劉津念，鄭 劍，殷永健，張正紅，盛 夏，唐 偉

(1.重慶市巴南區(qū)第二人民醫(yī)院泌尿外科，重慶 400054；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，重慶 400016)

不育是威脅人類生殖健康的全球性難題[1，2]。以大氣顆粒物(PM)為特征的大氣復(fù)合污染物暴露對(duì)健康有直接或間接影響，尤其是對(duì)生殖系統(tǒng)的影響也開始受到人們關(guān)注[3]。研究表明[4]，大氣細(xì)顆粒物(PM2.5)對(duì)男性生殖系統(tǒng)有嚴(yán)重深遠(yuǎn)影響。前列腺素E2(PGE2)為花生四烯酸經(jīng)環(huán)加氧酶催化的代謝產(chǎn)物，是重要炎癥因子，COX-2為PGE2生成的主要限速酶，核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)信號(hào)通路則是體內(nèi)一條非常經(jīng)典信號(hào)通路，在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用[5，6]，研究發(fā)現(xiàn)[7]，NF-κB/COX-2/PGE2與男性生殖功能受損有關(guān)。本研究探討PM2.5暴露后激活NF-κB/COX-2/PGE2信號(hào)通路引起氧化應(yīng)激損傷雄性生殖功能的機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料2019年11月至2020年11月于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心、重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院開展實(shí)驗(yàn)。選取20只清潔級(jí)別c57bl雄性小鼠，體重34～37 g[(35.48±1.27)g]。均于單籠飼養(yǎng)在18～21 ℃、濕度45%～60%環(huán)境中，實(shí)驗(yàn)期間飼喂普通清潔級(jí)飼料，自由攝食飲水，在適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開展實(shí)驗(yàn)。主要試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基(Hyclone公司)；胎牛血清(北京民海生物科技有限公司)；1∶250胰蛋白酶(北京聚合美公司)；膠原酶Ⅰ(Sigma公司)；考馬斯亮藍(lán)G250(Solarbio公司)；ELISA快速檢測(cè)試劑盒(Meimian公司)；AxyPrep總RNA小量提取試劑盒(Axygen公司)；RNase-free Water(北京TransGen Biotech公司)；兔抗NF-κB多克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)；兔抗COX-2單克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)；兔抗PGE2單克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)；兔抗β-actin多克隆抗體(美國(guó)Proteintech公司)。儀器：小動(dòng)物手術(shù)器械及溶液配制容器、電子天平、超凈工作臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱、恒溫水浴、離心機(jī)，均購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；酶標(biāo)儀；qTOWER3 touch熒光定量PCR儀[中機(jī)科儀(北京)]。

1.2 方法

1.2.1分組及處理 采用隨機(jī)數(shù)字表以簡(jiǎn)單隨機(jī)分組法將20只小鼠分為對(duì)照組和暴露組各10只，對(duì)照組留于SPF級(jí)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組在對(duì)照組基礎(chǔ)上注射24 mg/kg.b.w.PM2.5懸液予以PM2.5暴露，持續(xù)暴露12周。24 mg/kg.b.w.PM2.5懸液的制備：于重慶市區(qū)內(nèi)露天環(huán)境中進(jìn)行采樣，采樣時(shí)間為2019年11月至2020年5月，采樣儀器：Thermo Anderson大氣顆粒物采樣器(GV2630)，在采樣完成后，將玻璃剪碎成1.5 cm×1.5 cm小片，置于適量的生理鹽水中，以超聲振蕩器(KQ-250DE，中國(guó)舒美)超聲震蕩4×40 min，得到PM2.5懸液，以Thermo冷凍干燥機(jī)(LL3000，美國(guó))凍干12 h，得到固體PM2.5，后儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱中，使用前以無菌生理鹽水制成24 mg/kg.b.w.PM2.5懸液。

1.2.2標(biāo)本取材及處理 各組小鼠處理結(jié)束后麻醉、處死，收集血液、睪丸、附睪等標(biāo)本。每組各取出10個(gè)睪丸經(jīng)Bouin液固定、脫水、石蠟包埋，用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)；每組各取10個(gè)睪丸立即放入液氮凍存，用于基因和蛋白檢測(cè)；每組血液標(biāo)本經(jīng)離心處理用于ELISA檢測(cè)；附睪立即置于PBS緩沖液中，進(jìn)行生殖功能檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。睪丸組織取出后放入4%多聚甲醛固定，室溫固定24 h，12 h取出睪丸并對(duì)切，充分固定，后予以梯度脫水、浸蠟、包埋處理。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1生殖功能檢測(cè) 主要包括睪丸與附睪指數(shù)、精子計(jì)數(shù)、精子活動(dòng)率、精子畸形率、精子成活率，其中精子活動(dòng)率檢測(cè)依據(jù)WHO推薦的方法，按照精子泳動(dòng)圖將精子活動(dòng)分為Ⅰ～Ⅳ級(jí)，精子活動(dòng)率=(Ⅰ級(jí)+Ⅱ級(jí)+Ⅲ級(jí))/(Ⅰ級(jí)+Ⅱ級(jí)+Ⅲ級(jí)+Ⅳ級(jí))×100%。

1.3.2血睪屏障及間質(zhì)細(xì)胞功能檢測(cè) 將考馬斯亮藍(lán)溶液沿著血管注射，肉眼觀察考馬斯亮藍(lán)在睪丸的通透情況并拍照，分析血睪屏障通透性；經(jīng)免疫熒光組織化學(xué)法[8]檢測(cè)Sertoli細(xì)胞骨架Vimentin、Actin分布與形態(tài)變化，透射電子顯微鏡觀察生精細(xì)胞間緊密連接時(shí)空變化，觀察睪丸間質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

1.3.3酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 應(yīng)用ELISA快速檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組小鼠睪丸組織勻漿和血清中睪酮(T)、雄性激素結(jié)合蛋白(ABP)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)含量。

1.3.4NF-κB/COX-2/PGE2信號(hào)通路的檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法[9]測(cè)定睪丸組織NF-κB/COX-2/PGE2 mRNA的表達(dá)，反應(yīng)體系：正義鏈(F)1 μl+反義鏈(R)1 μl+Maxima SYBR Green qPCR Master Mix(2X)，no ROX 12.5 μl+模板4 μl，加水至25 μl。擴(kuò)增條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。采用ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算，相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt，ΔΔCt=[Ct GI(未知樣本)-Ctβ-actin(未知樣本)]-[Ct GI(校正樣本)-Ctβ-actin(校正樣本)]，其中GI為目的基因，β-actin為管家基因作為校正起始模板。Western blot法[9]測(cè)定睪丸組織NF-κB/COX-2/PGE2蛋白的表達(dá)情況。將少量組織(約0.1 g)放入無菌2 ml EP管中，添加組織裂解液1 ml及蛋白酶抑制劑10 μl，靜置，后勻漿、裂解組織、離心，采用BCA蛋白提取試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，后予以SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗原抗體反應(yīng)，測(cè)3次取平均值。采用半定量評(píng)分系統(tǒng)評(píng)定效果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分率)表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組生殖功能指標(biāo)比較暴露組睪丸系數(shù)、附睪系數(shù)、精子計(jì)數(shù)、精子活動(dòng)率與精子成活率低于對(duì)照組，而精子畸形率高于對(duì)照組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組生殖功能指標(biāo)比較

2.2 考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果考馬斯亮藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組(圖1a)淡染的睪丸支持細(xì)胞生長(zhǎng)較均勻，自然伸展且相互連接，細(xì)胞骨架以縱向分布為主，呈均勻分布；暴露組(圖1b)細(xì)胞質(zhì)骨架逐漸松弛回縮甚至斷裂、消失，分布紊亂，生精細(xì)胞脫落。

圖1 考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果(×200) a：對(duì)照組；b：暴露組

2.3 免疫組化染色結(jié)果免疫組化法發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組(圖2a)相比，暴露組(圖2b)睪丸間質(zhì)細(xì)胞體積變小，染色加深，細(xì)胞核固縮，胞漿含量少，少部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)水腫，細(xì)胞內(nèi)異染色質(zhì)增多。

圖2 免疫組化染色結(jié)果(×6000) a：對(duì)照組；b：暴露組

2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果暴露組睪丸組織勻漿及血清中T、ABP表達(dá)水平低于對(duì)照組，而TNF-α、IL-1與IL-6水平高于對(duì)照組(P<0.05)。見表2。

表2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果比較

2.5 兩組NF-κB、COX-2、PGE2表達(dá)水平暴露組NF-κB、COX-2、PGE2的mRNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)水平均高于對(duì)照組(P<0.05)。見圖3、表3、表4。

圖3 兩組NF-κB、COX-2、PGE2蛋白表達(dá)水平(Western blot法)

表3 兩組NF-κB、COX-2、PGE2 mRNA表達(dá)水平比較

表4 兩組NF-κB、COX-2、PGE2蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

氧化應(yīng)激是大氣顆粒物引起機(jī)體損傷的主要機(jī)制，而活性氧自由基(ROS)為正常有氧代謝過程中產(chǎn)生的有害副產(chǎn)物，顆粒物暴露能引起ROS增多破壞了這一平衡[10]。大氣顆粒物的細(xì)胞毒性主要機(jī)制為通過氧化應(yīng)激產(chǎn)生，其中PM2.5可深入機(jī)體肺泡并沉積，對(duì)機(jī)體的呼吸系統(tǒng)造成損傷，也可激活相關(guān)通路引起睪丸組織發(fā)生氧化應(yīng)激，造成精子質(zhì)量損害，精子質(zhì)量降低可能是因大氣細(xì)顆粒物暴露產(chǎn)生的氧化應(yīng)激所致[11]。目前PM2.5對(duì)雄性生殖健康影響已引起關(guān)注，相關(guān)研究逐漸增多，但多數(shù)研究主要涉及一般生殖毒性指標(biāo)的觀察[12，13]。NF-κB為一類關(guān)鍵性的核轉(zhuǎn)錄因子，通常以同源或異源二聚體非活性形式存在于幾乎所有類型細(xì)胞的胞質(zhì)，COX-2也是重要的氧化應(yīng)激相關(guān)因子，有研究發(fā)現(xiàn)[14]，NF-κB/COX-2途徑的解旋酶驅(qū)動(dòng)激活介導(dǎo)人腫瘤微環(huán)境中dsRNA驅(qū)動(dòng)的炎癥免疫抑制成分，而PGE2為花生四烯酸經(jīng)環(huán)加氧酶催化的代謝產(chǎn)物，與多種疾病發(fā)生發(fā)展有關(guān)[15]，但PM2.5引起的氧化應(yīng)激損傷及雄性生殖功能障礙是否與NF-κB/COX-2/PGE2信號(hào)通路有關(guān)目前未見報(bào)道。

精液液化時(shí)間、精液pH值、精子濃度、精子活力、正常形態(tài)率及異常形態(tài)率等精液參數(shù)均可作為男性不育的評(píng)估指標(biāo)。本次發(fā)現(xiàn)，暴露組睪丸系數(shù)、附睪系數(shù)、精子計(jì)數(shù)、精子活動(dòng)率、精子成活率低于對(duì)照組，而精子畸形率高于對(duì)照組，這與曹希寧[9]的研究有相似之處，表明PM2.5的持續(xù)暴露可能引起雄性大鼠生殖功能障礙。氧化應(yīng)激可通過對(duì)雄性生殖系統(tǒng)的損傷而影響男性生育能力及對(duì)子代的表觀遺傳，表現(xiàn)為類固醇激素合成下調(diào)，最終影響雄性生育力及子代相關(guān)基因的表達(dá)[16]。PM2.5為環(huán)境空氣中空氣動(dòng)力學(xué)直徑<2.5 μm的顆粒物，其面積較大，活性強(qiáng)，易于附帶有毒、有害物質(zhì)等，同時(shí)可誘導(dǎo)睪丸組織產(chǎn)生過量ROS，導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激損傷，從而影響生殖功能[17]。

間質(zhì)細(xì)胞為睪酮主要來源，能保證睪酮局部較高濃度，此為完成精子發(fā)生所必需的條件，支柱細(xì)胞Sertoli對(duì)卵泡刺激素(FSH)起反應(yīng)，產(chǎn)生雄激素結(jié)合蛋白(ABP)、抑制素(inhibin)，并組成血睪屏障。本次考馬斯亮藍(lán)染色及免疫組化染色表明，PM2.5的長(zhǎng)時(shí)間暴露可引起雄性小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)及血睪屏障，PM2.5暴露后可破壞正常的抗氧化防御系統(tǒng)，減少超氧化物歧化酶的含量，增加脂質(zhì)過氧化物丙二醛含量，最終導(dǎo)致睪丸氧化應(yīng)激及生殖功能不良發(fā)展[18]。此外本次暴露組睪丸組織勻漿及血清中T、ABP表達(dá)水平低于對(duì)照組，而TNF-α、IL-1、IL-6水平高于對(duì)照組，表明PM2.5暴露后可能引起全身炎癥反應(yīng)，睪丸血管炎癥性病變，血睪屏障破壞，大量的炎癥因子進(jìn)入睪丸，使之發(fā)生炎癥反應(yīng)，從而影響生殖功能。

精子質(zhì)膜富含的高濃度多不飽和脂肪酸對(duì)氧化損傷較敏感，質(zhì)膜較容易因其受到破壞，此外精子細(xì)胞核缺乏對(duì)氧化應(yīng)激的抵抗力，易受此影響而出現(xiàn)DNA損傷，而睪丸組織的氧化應(yīng)激易造成精子質(zhì)量損害。本次結(jié)果表明PM2.5暴露后引起雄性生殖功能損傷可能與上調(diào)NF-κB/COX-2/PGE2信號(hào)通路有關(guān)。NF-κB信號(hào)通路為體內(nèi)一條非常經(jīng)典的信號(hào)通路，其參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化等相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控[19]，PGE2不僅可直接刺激神經(jīng)末梢引起疼痛，也能提高痛覺感受器對(duì)其他致痛因子的敏感性誘發(fā)P物質(zhì)等釋放增加，COX-2為PGE2生成的主要限速酶[20]。Yin等[21]的研究表明，PM2.5可激活血管內(nèi)皮細(xì)胞COX-2/PGES/PGE2的炎性軸，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，本研究也得出的相似結(jié)論。我們推測(cè)PM2.5暴露后可引起全身炎癥反應(yīng)，睪丸血管炎癥性病變，血睪屏障破壞，大量的炎癥因子進(jìn)入睪丸，激活NF-κB/COX-2/PGE2信號(hào)通路，破壞Sertoli細(xì)胞功能，從而導(dǎo)致生殖細(xì)胞發(fā)育、分化為成熟精子障礙，進(jìn)而引起精子數(shù)量和質(zhì)量的異常，最終導(dǎo)致雄性不育。但本次研究條件有限，未對(duì)小鼠睪丸Sertoli細(xì)胞進(jìn)一步進(jìn)行分離培養(yǎng)觀察，后期將進(jìn)一步開展體外實(shí)驗(yàn)，深入探究PM2.5對(duì)NF-κB/COX-2/PGE2信號(hào)通路的影響。