盧 鵬 張 雷 樊晶晶 李 菁 朱一堂

（滄州市中心醫(yī)院，1 檢驗(yàn)科，2 急診醫(yī)學(xué)部，3 眼功能科，滄州 061001）

膿毒癥是臨床常見的由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，表現(xiàn)為全身炎癥反應(yīng)，常見有尿道感染、腦部感染等[1]。膿毒癥通常發(fā)生有手術(shù)史或者是燒傷患者，約50%膿毒癥患者出現(xiàn)腎損傷[2-3]。有研究顯示，膿毒癥的發(fā)病率很高，在重癥監(jiān)護(hù)患者中其發(fā)病率約為30%，且還在逐年增長(zhǎng)[4]。微小RNA（microRNA，miR）是一類內(nèi)源性小分子非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因的表達(dá)。miR-494 是miR 家族中的一員，可能是調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的重要因子[5]。核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）為一種蛋白因子，與細(xì)胞凋亡和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)，能夠調(diào)控炎癥因子、趨化因子及凋亡相關(guān)基因[6]。NF-κB 通路參與膿毒癥大鼠腎上皮細(xì)胞的凋亡和炎癥反應(yīng)的過程[7]。因此，本研究旨在探討miR-494 通過NF-κB通路對(duì)膿毒癥大鼠腎損傷的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

45 只健康雄性SD 大鼠購自遼寧動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體質(zhì)量270～330 g。常溫下飼養(yǎng)，讓大鼠適應(yīng)7 d 新的環(huán)境。將45 只大鼠隨機(jī)分為膿毒癥大鼠模型組（模型組），注射miR-494 inhibitor 膿毒癥大鼠模型組（miR-494 inhibitor 組）、假手術(shù)組（sham組），每組15 只。

1.2 模型建立與標(biāo)本采集

3 組大鼠均經(jīng)10%苯巴比妥鈉麻醉后開腹，模型組和miR-494 inhibitor 組大鼠常規(guī)脫毛、消毒后，逐層分離皮膚，分離右腎蒂及輸尿管，采用1 號(hào)絲線，結(jié)扎腎蒂和右輸尿管，繼續(xù)分離左腎，采用無創(chuàng)傷性夾鉗閉合腎動(dòng)脈35 min，后逐層關(guān)閉腹腔，建模過程中1 只大鼠死亡，假手術(shù)組動(dòng)物打開腹腔，并進(jìn)行左、右兩腎分離腎包膜后即可。miR-494 inhibitor 組在造模成功后大鼠尾部注射miR-494 inhibitor 5 μL，連續(xù)注射3 d。第4 天處死3 組大鼠，分離腎。采用甲醛固定60 min，常規(guī)脫水、浸蠟、制片，厚度為3～4 μm。

1.3 RT-PCR 檢測(cè)大鼠腎組織中miR-494 的表達(dá)

分別將3 組大鼠的腎組織取出，用TRIzol 裂解研磨后的組織，提取總的RNA，逆轉(zhuǎn)錄按照說明書嚴(yán)格進(jìn)行，將逆轉(zhuǎn)后所得的cDNA 進(jìn)行熒光反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。miR-494 上游引物序列為5'-ACACTCCA GCTGGGAGGTTGTCCGTGTT-3'，下游引物序列為5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATT-3'；GAPDH 上游引物序列為5'-CATGAGAAGTATG ACAACAGCCT-3'，下游引物序列為5'-AGTCCT TCCACGATACCAAAG T-3'。所有反應(yīng)嚴(yán)格按照反應(yīng)的條件進(jìn)行擴(kuò)增，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30 個(gè)循環(huán)。由儀器自帶軟件獲取Ct 值，按公式2－△△Ct計(jì)算miR-494 表達(dá)量。

1.4 全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定大鼠血清生物化學(xué)指標(biāo)

建立膿毒癥模型24 h 后，分別取3 組大鼠靜脈血2 mL，檢測(cè)血清肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）水平，在籠內(nèi)收集大鼠尿液，收取上清液，測(cè)量24 h 尿蛋白定量（UTP）的含量。

1.5 ELISA 法檢測(cè)大鼠血清炎癥因子水平

將3 組大鼠靜脈血進(jìn)行常規(guī)方法取血清，采用ELISA 法檢測(cè)3 組大鼠血清中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）和白介素-6（IL-6）水平，取平均值。

1.6 Masson三色法分析大鼠腎組織病理結(jié)構(gòu)

取3 組大鼠腎組織切片，8%甲醛在低溫下進(jìn)行48 h 處理，無水乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟切片2 μm。脫石蠟后清水清洗，采用Masson 三色法試劑盒（上海信帆生物科技有限公司）染色，無水乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封固。顯微鏡下觀察腎組織病理變化[8]。

1.7 TUNEL 檢測(cè)腎小管細(xì)胞凋亡

取3 組大鼠腎組織浸蠟包埋制做石蠟切片，厚度為2 μm。采用TUNEL 將切片進(jìn)行染色，每張切片選擇不重復(fù)的5 個(gè)方位用顯微鏡（×400）進(jìn)行觀察，計(jì)數(shù)腎小管凋亡細(xì)胞數(shù)目和細(xì)胞總數(shù)[9]。腎小管細(xì)胞凋亡=凋亡細(xì)胞/總細(xì)胞×100%。

1.8 免疫印跡檢測(cè)腎組織NF-κB 蛋白含量

取3 組大鼠的50 mg 腎組織，細(xì)胞裂解后提取核蛋白，對(duì)核蛋白的濃度進(jìn)行定量，分裝后，保存在-20℃的環(huán)境中。將提取出的蛋白溶液和緩沖溶液按照4∶1 的比例進(jìn)行混勻，煮沸使蛋白質(zhì)變性。電泳板孔內(nèi)注入蛋白樣品50 μg。轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上后加脫脂奶粉，封閉1 h 后再在30 min 內(nèi)漂洗3次，最后加入兔抗鼠NF-κB 抗體（1∶1 000，廈門慧嘉生物科技有限公司）1 h。取出PVDF 膜后再漂洗3 次，每次10 min，用博士德生產(chǎn)的DAB 試劑盒及ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯影、定影，計(jì)算目的條帶與GAPDH 比值，求得NF-κB 蛋白的相對(duì)表達(dá)含量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，3 組間比較采用單因素方差分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎組織中miR-494 的表達(dá)

與假手術(shù)組相比，模型組及miR-494 inhibitor組大鼠腎組織中miR-494 表達(dá)量均升高（P<0.05），但miR-494 inhibitor 組大鼠miR-494 表達(dá)低于模型組（P<0.05）（圖1）。

圖1 3 組大鼠腎組織中miR-494 的表達(dá)情況

2.2 血清炎癥因子表達(dá)

假手術(shù)組大鼠IL-6、TNF-α和IL-1β的表達(dá)最低，模型組大鼠IL-6、TNF-α和IL-1β的表達(dá)最高。與模型組相比較，miR-494 inhibitor組大鼠IL-6、TNF-α和IL-1β的表達(dá)顯著降低。與假手術(shù)組相比，miR-494 inhibitor組的表達(dá)顯著升高（P<0.05）（表1）。

表1 3 組大鼠炎性因子表達(dá)情況（n=15，±s，mg/L）

表1 3 組大鼠炎性因子表達(dá)情況（n=15，±s，mg/L）

*P<0.05 vs 假手術(shù)組；#P<0.05 vs 模型組

組別IL-6TNF-αIL-1β假手術(shù)組 7.29±1.210.21±0.120.90±0.25模型組13.05±2.68*0.46±0.17*4.46±0.21*miR-494 inhibitor 組 8.76±1.47*# 0.31±0.14*#2.93±0.23*#

2.3 腎組織病理比較

假手術(shù)組腎組織結(jié)構(gòu)完整，腎小管等狀況良好。MiR-494 inhibitor 組腎小球間質(zhì)增多，腎間質(zhì)增寬，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重。模型組與miR-494 inhibitor 組相比，腎小球硬度增加，腎小管周圍組織炎癥浸潤(rùn)更加嚴(yán)重（圖2）。

圖2 大鼠腎組織病理結(jié)構(gòu)比較，標(biāo)尺=20 μm。A：假手術(shù)組；B：模型組；C：miR-494 inhibitor 組.

2.4 生物化學(xué)指標(biāo)比較

與假手術(shù)組相比，模型組和miR-494 inhibitor組大鼠血清中Scr、BUN 和UTP 的水平均明顯升高（均P<0.05）；與模型組相比，miR-494 inhibitor 組大鼠血清中Scr、BUN 和UTP 的水平降低（P<0.05）（表2）。

表2 3 組大鼠生物化學(xué)指標(biāo)比較（n=15，±s）

表2 3 組大鼠生物化學(xué)指標(biāo)比較（n=15，±s）

*P<0.05 vs 假手術(shù)組；#P<0.05 vs 模型組

組別Scr（nmol /L）BUN（mmol/L）UTP（mg）假手術(shù)組31.59±3.653.67±1.731.07±0.24模型組48.64±2.52*12.17±2.14*2.15±0.34*miR-494 inhibitor 組40.05±2.68*#7.15±2.10*#1.66±0.28*#

2.5 miR-494 對(duì)腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響

棕黑色細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腎小管上皮細(xì)胞的凋亡數(shù)目顯著增多（P<0.05），miR-494 inhibitor 組中大鼠腎小管上皮細(xì)胞的凋亡數(shù)目少于模型組（P<0.05）（圖3、4）。

圖3 大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡情況，標(biāo)尺= 50 μm。A：假手術(shù)組；B：模型組；C：miR-494 inhibitor 組.

2.6 腎組織中NF-κB p65 蛋白表達(dá)

模型組NF-κB p65 蛋白含量最高，miR-494 inhibitor 組中大鼠NF-κB p65 的蛋白含量比假手術(shù)組的蛋白含量高（P<0.05），但較模型組NF-κB 明顯降低（P<0.05）（圖5）。

圖5 大鼠腎組織中NF-κB p65 蛋白表達(dá)

3 討論

膿毒癥是細(xì)菌在血液中繁殖，釋放毒素所引起，致死率高[10]。其中，大手術(shù)、燒傷、感染等是臨床中并發(fā)膿毒癥的較常見原因[11]。膿毒癥可能會(huì)累及機(jī)體多個(gè)器官功能受到損害，死亡率可達(dá)30%左右[12]。本研究結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠IL-6、TNF-α 和IL-1β 的含量最低，膿毒癥組大鼠IL-6、TNF-α 和IL-1β 的含量最高，miR-494 inhibitor 組大鼠IL-6、TNF-α 和IL-1β 的含量較膿毒組有所降低。病理組織觀察到假手術(shù)組腎組織結(jié)構(gòu)完整，miR-494 inhibitor 組腎小球間質(zhì)增多，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重；模型組與miR-494 inhibitor 組相比，腎小球硬度增加，腎小管周圍組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)更加嚴(yán)重。研究表明miR-494 是一種可以影響細(xì)胞活性的miR，它可根據(jù)細(xì)胞所處的環(huán)境和作用靶點(diǎn)的變化，既可發(fā)揮促凋亡作用，又可發(fā)揮抗凋亡的作用，同時(shí)還可以調(diào)控炎癥因子[13]。研究顯示，miR-494 可以通過多種途徑參與腎缺血再灌注損傷炎癥反應(yīng)的調(diào)控。小鼠腎小管上皮細(xì)胞在經(jīng)過脂多糖刺激后，小鼠體內(nèi)miR-494 的表達(dá)出現(xiàn)異常，多種炎癥相關(guān)因子表達(dá)變化，表明miR-494 參與腎損傷的炎癥反應(yīng)[13]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得出，miR-494 過表達(dá)會(huì)增加大鼠腎組織及細(xì)胞的損傷，從而影響腎功能[15]。同時(shí)，miR-494 能提高膿毒癥大鼠的炎癥因子水平，損傷腎功能，顯微鏡觀察腎組織病理形態(tài)的變化也證明了這一觀點(diǎn)[16]。

圖4 大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡率

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠Scr、BUN 和UTP 水平升高，而miR-494 inhibitor 組上述指標(biāo)有所降低，但仍然比假手術(shù)組高。Scr 與腎小球過濾功能具有關(guān)聯(lián)，Scr 處于非穩(wěn)定期，意味著腎功能發(fā)生改變[17]。有研究指出Scr、BUN 和UTP 水平升高提示腎存在缺血現(xiàn)象，是評(píng)價(jià)腎損傷患者的敏感指標(biāo)[18]。

本研究通過病理、腎小管細(xì)胞凋亡程度和腎組織中NF-κB 蛋白表達(dá)情況表明，miR-494 inhibitor組大鼠中腎小管上皮細(xì)胞的凋亡數(shù)目比模型組少，比假手術(shù)組多；miR-494 inhibitor 組大鼠的NF-κB蛋白表達(dá)比模型組低，但比假手術(shù)組的NF-κB 蛋白表達(dá)高。結(jié)果提示miR-494 能夠通過提高NF-κB 的表達(dá)來促進(jìn)炎癥因子的釋放，進(jìn)而促進(jìn)腎小管細(xì)胞凋亡，加重膿毒癥患者病情。盡管miR-494 對(duì)膿毒癥大鼠的作用機(jī)制目前尚不明確，但許多學(xué)者認(rèn)為NF-κB 通路在此過程成中發(fā)揮重要作用。NF-κB 是一種纖維細(xì)胞產(chǎn)生的促炎癥因子，參與調(diào)節(jié)免疫及炎癥反應(yīng)，也是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡因子，在調(diào)節(jié)腎上皮細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮重要作用。miR-494 是一種能夠參與免疫反應(yīng)的調(diào)控因子，它可以活化組織中的STAT3 和NF-κB 等信號(hào)通路，促進(jìn)NF-κB 的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)炎癥因子的釋放。近些年，關(guān)于miR參與腎病理改變的研究越來越多，在一項(xiàng)關(guān)于對(duì)腎損傷大鼠腎組織的miR 篩查過程中，miR-494 表達(dá)升高，這說明miR-494 與腎損傷存在關(guān)聯(lián)性[19]。細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，在膿毒癥模型中miR-494 表達(dá)升高會(huì)加重模型大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡，對(duì)大鼠皮下注射miR-494 抑制劑后，腎損傷有所緩解[20]。有文獻(xiàn)報(bào)道膿毒癥大鼠腎組織高表達(dá)miR-494，是健康大鼠腎組織中的2～3 倍以上，隨著miR-494 升高，膿毒癥大鼠中炎癥因子水平逐漸升高，病情惡化[21-22]。

綜上所述，miR-494 可能通過提高NF-κB 的表達(dá)，促進(jìn)膿毒癥大鼠炎癥因子的釋放，進(jìn)而加重大鼠的腎損傷程度。