用新的培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸，將細(xì)胞按適當(dāng)比例傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖3 化合物1～3的可能生物合成途徑Fig.3 Plausible biogenetic route for compounds 1—3

5.2 樣品溶液的配制

取化合物1、7和8適量，精密稱定，加DMSO溶解，初始質(zhì)量濃度為500.0 μg/mL，5倍梯度稀釋，共計(jì)7個(gè)質(zhì)量濃度梯度，分別為500.0、100.0、20.0、4.0、0.8、0.16和0.032 μg/mL，重復(fù)3次。

5.3 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率測(cè)定

采用CCK8法，將肝細(xì)胞密度（800細(xì)胞/孔）接種于384孔細(xì)胞板中，每孔接種40 μL細(xì)胞懸液，細(xì)胞板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱，孵育24 h。每孔加入10 μL化合物1、7、8的樣品溶液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱，避光孵育72 h。孵育后，向細(xì)胞板中加入CCK8，5 μL/孔，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h（注意避光），然后在酶標(biāo)儀中檢測(cè)吸光度（A）值，吸收波長(zhǎng)設(shè)為450 nm，按照公式計(jì)算細(xì)胞的抑制率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，化合物1、7和8對(duì)L-02細(xì)胞的IC50值，分別為（3.02±1.20）、（190.35±5.39）和（300.61±16.27）μmol/L。

As為樣品孔的A值（待測(cè)化合物）；ANC為陰性孔A值（細(xì)胞＋培養(yǎng)基＋DMSO）；ASTSP為星孢菌素（STSP）孔A值（細(xì)胞＋培養(yǎng)基＋10 μmol/L STSP）

6 討論

目前，從何首烏中僅分離得到N-反式-阿魏酰酪胺、N-反式阿魏酰-3-甲氧基酪胺、N-反式咖啡酰酪胺、cannabisin D、grossamide、polygonimitin G和polygonimitin F等7個(gè)木脂素酰胺類成分，但化合物量較少，提示其可能為何首烏中一類新的微量成分。polygonimitin G（1）與N-反式-阿魏酰酪胺（7）和N-反式阿魏酰-3-甲氧基酪胺（8）相比，具有更強(qiáng)的L-02細(xì)胞抑制作用，提示該類化合物可能具有一定的潛在肝毒性。另?yè)?jù)文獻(xiàn)報(bào)道[13,29-31]，該類成分還具有保肝、調(diào)血脂、抗腫瘤、抗氧化和抗炎等活性，所以，有必要對(duì)其進(jìn)行全合成研究，從而進(jìn)一步系統(tǒng)評(píng)價(jià)該成分的肝毒性和生物活性。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突