蔣彩云 ，喬 琨，許 旻，陳 貝，劉智禹,3，黃文樹,3

( 1.集美大學水產學院，福建 廈門 361021；2.福建省水產研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013；3.福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 廈門 361021)

0 引言

大多數的河鲀都含有河豚毒素(tetraodotoxin,TTX)，TTX是一類毒性極強的非蛋白類神經毒素[1]，它可以選擇性地與肌肉和神經組織中的電壓門控Na+通道結合，從而封閉神經軸突傳導能力，導致進行性癱瘓，甚至使生物因呼吸和心力衰竭而死亡[2]。TTX對小鼠的半數致死量(LD50)約為8 μg/kg(按小鼠體重計)，對人的最小致死劑量只有0.5～1.0 mg[3]，其毒性是氰化鈉的1 250倍[4]，但目前還沒有對TTX中毒治療的特效藥。由于河鲀肉味鮮美、營養(yǎng)豐富，日本、澳大利亞、孟加拉國、中國素有食用河鲀的習慣；然而，TTX的化學性質穩(wěn)定，一般烹調手段難以破壞[5]；因此，人們因食用河鲀而導致TTX中毒的事件，屢有發(fā)生，嚴重威脅人們的生命安全[6-8]。

四齒鲀科的許多河鲀都可以貯積TTX。野生河鲀可通過食物鏈的毒素富集作用，大量貯積TTX于特定組織，如肝臟、卵巢和皮膚等[9]。養(yǎng)殖的無毒的紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)和星點東方鲀(Takifuguniphobles)，若飼喂含TTX的餌料后，其肝臟、卵巢和皮膚中也可累積TTX[10-11]。對野生斑點東方鲀(Takifugupoecilonotus)進行研究發(fā)現，在性成熟期(12月至3月)，隨著性腺指數(gonadosomatic index,GSI)的升高，卵巢中的TTX毒性含量增加，與此同時，肝臟中的TTX含量顯著降低[12]，提示河鲀體內的TTX可通過組織間轉運從肝臟轉移到卵巢。為了探究TTX組織間轉運機制，Yin等[13]提取和純化了豹紋東方鲀(Takifugupardalis)卵巢中的高分子量物質，獲得分子質量為10 ku左右的毒素結合蛋白(TPOBP-10)，通過Edman法為其氨基酸測序，并進行cDNA克隆，結果顯示該蛋白與紅鰭東方鲀的卵黃蛋白原vWD結構域(vitellogenin subdomain,vWF type D)高度同源，提示卵黃蛋白原肽段vWD可能具有結合TTX的功能，進而參與TTX在河鲀卵巢中的富集作用[13]。然而，卵黃蛋白原肽段vWD是否可結合TTX，是否可中和TTX的毒性，目前仍缺少相關的證據。

為此，本研究采用真核表達系統(tǒng)體外重組表達菊黃東方鲀(Takifuguflavidus)中卵黃蛋白原vWD結構域肽段，并采用Biacore-表面等離子體共振(SPR)檢測重組蛋白結合TTX的能力，并進一步研究重組蛋白對TTX毒性的中和作用，為闡明TTX從肝臟轉移到卵巢的機制積累重要基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

菌株：E.coliDH5α感受態(tài)細胞為本實驗室保存，畢赤酵母菌株GS115購自Invitrogen公司;質粒：pMD19-T-TF_vWD克隆質粒為本實驗室保存，表達載體pPIC9K購自Invitrogen公司；實驗動物：19.0～21.0 g的無特定病原體級(SPF)ICR品系雄性健康小鼠，由廈門大學實驗動物中心提供。

1.1.2 實驗試劑

胰蛋白胨(tryptone)、酵母粉(yeast extract)購自OXOID公司；生物素購自上海生工生物公司；無氨基酵母氮源(YNB)購自Difco公司；DL2000 DNA Maker(3427A)、Ex Taq酶試劑盒、EcoR I和Not I限制性內切酶、核酸共沉劑試劑盒、T4 DNA ligase均購自TaKaRa公司；預染蛋白質分子質量標準Marker(DM131-01)購自北京全式金生物公司；DL10 000 DNA Marker(SM0331)購自賽默飛世爾科技有限公司；His-Tag抗體(6×His,His-Tag Antibody)、羊抗鼠二抗(Goat Anti-Mouse IgG (H+L))購自Proteintech公司；河豚毒素粗品(C11H17N3O8，純度≥98%)購自泰州康特生物工程有限公司；HisTrapTMFF Crude 5mL親和層析柱、氨基偶聯(lián)試劑盒(氫氧化鈉、乙醇胺、醋酸鈉緩沖液(pH=4.0，4.5，5.0，5.5)、NHS(N-羥基馬來酰亞胺)、EDC-HCl(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)等)、甘氨酸-鹽酸(pH=2.0)，以及傳感生物芯片CM5均購自美國GE Healthcare Life Sciences公司；PBS緩沖液(pH=7.4)由本實驗室制備。

1.2 方法

1.2.1 pPIC9K-TF_vWD載體的構建

根據菊黃東方鲀TF_vWD蛋白質編碼基因(GenBank登錄號：MT160192)，采用Primer Premier 6.0軟件設計上下游引物。上游引物為TF_vWD-F：5′-GGGGAATTCACCACCTTCAACGACATCA-3′；下游引物為TF_vWD-R：5′-ATGCGGCCGCTCAATGGTGATGGTGATGATGCCCGTTGGGCATAC GGA-3′。下劃線部分為限制性內切酶 EcoR I和Not I的酶切位點，終止密碼子前為6×His標簽(如加粗部分)。引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

以菊黃東方鲀pMD19-T-TF_vWD陽性質粒(本實驗室保存)為模板，分別以TF_vWD-F和TF_vWD-R為上、下游引物，采用Ex Taq?酶擴增目的基因片段，獲得含有酶切位點的TF_vWD目的基因片段。使用EcoR I和Not I限制性內切酶進行雙酶切，同時對pPIC9K載體質粒進行EcoR I和Not I雙酶切，用核酸共沉劑試劑盒按照說明書回收酶切后的目的基因片段及載體。采用T4 DNA ligase于16 ℃下將具有EcoR I和Not I黏性末端的pPIC9K載體與具有相同黏性末端的TF_vWD基因片段連接，轉化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞中，涂布于含有卡那霉素的LB瓊脂平板上進行抗性篩選，用PCR法鑒定陽性克隆菌，交由生工生物工程(上海)股份有限公司完成測序。根據測序結果，將已構建成功的陽性菌株-80 ℃保存于終體積分數為20%的甘油中備用。

真核表達載體的構建過程如圖1所示，分泌型表達載體pPIC9K的N端含有AOX 1啟動子，利用酵母信號肽α-factor因子引導TF_vWD分泌表達，其C端加入6×His標簽，可以通過Ni+親和層析純化目的蛋白。

1.2.2 pPIC9K-TF_vWD載體的轉化

將測序正確的pPIC9K-TF_vWD菌株進行培養(yǎng)并提取質粒，通過Sac I限制性內切酶對其線性化。用核酸共沉劑對酶切產物進行純化，通過電擊法將線性化的質粒轉化至畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞中，并立即將轉化液涂布于MD平板上，放入培養(yǎng)箱(28 ℃)中培養(yǎng)2～3 d，隨機挑取MD平板上的單克隆菌落接種于YPD平板培養(yǎng)。

1.2.3 TF_vWD重組蛋白的表達與純化

挑取YPD平板上GS115單菌落接種于20 mL BMGY培養(yǎng)基中，然后放入培養(yǎng)箱(28 ℃)。以230 r/min搖菌至600 nm波長下OD值為4～6時，2000g離心10 min收集細胞，再加入20 mL BMMY培養(yǎng)基。比較在pH=7.0、誘導甲醇體積分數為0.5%、不同誘導時間(0，12，24，48，72，96 h)下重組蛋白的表達量(每隔24 h，補加0.5%的甲醇)。利用SDS-PAGE對TF_vWD重組蛋白(rTF_vWD)的表達量進行分析，其余表達菌液的上清，經PBS透析緩沖液透析3次，每次24 h，經0.45 μmol/L 膜抽濾收集上清液并用Ni+親和層析柱純化。

按照GE公司的HisTrapTMFF crude親和層析柱操作說明書進行純化：用5～10倍體積超純水清洗層析柱，用5～10倍柱體積的平衡緩沖液平衡HisTrap層析柱；將過濾后的蛋白液上柱，用3～5倍柱體積的平衡緩沖液平衡過柱，洗去未結合的雜蛋白；用洗脫緩沖液過柱，5～10倍柱體積，洗脫目標蛋白；收集洗脫峰，取少量洗脫液進行SDS-PAGE電泳鑒定rTF_vWD的純度，并以Mouse Anti-6His Tag為一抗，進行Western Blot鑒定。

1.2.4 rTF_vWD與TTX的親和力檢測

1)pH篩選 使用Biacore T200系統(tǒng)中的控制軟件(Biacore T200 Control Software)進行表面等離子體共振(SPR)分析TTX與rTF_vWD的相互作用。在將rTF_vWD固定在傳感器芯片CM5上之前，篩選合適的結合緩沖液的pH值，以PBS緩沖液為工作緩沖液，用10 mmol/L醋酸鈉緩沖液(pH值分別為5.0、4.5和4.0)稀釋rTF_vWD至終質量濃度為30 μg/mL。進樣完成后選取偶聯(lián)量最大的pH值進行后續(xù)實驗，每次進樣后用50 mmol/L NaOH再生表面。

2)rTF_vWD在CM5傳感片表面的偶聯(lián) 系統(tǒng)設置將EDC和NHS以1∶1比例進行混合，活化傳感器芯片CM5表面，再進樣30 μg/mL rTF_vWD重組蛋白溶液(用pH=4.0的醋酸鈉緩沖液配制，pH條件根據上述實驗篩選所得)，最后以1 mol/L乙醇胺鹽酸封閉液封閉活化的芯片表面。

3)rTF_vWD與TTX的動力學分析 用PBS緩沖液分別稀釋TTX粗品濃度至0,31.25，62.5，125，250，500，1000，2000，4000 μmol/L，依次通入到傳感芯片上進行測量，在每次測量后以pH=2.0 的甘氨酸進行洗脫。本實驗在25 ℃下進行，利用Biacore Evaluation Software評估軟件從結合和解離曲線計算出rTF_vWD與TTX的平衡解離常數(KD)。

1.2.5 利用腹腔注射驗證rTF_vWD對TTX的中和作用

選取19.0～21.0 g的無特定病原體級(SPF)ICR系雄性健康小鼠50只，稱量并記錄體重。實驗操作方法參照食品安全國家標準“水產品中河豚毒素的測定”[14]。

1)對照組：準備10只小鼠，每只小鼠腹腔注射0.15 μg TTX，等待小鼠死亡，記錄在2 h內的生存時間及死亡數量。

2)實驗組：提前將TTX與rTF_vWD按摩爾比為1∶1和1∶50分別混勻，在15 ℃條件下分別孵育15 h。準備20只小鼠，隨機分為2組，每組小鼠分別腹腔注射0.15 μg TTX與對應摩爾比的rTF_vWD混合液，等待死亡，記錄在2 h內的生存時間及死亡數量。

2 實驗結果

2.1 pPIC9K-TF_vWD真核載體的構建與鑒定

經PCR擴增獲得TF_vWD ORF框的編碼序列，大小為435 bp，編碼145個氨基酸，分子質量為16.49 ku，pI值為5.58。分別使用EcoR I和Not I對目的基因及pPIC9K載體進行酶切，將酶切后的載體與目的基因連接，獲得475 bp+9.2 Kbp的pPIC9K-TF_vWD重組質粒(見圖2a)，并轉化至大腸桿菌DH5α中。挑取若干單克隆，進行PCR鑒定，得到陽性重組子克隆片段約500 bp，與預期片段大小相符(見圖2b)。分別取陽性菌液測序，結果證明連接正確，核苷酸的開放閱讀框編碼連續(xù)，最終獲得正確構建的pPIC9K-TF_vWD融合表達載體。

2.2 TF_vWD在畢赤酵母中表達及純化

實驗在培養(yǎng)基pH為7.0，誘導表達的甲醇體積分數為0.5%的條件下，比較了不同時間點(0，12，24，48，72，96 h)rTF_vWD的表達量。結果表明：在各誘導表達條件下，在約16 ku位置均出現目的條帶，且72 h后，表達量最高(見圖3a)。

重組畢赤酵母誘導表達后，離心后收集上清，經透析和過濾后，利用鎳離子螯合親和層析柱純化rTF_vWD真核表達產物。用低濃度咪唑(20 mmol/L)洗脫雜蛋白，高濃度咪唑(500 mmol/L)洗脫螯合的融合蛋白，280 nm檢測紫外吸收曲線，可見到明顯的洗脫蛋白峰。收集洗脫組分進行SDS-PAGE電泳，經Quanlity One軟件分析，得到了純度為90%的rTF_vWD。對純化后的rTF_vWD進行Western Blot鑒定，結果在分子質量約為16 ku的位置發(fā)現單一目的條帶(見圖3b)。

2.3 rTF_vWD蛋白與TTX的動力學分析

用pH值分別為5.0、4.5和4.0的醋酸鈉緩沖液稀釋rTF_vWD，進樣完成后選取偶聯(lián)量最大的pH值進行后續(xù)實驗。實驗結果表明，最佳偶聯(lián)pH值為4.0(見圖4)，rTF_vWD在CM5芯片表面最終偶聯(lián)量為4946 RU(見圖5)。以0，31.25，62.5，125，250，500，1000，2000，4000 μmol/L的TTX粗品流過固定有rTF_vWD的芯片，測定并分析配體與受體的相互作用。結果顯示，rTF_vWD與TTX結合的響應值(Rmax)為100 RU，通過穩(wěn)態(tài)擬合(Affinity)計算出rTF_vWD與TTX的平衡解離常數KD為3.15 mmol/L(見圖6)。結果表明rTF_vWD能夠與TTX結合，且親和力較弱。

2.4 rTF_vWD蛋白對TTX的中和作用

對照組中，對小鼠按每千克體重腹腔注射7.5 μg TTX(或按0.15 μg/鼠的量注射TTX)，2 h內10只小鼠死亡7只，致死速度較快，因此選擇在10 min后進行肌肉注射rTF_vWD。實驗組中，腹腔注射TTX與rTF_vWD孵育后的混合液，小鼠存活率顯著上升(P<0.05)(見圖7)，這表明TTX與蛋白體外孵育后，TTX毒性顯著降低了，即rTF_vWD對TTX的毒性有中和作用。

3 討論

卵黃蛋白原是卵黃蛋白(vitellin，Vn)的前體，主要是在肝臟中合成的，通過體循環(huán)將其分布至全身，并攜帶到卵巢。卵黃蛋白原被儲存在早期卵母細胞體內，然后裂解為卵黃脂磷蛋白(I和II)、卵黃高磷蛋白和vWD結構域[15]。除了作為卵黃蛋白前體的作用外，卵黃蛋白原還能作為金屬、無機磷酸鹽、脂類和碳水化合物的載體蛋白[16]，其中vWD結構域具有與病毒或細菌互作的性質，對微生物進行識別并介導微生物的清除[17]。最近有研究發(fā)現從豹紋東方鲀卵巢中分離純化的卵黃蛋白原肽段vWD可能參與TTX的結合[13]。為了驗證卵黃蛋白原肽段vWD與TTX的結合能力，本研究利用畢赤酵母表達系統(tǒng)，經誘導表達條件的優(yōu)化，在0.5%(體積分數)甲醇、pH=7.0的條件下，誘導表達72 h時，rTF_vWD蛋白表達量最高，通過Ni+親和層析柱純化得到rTF_vWD蛋白純度為90%。

Biacore-表面等離子體共振(SPR)是一種高度敏感的技術，常用來驗證包括蛋白質和核酸在內的生物系統(tǒng)的相互作用[18]。SPR的主要優(yōu)勢是它能夠實時測量親和力和動力學，并且是一種無標簽，使用材料相對少的技術[19]。近年來，應用SPR分析不同蛋白質和小分子相互作用的研究進展表明，SPR在分析生物大分子和潛在候選藥物的親和力方面具有廣泛的應用價值[20-22]。本文利用 Biacore T200生物分子相互作用分析系統(tǒng)，將rTF_vWD作為受體，以TTX作為配體進行相互作用的親和力和動力學分析。結果表明rTF_vWD能夠與TTX結合，平衡解離常數為3.15 mmol/L，且親和力較弱。本研究提供了rTF_vWD可結合TTX的直接證據，為卵黃蛋白原肽段vWD可作為不同組織器官間TTX的傳遞[23-24]介質提供重要的證據。本研究還提供了rTF_vWD可中和TTX毒性的重要佐證：預先將TTX與rTF_vWD孵育后，再腹腔注射小鼠，則小鼠死亡率顯著下降，結果表明rTF_vWD可中和TTX毒性作用。本研究為河鲀對TTX耐受和TTX在河鲀體內轉移和富集等機理的研究提供重要資料。