楊 磊，馮貝貝，靳 娟，樊丁宇，劉 晶，克里木·伊明，郝 慶

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所/農(nóng)業(yè)部新疆地區(qū)果樹科學(xué)觀測試驗(yàn)站，烏魯木齊 830091)

新疆氣候獨(dú)特，所產(chǎn)紅棗果實(shí)品質(zhì)極佳，深受市場歡迎，種植紅棗經(jīng)濟(jì)效益較高。近年來，新疆紅棗栽培面積迅速擴(kuò)大，截止 2019 年，面積達(dá) 4.67×105hm2，產(chǎn)量3.728×106t[1]，已成為中國規(guī)模最大的優(yōu)質(zhì)干棗生產(chǎn)基地。然而，隨著栽培面積的快速發(fā)展，裂果對新疆紅棗產(chǎn)業(yè)造成的損失也逐漸凸顯出來。據(jù)調(diào)查，南疆阿克蘇市一般年份因裂果導(dǎo)致紅棗減產(chǎn)30%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)50%[2]。而國內(nèi)其他紅棗主產(chǎn)區(qū)的裂果則更嚴(yán)重，例如，河北滄州金絲小棗產(chǎn)區(qū)因裂果造成的爛果率高達(dá)90%以上[3]。裂果已成為中國紅棗產(chǎn)業(yè)發(fā)展中的主要問題之一[4]。

裂果是一種外界環(huán)境與果實(shí)內(nèi)部生長不協(xié)調(diào)導(dǎo)致的生理疾病，多發(fā)于果實(shí)成熟期[5]。導(dǎo)致棗裂果的因素主要包括外因和內(nèi)因兩大部分[6]。其中，品種是影響裂果的重要因素，不同品種間裂果差異大[6-9]，這些差異由包括果皮組織結(jié)構(gòu)[5-7]、細(xì)胞壁成分[10]和代謝相關(guān)酶活性[8-9]，以及果皮細(xì)胞壁松弛相關(guān)基因[11-15]，合成木質(zhì)素、植物激素信號、植物病原體互作、淀粉和蔗糖代謝相關(guān)基因[16]，茉莉酸生物合成相關(guān)的α-亞麻酸代謝、表皮蠟質(zhì)合成相關(guān)基因[17]等多方面因素造成。

本研究通過調(diào)查棗自然裂果率并結(jié)合浸泡誘裂試驗(yàn)，掌握不同大果形棗品種在新疆的裂果特點(diǎn)，并通過分析不同品種在果實(shí)組織結(jié)構(gòu)、果皮中若干生理指標(biāo)及擴(kuò)展蛋白基因表達(dá)等方面的差異，探討大果形棗品種的裂果與其形態(tài)、生理及擴(kuò)展蛋白基因之間的聯(lián)系，為棗的裂果深入研究提供理論依據(jù)，并為生產(chǎn)中抗裂品種引種栽培及品種選育等方面提供一定的參考和借鑒。

1 材料和方法

1.1 材 料

以新疆喀什地區(qū)葉城縣“新疆農(nóng)科院園藝所葉城果樹試驗(yàn)站”紅棗資源圃內(nèi)7a生‘駿棗’、‘贊新大棗’、‘金谷大棗’、‘蛤蟆棗’、‘晉贊大棗’、‘新鄭大馬牙’6個(gè)品種為對象，于2019年果實(shí)全紅期，每個(gè)品種隨機(jī)采集脆熟的正常棗果，分別裝袋、標(biāo)記，立即進(jìn)行相關(guān)處理試驗(yàn)和指標(biāo)的測定。

1.2 方 法

1.2.1 自然裂果調(diào)查于2019年9月29日，每個(gè)紅棗品種選3株樹，每株樹隨機(jī)選擇樹冠同一部位的一個(gè)側(cè)枝，分別調(diào)查總果實(shí)數(shù)和裂果數(shù)，計(jì)算裂果率。

1.2.2 浸泡誘裂果調(diào)查為了對6個(gè)品種的自然裂果率進(jìn)行對比驗(yàn)證，本研究也設(shè)置了清水浸泡誘裂果實(shí)的試驗(yàn)，分析它們的裂果率差異。以1.1中采集的正常棗果為對象，每個(gè)品種隨機(jī)取30個(gè)果實(shí)，分3份裝入尼龍網(wǎng)袋，浸泡于清水中，保持棗果全部浸沒，分別于浸泡6、12、24、36、48和60 h時(shí)統(tǒng)計(jì)裂果個(gè)數(shù)，計(jì)算裂果率。以未浸泡的正常果實(shí)(0 h)為對照。

1.2.3 果皮細(xì)胞壁成分及代謝相關(guān)酶活性測定以1.1中采集的正常棗果為對象，用削皮刀削取果皮，盡可能不帶果肉，果皮原果膠和可溶性果膠含量采用咔唑比色法測定；纖維素含量及果膠酶、纖維素酶活性采用試劑盒，通過雙抗體夾心法測定，按照試劑盒說明書，提取棗果皮纖維素、果膠酶和纖維素酶液，并分別稀釋相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品后，按照說明快速完成操作。終止反應(yīng)后15 min以內(nèi)，以空白調(diào)零，在450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中纖維素含量及果膠酶和纖維素酶活性。

1.2.4 解剖結(jié)構(gòu)觀察以1.1中采集的正常棗果為對象，每個(gè)品種隨機(jī)取10個(gè)果實(shí)，用手術(shù)刀片切取棗果實(shí)中部位置0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小塊，立即投入FAA(70%乙醇)固定。采用常規(guī)石蠟切片法制片，縱切，切片厚度10 μm，切片制好后放置于Motic BA400 TYPE 102M顯微拍照系統(tǒng)進(jìn)行觀察、拍照。

1.2.5 擴(kuò)展蛋白基因表達(dá)分析根據(jù)棗擴(kuò)展蛋白ZjEXP基因家族中ZjEXP11和ZjEXP12在全紅期果皮中高表達(dá)的研究結(jié)果[15]，本試驗(yàn)中也選擇這兩個(gè)基因進(jìn)行驗(yàn)證。采用改良的LiCl沉淀法提取正常果實(shí)果皮RNA，使用TAKARA公司反轉(zhuǎn)錄酶(RR037)按10 uL體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用Oligo 7.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)引物，選用UBQ 作為內(nèi)參，內(nèi)參上游引物 UBQ-F，內(nèi)參下游引物 UBQ-R (表 1)。以反轉(zhuǎn)錄生成的 cDNA 為模板，使用Roche 480 SYBR Green I進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR。每一個(gè) PCR 反應(yīng)均設(shè)置 3 次重復(fù)。反應(yīng)體系為：SYBR Green Real-timePCR Master Mix(2×) 10 μL，上、下游引物各 1 μL(10 μmol/L)，cDNA 模板 2 μL，加滅菌蒸餾水補(bǔ)至 20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 15 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)。相對表達(dá)量的計(jì)算采用2-ΔΔCt法，應(yīng)用SPSS(version17.0)軟件進(jìn)行方差分析。

表1 本研究所用引物

1.3 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用 Microsoft Excel 2016 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析， SPSS17.0 軟件進(jìn)行差異顯著性測驗(yàn)，LSD法多重比較；ImageJ軟件分析石蠟切片圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同大果棗品種裂果情況比較

6個(gè)大果棗品種在果實(shí)成熟期的自然裂果率由高到低依次為 ‘駿棗’、‘贊新大棗’、‘金谷大棗’、‘蛤蟆棗’、‘晉贊大棗’、‘新鄭大馬牙’(圖1)?？筛鶕?jù)自然裂果率將6個(gè)品種明顯分成兩組，即易裂組(‘駿棗’、‘贊新大棗’、‘金谷大棗’)和抗裂組(‘蛤蟆棗’、‘晉贊大棗’、‘新鄭大馬牙’)。

HA.蛤蟆棗；JZ.晉贊大棗；XZ.新鄭大馬牙；JG.金谷大棗；ZX.贊新大棗；JU.駿棗;下同圖1 不同大果棗品種果實(shí)成熟期自然裂果率HA. Hamazao； JZ. Jinzandazao； XZ. Xinzhengdamaya； JG. Jingudazao； ZX. Zanxindazao； JU. Junzao; the same as belowFig.1 Natural fruit cracking rate of different Ziziphus jujuba cultivars during fructescence

圖2顯示，隨著清水浸泡時(shí)間的延長，不同大果棗品種的裂果率均持續(xù)上升，并以‘駿棗’、‘新鄭大馬牙’和‘贊新大棗’的裂果率增加趨勢較為明顯，‘金谷大棗’較為穩(wěn)定，而‘蛤蟆棗’、‘晉贊大棗’變化相對較平緩(圖2)。其中，在浸泡24 h時(shí)，‘駿棗’、‘新鄭大馬牙’和‘贊新大棗’的裂果率已接近或超過80%，‘金谷大棗’達(dá)到51.11%，‘蛤蟆棗’為31.91%，‘晉贊大棗’僅為27.27%；在浸泡36 h時(shí)，‘駿棗’和‘新鄭大馬牙’的裂果率均超過95%，基本全裂；在浸泡60 h時(shí)，‘晉贊大棗’和‘蛤蟆棗’的裂果率分別為45.45%和59.75%，其余品種裂果率均基本在90%以上。通過浸泡誘裂試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，‘駿棗’、‘新鄭大馬牙’、‘贊新大棗’、‘金谷大棗’易裂果，而‘蛤蟆棗’、‘晉贊大棗’表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗裂果能力。

圖2 不同品種棗果清水浸泡裂果率變化趨勢Fig.2 The trend of fruit cracking rate induced by soaking in water of different Ziziphus jujuba varieties

對比同一品種的自然裂果率和浸泡裂果率發(fā)現(xiàn)，6個(gè)品種中除‘新鄭大馬牙’外，其他5個(gè)品種的浸泡裂果率和自然裂果率表現(xiàn)一致，即‘駿棗’、‘贊新大棗’和‘金谷大棗’為易裂果品種，‘蛤蟆棗’和‘晉贊大棗’為抗裂果品種。而‘新鄭大馬牙’的自然裂果率在6個(gè)品種中最低，僅有2.21%，屬抗裂果品種；但在清水浸泡誘裂試驗(yàn)中屬易裂果品種。

2.2 不同大果棗品種果皮及果肉細(xì)胞形態(tài)比較

6個(gè)大果棗品種的果實(shí)從組織結(jié)構(gòu)方面均可分成 4 部分，由外向內(nèi)依次是角質(zhì)層、表皮層、亞表皮層和果肉薄壁細(xì)胞層(圖3)。其中，角質(zhì)層厚度以‘晉贊大棗’、‘新鄭大馬牙’和‘蛤蟆棗’較高，它們均顯著高于 ‘贊新大棗’，而‘駿棗’和‘金谷大棗’居中，兩者與其余品種均無顯著性差異；各品種果實(shí)表皮層厚度仍以‘晉贊大棗’、‘蛤蟆棗’、‘新鄭大馬牙’較高，‘金谷大棗’居中，‘贊新大棗’和‘駿棗’較低，但在品種間無顯著性差異。果實(shí)亞表皮層厚度以‘新鄭大馬牙’、‘金谷大棗’和‘蛤蟆棗’較高，它們顯著高于‘贊新大棗’、‘晉贊大棗’和‘駿棗’，而前三者之間、后三者之間均無顯著差異；同時(shí)，品種間果肉空腔(CA)占果肉面積比例存在明顯不同，其中‘贊新大棗’最高(51.67%)，‘金谷大棗’和‘駿棗’居中，它們均顯著高于‘晉贊大棗’、‘新鄭大馬牙’和‘蛤蟆棗’，而這3個(gè)品種間無顯著差異(表2)。

A.蛤蟆棗；B.晉贊大棗；C.新鄭大馬牙；D.金谷大棗；E.贊新大棗；F.駿棗；CU.角質(zhì)層；EC.表皮層細(xì)胞；SE.亞表皮層細(xì)胞；FC.果肉細(xì)胞；CA.空腔圖3 不同大果棗品種果皮顯微結(jié)構(gòu)A. Hamazao； B. Jinzandazao； C. Xinzhengdamaya； D. Jingudazao； E. Zanxindazao； F. Junzao; CU. Cuticle; EC. Epidermal cell layer; SE. Second epidermal cell layer; FC. Fruit cell; CA. Cavity areaFig.3 The pericarp microstructures of different Ziziphus jujuba cultivars

表2 6個(gè)品種棗果實(shí)組織特征統(tǒng)計(jì)表

可見，在大果棗果實(shí)組織結(jié)構(gòu)方面，抗裂果品種的角質(zhì)層和表皮層明顯較易裂果品種厚，并且果肉空腔占果肉面積比率明顯較易裂果品種低。這表明裂果率與果實(shí)角質(zhì)層和表皮層厚度，以及果肉空腔比率關(guān)系密切。

2.3 不同大果棗品種果皮細(xì)胞壁成分及代謝相關(guān)酶活性比較

各大果棗果皮纖維素含量從高到低均依次為‘駿棗’、‘新鄭大馬牙’、‘晉贊大棗’、‘蛤蟆棗’、‘金谷大棗’、‘贊新大棗’，前四者之間無顯著差異但均顯著高于‘金谷大棗’，而‘金谷大棗’又顯著高于‘贊新大棗’。各品種果皮纖維素酶活性的表現(xiàn)與纖維素相似，以‘新鄭大馬牙’最高，它與‘駿棗’無顯著差異，但顯著高于其余品種；‘晉贊大棗’、‘蛤蟆棗’、‘金谷大棗’果皮纖維素酶活性之間無顯著差異，但均顯著高于‘贊新大棗’(圖4)。以上結(jié)果說明本研究6個(gè)品種果皮中纖維素含量與纖維素酶活性呈正相關(guān)，但并未發(fā)現(xiàn)二者與裂果率存在明顯的關(guān)聯(lián)?？梢姡w維素含量和纖維素酶活性對裂果是否有影響需要進(jìn)一步研究。

不同小寫字母表示品種間在0.05水平存在顯著性差異，下同圖4 不同大果棗品種果皮纖維素含量及其纖維素酶活性The different normal letters indicate significant difference among cultivars at 0.05 level; the same as belowFig.4 The cellulose content and cellulase activity in pericarp of different Ziziphus jujuba varieties

同時(shí)，各品種果皮原果膠含量由高到低依次為‘新鄭大馬牙’、‘駿棗’、‘贊新大棗’、‘金谷大棗’、‘晉贊大棗’、‘蛤蟆棗’，且品種間多存在顯著性差異(圖5)；可溶性果膠含量以‘駿棗’和‘晉贊大棗’顯著較高， ‘贊新大棗’、‘蛤蟆棗’、‘金谷大棗’居中，‘新鄭大馬牙’最低，與其他品種均存在顯著性差異；果膠酶活性‘蛤蟆棗’最高，其顯著高于‘新鄭大馬牙’，兩者均與其余品種差異顯著， ‘駿棗’和‘贊新大棗’居中，‘晉贊大棗’和‘金谷大棗’較低，且與其余品種差異顯著?？梢?，與易裂果大果棗品種相比，抗裂果品種果膠酶活性較高、原果膠含量更低。

圖5 不同大果棗品種果皮果膠酶活性以及原果膠、可溶性果膠含量Fig.5 Activity of pectinase, contents of protopectin and soluble pectin in pericarp of different Ziziphus jujuba cultivars

2.4 不同大果棗品種果皮中兩個(gè)ZjEXP 基因的表達(dá)差異

棗擴(kuò)展蛋白ZjEXP基因家族中ZjEXP11和ZjEXP12在全紅期果皮中高水平表達(dá)[12]。圖6顯示，6個(gè)大果棗品全紅期種果實(shí)表皮中ZjEXP11的表達(dá)水平以‘贊新大棗’最高，‘金谷大棗’次之，‘駿棗’和‘蛤蟆棗’居中，而‘晉贊大棗’和‘新鄭大馬牙’明顯較低；ZjEXP12的表達(dá)水平以‘金谷大棗’最高，‘贊新大棗’次之，‘駿棗’和‘蛤蟆棗’居中，‘晉贊大棗’和‘新鄭大馬牙’明顯較低(圖6)?？梢?，兩個(gè)基因ZjEXP11和ZjEXP12的表達(dá)模式在6個(gè)大果棗品種中基本一致，抗裂果品種的表達(dá)水平更低，而易裂果品種相對較高。

圖6 ZjEXP11 和 ZjEXP12 在不同大果棗品種果皮中的表達(dá)模式Fig.6 Expression pattern of ZjEXP11 and ZjEXP12 in pericarp of different Ziziphus jujuba cultivars

3 討 論

裂果是一種生理病害，多發(fā)生于果實(shí)成熟期，不同品種間裂果性差異很大[6-9]。本研究根據(jù)6個(gè)大果棗品種自然裂果率和浸泡誘導(dǎo)裂果率的表現(xiàn)，‘駿棗’、‘贊新大棗’、‘金谷大棗’均為易裂果組，‘蛤蟆棗’、‘晉贊大棗’均屬于抗裂果組，而‘新鄭大馬牙’在所有品種中自然裂果率最低，應(yīng)屬抗裂果品種，但在清水浸泡誘裂試驗(yàn)中屬易裂果品種。其中的‘駿棗’為易裂果品種，與前人的研究結(jié)果一致[6, 18]。

本研究中6個(gè)品種棗果實(shí)組織解剖結(jié)構(gòu)均可分成4部分，由外向內(nèi)分別是角質(zhì)層、表皮層、亞表皮層和果肉細(xì)胞層，與大果品種‘壺瓶棗’[10, 19]的結(jié)構(gòu)相近。本研究中的抗裂品種‘晉贊大棗’、‘蛤蟆棗’和‘新鄭大馬牙’比易裂果品種‘駿棗’、‘贊新大棗’、‘金谷大棗’的表皮層和角質(zhì)層明顯厚、果肉空腔占果肉面積比例明顯低。這與前人研究發(fā)現(xiàn)裂果率低的棗品種具有果實(shí)表皮層厚[7]、角質(zhì)層厚[5-6]、果肉空腔少[20]的特點(diǎn)具有一致性。因此，上述特征在棗的引種栽培及抗裂品種選育具有一定的參考價(jià)值。

果實(shí)發(fā)育成熟過程中伴隨著細(xì)胞壁組分的變化，而細(xì)胞壁參與維持細(xì)胞形態(tài)、增強(qiáng)細(xì)胞機(jī)械強(qiáng)度，并且還與細(xì)胞生理活動有關(guān)。細(xì)胞壁組分主要為纖維素、半纖維素和果膠等多糖物質(zhì)。因此，細(xì)胞壁組分與裂果關(guān)系密切。外源噴施CaCl2處理能顯著降低‘壺瓶棗’裂果率，并且裂果率與果皮和果肉中果膠酶活性、纖維素酶活性呈極顯著正相關(guān)，與原果膠含量和纖維素含量呈極顯著負(fù)相關(guān)[10]。而本研究發(fā)現(xiàn)易裂品種中的‘金谷大棗’和‘贊新大棗’纖維素和纖維素酶活性屬于較低水平，可能與果實(shí)裂果存在著負(fù)相關(guān)關(guān)系，但是‘駿棗’的纖維素、原果膠、可溶性果膠含量及其膠纖維素酶活性都處于較高水平，可見導(dǎo)致棗果實(shí)的裂果原因是多因素造成的，需要進(jìn)一步的探究、驗(yàn)證。

EXP家族基因普遍存在于果實(shí)中，是一種植物細(xì)胞壁蛋白，是細(xì)胞壁應(yīng)力松弛的主要因素。它通過破壞細(xì)胞壁聚合物之間的氫鍵而在植物細(xì)胞生長中起重要作用[21]。已有研究發(fā)現(xiàn)，蘋果[11]、番荔枝[13]、榴蓮[14]等果實(shí)的EXP基因的表達(dá)水平與其裂果關(guān)系密切。有研究者為了分析番茄果實(shí)中水誘導(dǎo)開裂的響應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，通過高通量測序建立了lncRNA-mRNA(激素-氧化還原細(xì)胞壁)網(wǎng)絡(luò)，其中SlEXP的轉(zhuǎn)錄過程在該網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著重要作用[22]。在棗基因組中鑒定到了30個(gè)擴(kuò)展蛋白基因，這些基因以不同的密度分布在棗樹12條染色體中的10條中，可分為4個(gè)亞族：19個(gè)ZjEXPAs, 3個(gè)ZjEXPBs, 1個(gè)ZjEXLA, 和 7個(gè)ZjEXLBs，其中ZjEXPA11 和ZjEXPA12 在全紅期果實(shí)中表達(dá)量較高[15]。在本研究中，6個(gè)品種中ZjEXPA11 表達(dá)水平以‘贊新大棗’最高，而ZjEXP12的表達(dá)水平以‘金谷大棗’ 最高，另外4個(gè)品種中ZjEXPA11 和ZjEXP12表達(dá)水平均表現(xiàn)為‘駿棗’>‘蛤蟆棗’>‘晉贊大棗’>‘新鄭大馬牙’，即這兩個(gè)基因表達(dá)水平在抗裂紅棗品種中較低。

番茄的裂果率與細(xì)胞壁和蠟質(zhì)層的厚度以及細(xì)胞壁原膠和纖維素的含量顯著相關(guān)。因?yàn)橥瑫r(shí)抑制番茄果實(shí)中聚半乳糖醛酸酶(SlPG) 和擴(kuò)展蛋白 (SlEXP) 基因的表達(dá)可使 PG 和 EXP蛋白質(zhì)含量降低，進(jìn)而使得果皮中水溶性果膠含量減少，細(xì)胞壁增厚，果實(shí)硬度增加，果皮蠟質(zhì)層變厚，從而降低裂果率[12]。這與本研究中得出的“抗裂果的棗品種有較厚的角質(zhì)層和表皮層，較低的原果膠含量，以及更低的ZjEXP11和ZjEXP12表達(dá)水平”這一試驗(yàn)結(jié)果具有一定的相似性。

另外，本試驗(yàn)中自然成熟的‘新鄭大馬牙’果皮中ZjEXP11和ZjEXP12的表達(dá)量水平都處于最低的狀態(tài)，并且符合角質(zhì)層、表皮層厚且均一，表皮細(xì)胞排列整齊規(guī)則這一抗裂品種的果皮結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。但在浸泡誘裂試驗(yàn)中它的裂果率較高，被劃歸為易裂果品種。根據(jù)‘壺瓶棗’果實(shí)發(fā)育成熟過程中觀察到表皮分布大量微裂隙[23]，并且在果實(shí)吸水開裂中起重要作用的結(jié)果[24]。本研究中‘新鄭大馬牙’果皮原果膠含量和果膠酶活性較其他品種更高，且在浸泡裂果的‘新鄭大馬牙’果實(shí)表面發(fā)現(xiàn)有微小裂紋，因此推測‘新鄭大馬牙’可能是因果皮原果膠含量較高、果膠含量較低，導(dǎo)致果皮形成微小裂隙，從而在浸水后果實(shí)發(fā)生開裂。但在本試驗(yàn)中沒有做這方面的詳細(xì)觀察，這還有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。同時(shí)，裂果是一種數(shù)量性狀，受多基因控制[25]，本研究只選了ZjEXP家族的2個(gè)基因進(jìn)行分析，有較大的局限性。今后有必要借鑒其他果實(shí)裂果基因的研究結(jié)果在棗果上進(jìn)行驗(yàn)證，篩選與棗裂果相關(guān)的基因。