朱柏雨 夏 陳 羅棵瀕 朱永清 唐曉波 陳 建

(1. 四川省農業(yè)科學院農產品加工研究所，四川 成都 610066；2. 四川大學公共衛(wèi)生學院，四川 成都 610044；3. 四川省農業(yè)科學院茶葉研究所，四川 成都 610066)

茶葉中富含多種天然活性物質，包括茶多酚、生物堿、氨基酸和茶色素等[1]，其中茶多酚是茶葉中發(fā)揮生物活性的重要物質[2]。研究表明，茶多酚具有抗炎[3]、抗癌細胞增殖[4]、抗心血管疾病[5]和抗糖尿病[6]等作用。此外咖啡堿和茶堿等物質也是茶葉中重要的呈味物質和活性成分，具有強心、促進代謝[7]、利尿[8]、助消化[9]等功效。黑茶主產于四川、湖南、湖北、云南、廣西等地[10]，是由茶樹的鮮葉或成熟的新梢經殺青、渥堆、干燥等工藝制成[11]，原料一般較為粗老，兒茶素化合物含量通常低于嫩葉[12]。黑茶的渥堆是加工過程中的關鍵工藝，該工藝會發(fā)生氧化還原、美拉德反應等化學變化，這些變化可能促使茶多酚單體相互轉化及分解，且不同的渥堆工藝生產的黑茶中茶多酚等功效物質可能有巨大差異[1]。曹永等[13]以湖南產區(qū)的天尖茶、茯磚茶和百兩茶，云南的普洱茶以及廣西的六堡茶為原料，考察了不同產區(qū)黑茶的簡單兒茶素(表沒食子兒茶素、兒茶素、表兒茶素)和酯型兒茶素(表兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯)含量，結果顯示天尖、茯磚和百兩茶提取物中兒茶素的總量高于普洱茶和六堡茶，酯型兒茶素含量則以天尖茶和百兩茶占優(yōu)。王斌等[14]分析了26種安化黑茶水溶性成分，并與干燥未加工的茶葉及新鮮茶葉作對比。結果表明，26種安化黑茶的沒食子酸、沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素、咖啡堿、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯、沒食子兒茶素沒食子酸酯、兒茶素沒食子酸酯含量差異較大，與新鮮茶葉對比后發(fā)現(xiàn)除了咖啡堿外，其他化合物的含量均存在顯著下降的情況，部分物質下降至1/20以下。劉婷婷等[15]研究發(fā)現(xiàn)黑茶在發(fā)酵過程中，其主要品質成分及生物酶活性均存在顯著變化。隨著黑茶發(fā)酵程度的不斷加深，茶多酚、兒茶素、茶褐素、纖維素、原果膠、蛋白質、氨基酸、可溶性糖含量均在渥堆工藝中下降，其含量降幅分別為69.2%，43.7%，52.4%，9.6%，60.0%，62.3%，66.2%，37.2%，多酚氧化酶、過氧化物酶、纖維素酶、果膠酶活性分別提高了246%，371%，371%，223%，咖啡堿含量則無顯著變化。

四川黑茶歷史悠久，早在乾隆年間就分為“南路邊茶”和“西路邊茶”，但目前關于四川黑茶中茶多酚和黃酮及功效的研究較少，同時對于市售四川黑茶的品質評價也未見報道。因此研究擬對26種市售四川黑茶產品進行茶多酚和咖啡堿含量分析，通過自由基清除試驗評價其抗氧化能力，并以相關性及主成分分析對市售26種四川黑茶(S1～S26)進行品質評價，以期為四川黑茶研發(fā)、生產和質量控制提供基礎依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

26種黑茶：四川市售；

沒食子酸(GA)、沒食子兒茶素(GC)、兒茶素(C)、表沒食子兒茶素(EGC)、表兒茶素(EC)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、兒茶素沒食子酸酯(CG)標準品：北京索萊寶科技有限公司；

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)標準品：上海源葉生物科技有限公司；

咖啡堿(CAF)標準品：成都普菲德生物技術有限公司；

甲醇、乙腈：色譜純，美國MREDA公司；

甲酸、福林酚、蘆丁、水溶性維生素E、過硫酸鉀、2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：分析純，成都市科龍化工試劑廠；

試驗用水為超純水。

1.2 儀器與設備

高速萬能粉碎機：FW-100型，北京科偉永興儀器有限公司；

數(shù)控超聲波清洗器：KH2200DE型，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；

臺式低速離心機：TD-4Z型，四川蜀科儀器有限公司；

酶標儀：ELX-800型，美國伯騰儀器有限公司；

高效液相色譜儀：1290型，美國Agilent公司；

優(yōu)普系列超純水機：UPC-1-10T型，成都超純科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑茶多酚單體及生物堿含量分析

(1) 對照品的制備：單體酚與咖啡堿對照品20.0 mg，以甲醇溶解定容至5 mL，以二倍稀釋法制備不同濃度的對照品溶液，冷藏備用。

(2) 樣品的制備：將供試樣品粉碎過篩，精密稱取供試黑茶1.000 0 g于錐形瓶中，加入80%甲醇8 mL，40 ℃超聲30 min后離心，收集上清液至25 mL容量瓶，殘渣再以同樣方法重復提取2次，合并3次提取液，定容備用。

(3) 色譜條件：采用梯度洗脫，Eclipse Plus C18柱(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)；檢測波長280 nm；柱溫35 ℃；流速0.3 mL/min；進樣量1 μL；流動相A為1%甲酸—水溶液，B為乙腈，洗脫條件：0～2 min，5%～10% B；2～10 min，10%～20% B;10～15 min，20%～40% B；15～17 min，40%～70% B；17～20 min，70%～95% B。

(4) 多酚單體及生物堿含量計算：經HPLC分析后，根據(jù)供試品各化合物峰面積及標準曲線按式(1)計算含量。

(1)

式中：

W——含量，mg/g；

C——樣品質量濃度，μg/mL；

D——稀釋倍數(shù)；

V——樣品體積，mL；

m——樣品質量，g。

1.3.2 總多酚(TPC)含量分析 采用福林酚法[16]，按式(1)計算TPC含量(以沒食子酸當量計)。

1.3.3 總黃酮(TFC)含量分析 參照宋瑩等[17]的方法，并按式(1)計算TFC含量(以蘆丁當量計)。

1.3.4 抗氧化活性分析

(1) ABTS自由基清除能力：參照夏陳等[18]的方法，以水溶性維生素E為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線，據(jù)標準曲線計算ABTS自由基清除力。

(2) DPPH自由基清除能力：參照鄧俊琳等[19]的方法，以水溶性維生素E為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線，據(jù)標準曲線計算DPPH自由基清除力。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)均為3次重復取平均值，使用Microsoft Excel 2016進行數(shù)據(jù)整理并通過SPSS 20.0采用Turkey方法對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結果與分析

2.1 四川黑茶活性成分含量

對照品和樣品的HPLC圖譜如圖1和圖2所示。由圖1可知，10個對照品在20 min內均得到較好的分離且峰形較好，26個樣品色譜圖中的10個目標物的保留時間與對照品色譜圖一致。

1. GA 2. GC 3. ECG 4. EC 5. EGCG 6. ECG 7. CG 8. C 9. EGC 10. CAF

圖2 樣品HPLC圖譜

以各對照品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標制圖得標準曲線回歸方程如表1所示，10個目標物的回歸方程R2在0.998 7～0.999 9，表明各回歸方程在其線性范圍內線性關系良好，可以用于各物質含量計算。

表1 回歸方程及線性范圍

2.1.1 GA含量 由表2可知，26個黑茶樣品中GA含量差異較大，其中S21的GA含量顯著高于其他樣品(P<0.05)，而S11的GA含量最低。已有研究[20]表明，綠茶中GA含量大多低于1.00 mg/g，試驗的26個樣品中有25個樣品的GA含量高于1.00 mg/g，表明茶葉經過發(fā)酵、渥堆、干燥等加工后能夠顯著提高GA含量，可能是在發(fā)酵等加工過程中的酯化兒茶素經過微生物作用、酶轉化以及美拉德反應的共同作用下降解形成GA等物質[21]。

表2 四川黑茶GA含量?

2.1.2 GC、GCG、C、EGCG、ECG含量 26個樣品中GC、GCG、C、EGCG、EGC 5個多酚單體含量差異較大(表3)。與綠茶[22]相比，黑茶的GC和GCG含量均相對較高，但C、EGCG和EGC含量則遠低于綠茶。黑茶在渥堆及干燥過程中由于溫度升高使GC和GCG含量升高，而C、EGCG和EGC的含量下降。有研究[23-24]表明，兒茶素類化合物會發(fā)生個體異構化，尤其是在較高的溫度下更明顯。隨著溫度的升高，部分兒茶素類化合物的含量減少，而其異構體含量增加，部分兒茶素類化合物從上位結構(EGC和EGCG)變化為非上位結構(GC和GCG)[25]。因此四川黑茶C、EGCG、EGC含量較綠茶有所下降，而GC、GCG的含量升高。

表3 四川黑茶GC、GCG、C、EGCG、ECG含量?

2.1.3 EC、ECG、CG、CAF含量 已有研究[20]表明，綠茶中EC含量在0.64～10.20 mg/g，ECG含量在2.18～13.40 mg/g。由表4可知，26個黑茶樣品中的EC和ECG含量均低于綠茶，是由于黑茶在制作中需經過渥堆、發(fā)酵等工藝步驟，在氧化酶類(多酚氧化酶、過氧化物酶等)的作用下黑茶中幾乎所有簡單兒茶素(C、EC、EGC)和酯兒茶素(ECG、EGCG)含量顯著降低，從而形成黑茶獨有的顏色、風味和香氣[26]。與其他單體酚相比，26個樣品中的CG含量均處于較低的水平，而且各樣品間的CG含量差異較大。所有供試品中咖啡堿含量占10種化合物總量24.50%以上且與綠茶[22]相比差異不大，表明咖啡堿性質穩(wěn)定，在黑茶加工過程中不易受溫度、發(fā)酵及氧化影響[27]。

表4 四川黑茶EGC、CAF、EC、CG含量?

2.2 黑茶總多酚含量

通過福林酚法，以沒食子酸濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，制圖得總多酚標準曲線：y=0.001 8x+0.042 6，線性范圍2.34～300.00 μg/mL，其R2=0.999 1，表明在該范圍內，線性關系良好，可用于總多酚含量計算。

黑茶中含有大量的多酚類化合物，主要以游離或結合的方式存在，其能夠發(fā)揮降血脂、防止血栓和動脈硬化的形成。由表5可知，26個黑茶樣品中的總多酚含量差異較大，其中S23總多酚含量為S11總多酚含量的10倍以上。多酚是一類在同一個苯環(huán)上有多個酚羥基取代的芳香羧酸類化合物，由于其含有多個酚羥基取代，因而結構不穩(wěn)定[28]，在一定的光照、水分、溫度、酶及酸堿條件下易發(fā)生開環(huán)反應而使其降解或異構化[29]。黑茶的渥堆、發(fā)酵等工藝實際上是一個氧化還原過程，因而不同生產廠家、不同工藝條件的黑茶樣品的總多酚含量不盡相同。

表5 四川黑茶總多酚含量?

2.3 黑茶總黃酮含量

總黃酮的標準曲線為y=0.001x+0.051 7，線性范圍0.98～500.00 μg/mL，其R2=0.999 1，表明在該范圍內，線性關系良好，可用于總黃酮含量計算。

由表6可知，26個四川黑茶樣品的總黃酮含量差異較小，維持在相對穩(wěn)定的水平內。有研究[30]表明，黃酮類化合物在50 ℃以下、光照、弱酸及中性條件下均保持良好的穩(wěn)定性。黑茶在渥堆過程中，其溫度多在45 ℃以下[31]，因而能夠保證黃酮類化合物不被降解，而黃酮類化合物含量差異可能是由其原料差異所致。

表6 四川黑茶總黃酮含量?

2.4 抗氧化活性

2.4.1 ABTS自由基清除能力 以水溶性維生素E的質量濃度(μg/mL)為橫坐標，吸光值為縱坐標，制圖得標準曲線回歸方程：y=-0.006x+0.473 5，線性范圍1.48～47.50 μg/mL，其R2=0.997 5，表明在該范圍內，線性關系良好，可用于四川黑茶ABTS自由基清除計算。

由表7可知，26個樣品的ABTS自由基清除能力差異較大。相關性分析結果表明，ABTS自由基清除能力與GA、GC、CAF以及TPC、TFC含量存在一定的相關性(表9)，由于黑茶的渥堆、發(fā)酵等加工過程中的美拉德反應及氧化還原反應對這些活性物質的含量均存在較大的影響，因此不同樣品間ABTS自由基清除能力的差異也可能是由加工工藝不同所致。

表7 四川黑茶對ABTS自由基清除能力?

2.4.2 DPPH自由基清除能力 以水溶性維生素E的質量濃度(μg/mL)為橫坐標，吸光值為縱坐標，制圖得到DPPH自由基清除回歸方程為y=0.942 8x-0.420 2，線性范圍：13.00～104.00 μg/mL，其R2=0.997 0，表明在該范圍內，線性關系良好，可用于四川黑茶DPPH自由基清除計算。

由表8可知，26個樣品的DPPH自由基清除能力差異較大，顯著性分析結果表明黑茶的DPPH自由基清除能力與單體酚、CAF、TPC和TFC含量均存在顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)的正相關(表9)，而黑茶的制作工藝同樣會對這些物質的含量產生較大的影響，從而導致樣品間DPPH自由基的清除能力不盡相同。

表8 四川黑茶對DPPH自由基清除能力?

2.5 相關性分析

如表9所示，簡單兒茶素(C、EC、EGC)和酯兒茶素(EGC、GCG、EGCG)之間均存在顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)的相關性。四川黑茶樣品的DPPH自由基清除能力與GA和EGCG含量呈顯著正相關(P<0.05)，與其他單體化合物、總多酚及總黃酮含量呈極顯著正相關(P<0.01)。ABTS自由基的清除能力與GA、GC和CAF含量呈極顯著正相關(P<0.01)，與其他單體化合物無顯著的相關性，表明抗氧化活性與多酚的含量以及種類有關。

表9 四川黑茶中單體酚、咖啡堿、總多酚、總黃酮和抗氧化活性的相關性?

2.6 主成分分析及綜合評價

對26個四川黑茶樣品的9個單體酚、CAF、TPC和TFC含量共計12個成分利用SPSS進行主成分分析(PCA)，結果見表10。經分析提取EGCG、C、TPC 3個主成分進行四川黑茶樣品最終的綜合評價(表11)。結果顯示S16、S23、S19 3個四川黑茶的綜合得分分別為7.44，6.66，3.85。因此當以EGCG、C、TPC 3個成分作綜合評價，S16、S23、S19 3個四川黑茶更為優(yōu)質。

表10 四川黑茶的單體酚、咖啡堿、總多酚和總黃酮的主成分分析結果

表11 四川黑茶綜合評價得分及排名

3 結論

殺青、渥堆、干燥等過程中，四川黑茶的簡單兒茶素、酯兒茶素以及總多酚含量均存在顯著降低的現(xiàn)象，而總黃酮、咖啡堿的含量變化較小，與前人[14]對其他產區(qū)黑茶的分析結果相近。此外研究發(fā)現(xiàn)四川產區(qū)內的黑茶活性成分含量差異較大，產品品質參差不齊，可能是由于黑茶產品的生產原料、生產工藝及貯藏條件等多種因素導致，這也從側面反映四川黑茶的生產工藝及質量標準不統(tǒng)一。研究僅對四川市售的26個黑茶進行了活性成分及抗氧化能力分析，并未結合其生產工藝，因此有必要將黑茶品質與其生產工藝相結合進行深入研究，建立黑茶生產從原料到最終產品的規(guī)范化標準。