趙麗娟，麻冬梅，王文靜，馬巧利，李嘉文，蘇立娜

(寧夏大學(xué) 西北土地退化與生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地/西北退化生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 銀川 750021)

非生物脅迫，特別是鹽、堿、重金屬、干旱和極端溫度正成為植物充分發(fā)揮遺傳潛力的阻礙，限制了世界范圍內(nèi)的作物產(chǎn)量[1-2]。其中，鹽分是作物生產(chǎn)力最嚴(yán)重的障礙之一，植物中過(guò)量的鹽分表現(xiàn)為滲透脅迫和離子毒性的結(jié)合，造成活性氧的積累而導(dǎo)致氧化脅迫[3]。植物有各種各樣的策略來(lái)應(yīng)對(duì)這些脅迫，包括通過(guò)根系吸收和運(yùn)輸?shù)饺~片來(lái)調(diào)節(jié)離子平衡，積累相容的溶質(zhì)，如碳水化合物和脯氨酸，以及通過(guò)增加抗氧化物酶活性來(lái)清除活性氧，主要包括過(guò)氧化物酶、超氧化物歧化酶等[4]。中國(guó)鹽堿地的面積總量達(dá)9913萬(wàn) hm2，主要分布在東北、華北、西北，鹽堿地的開(kāi)發(fā)利用具有重大價(jià)值[5]，因此，通過(guò)培育耐鹽堿品種來(lái)對(duì)土壤進(jìn)行改良是當(dāng)前研究者密切關(guān)注的問(wèn)題之一。

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是一種優(yōu)良的多年生豆科牧草，在中國(guó)種植廣泛，是最重要的飼用作物之一。因其蛋白質(zhì)含量高、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富、生物產(chǎn)量高，被譽(yù)為“牧草之王”，對(duì)畜牧業(yè)發(fā)展有著十分重要的作用[6，1]。紫花苜蓿對(duì)所處生長(zhǎng)環(huán)境的土壤質(zhì)量要求不高，可以在輕度鹽堿地生長(zhǎng)，是中等耐鹽植物，為改良鹽堿地做出了很大貢獻(xiàn)。但是高濃度鹽脅迫對(duì)苜蓿生長(zhǎng)、根瘤形成和共生固氮能力產(chǎn)生不利影響，嚴(yán)重限制了高鹽環(huán)境下苜蓿的生物量[7]。目前，中國(guó)苜蓿種植區(qū)土壤鹽堿化問(wèn)題嚴(yán)重，導(dǎo)致其產(chǎn)量下降嚴(yán)重，提高苜蓿品種的耐鹽性是提高苜蓿產(chǎn)量的重要方法[8]。

褪黑素(Melatonin，MT)是一種生物刺激因子，屬于吲哚雜環(huán)類化合物，最初在維管植物中發(fā)現(xiàn)，其主要作用是作為一種抗氧化分子，通過(guò)降低活性氧(ROS)、活性氮 (RNS)和調(diào)節(jié)相關(guān)基因來(lái)應(yīng)對(duì)氧化脅迫，增強(qiáng)植物抗逆性[8-9]。迄今，已有許多文獻(xiàn)報(bào)道，褪黑素浸種能有效提高植物的抗逆性，引發(fā)改善植物水分狀況，提高玉米幼苗抗旱性[10]，并顯著緩解高鹽脅迫下紫花苜蓿種子發(fā)芽率的下降[8]以及鈉鉀離子失衡造成的損傷[11]。而在農(nóng)業(yè)耕作中，種子適宜干播的作物只能采用葉面噴施和根灌的方法進(jìn)行相關(guān)處理，其中根灌法對(duì)植物來(lái)說(shuō)是最有效的、最易獲取營(yíng)養(yǎng)的方法。采用根灌法研究褪黑素對(duì)植物在逆境環(huán)境下的影響甚少，為了研究不同濃度褪黑素對(duì)鹽脅迫下紫花苜蓿幼苗生長(zhǎng)和生理指標(biāo)的影響，本試驗(yàn)以紫花苜蓿品種‘中苜1號(hào)’為材料，采用水培根灌褪黑素的方法來(lái)考察褪黑素對(duì)鹽脅迫的緩解作用，為利用褪黑素提高紫花苜蓿耐鹽性和鹽堿地的改良提供了理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料來(lái)源

參試紫花苜蓿(MedicagosativaL.)品種為 ‘中苜1號(hào)’，種子由曹致中老師饋贈(zèng)。選取飽滿種子適量，用2%的次氯酸鈉溶液消毒7 min，期間不斷搖晃，無(wú)菌水沖洗4-5次后，備用。

1.2 鹽和褪黑素濃度篩選

首先，選取40粒種子放置于有3層濾紙的培養(yǎng)皿中，濾紙用不同濃度的氯化鈉(100、125、150、200、250 mmol/L)和褪黑素(5、30、50、80、100、200 μmol/L)分別浸濕，并以去離子水作為對(duì)照，共12個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)。種子先在25 ℃暗培養(yǎng)2 d，然后轉(zhuǎn)至23 ℃/25 ℃、光周期為16 h/8 h條件下進(jìn)行光培養(yǎng)，5 d后，測(cè)量根長(zhǎng)，計(jì)算萌發(fā)率。

其次，選取40粒種子置于有3層濾紙的培養(yǎng)皿中，濾紙用不同濃度(0、5、30、50、80、100、200 μmol/L)的褪黑素和150 mmol/L NaCl共同(v/v=1∶1)浸濕復(fù)合處理，共7個(gè)處理，各處理3次重復(fù)。培養(yǎng)條件同上，5 d后測(cè)量根長(zhǎng)，計(jì)算萌發(fā)率。

1.3 鹽和褪黑素復(fù)合處理

試驗(yàn)設(shè)置8個(gè)處理：CK(對(duì)照，去離子水)、NaCl(150 mmol/L氯化鈉)、MT1(30 μmol/L褪黑素)、MT2(50 μmol/L褪黑素)、 MT3(80 μmol/L褪黑素)、NaCl+MT1(150 mmol/L 氯化鈉+30 μmol/L褪黑素)、NaCl+ MT2(150 mmol/L 氯化鈉+50 μmol/L褪黑素)、NaCl+MT3(150 mmol/L 氯化鈉+80 μmol/L褪黑素)，選取40粒種子置于3層濾紙的培養(yǎng)皿中，濾紙用相應(yīng)褪黑素濃度和鹽濃度配比(v∶v=1∶1)處理液浸濕，培養(yǎng)條件同上，每個(gè)處理3次重復(fù)，將萌發(fā)5 d后的幼苗移至水培盒(127 mm×87 mm×114 mm)進(jìn)行培養(yǎng)，水培液為相應(yīng)褪黑素濃度和鹽濃度配比(v∶v=1∶1)處理液，以去離子水作對(duì)照(CK)，每3 d更換1次水培液，取水培培養(yǎng)7 d的紫花苜蓿幼苗測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 生長(zhǎng)指標(biāo)取水培盒中生長(zhǎng)7 d后的紫花苜蓿幼苗，首先用卷尺測(cè)量幼苗根長(zhǎng)和株高，分離根的樣本，先測(cè)定鮮重，再放入105 ℃烘箱烘干至恒重，稱取干重。分離葉片，采用剪紙稱重法測(cè)定葉面積[12]，葉面積=100×待測(cè)葉葉形紙重量/100 cm2紙重，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.4.2 丙二醛和相對(duì)電導(dǎo)率葉片丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定[13]，測(cè)定532、600、450 nm波長(zhǎng)下的吸光度值OD532、OD600和OD450，依據(jù)公式計(jì)算丙二醛含量[6.45×(OD532-OD600)-0.56×OD450×提取液體積/植物組織鮮重(g)，μmol/g]，每個(gè)處理3次重復(fù)。另外，稱取100 mg葉片浸入去離子水中，并在37 ℃下培養(yǎng)2 h，然后使用電導(dǎo)率儀(STARTER 3100C)測(cè)量溶液的電導(dǎo)率(E1)；將樣品抽真空15 min，冷卻至室溫后測(cè)量總電導(dǎo)率(E2)；使用公式計(jì)算相對(duì)電導(dǎo)率(E1/E2×100)[14]，每個(gè)處理測(cè)量3次重復(fù)。

1.4.3 相對(duì)含水量葉片稱鮮重，然后將葉片浸入蒸餾水中24 h，隨后吸干表面水分，并記錄飽和重。在60 ℃的烘箱中干燥樣品，記錄干重。使用公式估算相對(duì)含水量(RWC)，每個(gè)處理測(cè)量3次重復(fù)。

RWC(%)=[(鮮重-干重)/(飽和重-干重)]×100%

1.4.4 脯氨酸含量和抗氧化酶活性葉片脯氨酸含量測(cè)定采用磺基水楊酸提取，茚三酮比色法測(cè)定，過(guò)氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑法測(cè)定，過(guò)氧化氫酶(CAT)活性采用紫外吸收法測(cè)定，均采用陳建勛所描述的方法[15]，每個(gè)處理測(cè)量3次重復(fù)。

1.4.5 光合指標(biāo)在天氣晴朗的中午9:00～11:00采用便攜式光合作用儀 (Li-6400XT, 美國(guó)) 測(cè)定紫花苜蓿幼苗頂部完全張開(kāi)的葉片的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率，每個(gè)處理測(cè)量3次重復(fù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計(jì)分析用SPSS 22.0，用GraphPad繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度鹽和褪黑素處理下紫花苜蓿種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)情況比較

褪黑素有益于植物的生長(zhǎng)發(fā)育并且具有緩解各種非生物脅迫危害的功能，在進(jìn)行褪黑素緩解鹽脅迫實(shí)驗(yàn)前，需要先篩選出合適的鹽和褪黑素濃度。與對(duì)照相比，各濃度鹽處理紫花苜蓿幼苗根長(zhǎng)均大幅下降，植株明顯矮小，根長(zhǎng)在100和200 mmol/L鹽處理下分別顯著降了75.15%和93.93%(圖1，A、B)；同時(shí)，就種子萌發(fā)率來(lái)看，紫花苜蓿種子在250 mmol/L鹽處理下沒(méi)有萌發(fā)(圖中未顯示)，在100 mmol/L鹽處理下萌發(fā)率無(wú)顯著變化，在125、150、200 mmol/L鹽處理下萌發(fā)率顯著降低，分別達(dá)到85.5%、38.3% 和6.7%(圖1，C)。由于200 mmol/L鹽脅迫后紫花苜蓿幼苗趨近死亡狀態(tài)，最終以150 mmol/L NaCl作為本試驗(yàn)鹽脅迫的最佳濃度。

同時(shí)，為評(píng)價(jià)褪黑素對(duì)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響，進(jìn)一步對(duì)褪黑素處理濃度進(jìn)行篩選。首先，在無(wú)鹽脅迫條件下，紫花苜蓿種子經(jīng)不同濃度的褪黑素(0、5、30、50、80、100、200 μmol/L)處理后，其根系較不處理時(shí)短粗(圖1，D)，種子萌發(fā)率無(wú)明顯變化(圖1，E)。其次，經(jīng)150 mmol/L NaCl與不同濃度褪黑素(v∶v=1∶1)共同施加篩選出褪黑素對(duì)鹽脅迫緩解的最佳濃度。其中，各濃度褪黑素處理紫花苜蓿幼苗生長(zhǎng)情況均比單獨(dú)鹽脅迫處理明顯好轉(zhuǎn)，且30、50、80 μmol/L的褪黑素濃度處理的紫花苜蓿幼苗生長(zhǎng)狀況較好(圖1，F(xiàn))；種子萌發(fā)率均比單獨(dú)鹽脅迫處理顯著提高，但各濃度褪黑素處理間無(wú)顯著差異(圖1，G)；幼苗根長(zhǎng)隨著褪黑素濃度的增加先升高后降低，但各濃度褪黑素處理均比單獨(dú)鹽脅迫處理不同程度提高，并以30、50、80 μmol/L褪黑素處理顯著高于其余處理(圖1，H、I)。因此，適宜濃度褪黑素處理能顯著緩解鹽脅迫對(duì)紫花苜蓿種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)造成的傷害，并以30、50、80 μmol/L褪黑素的效果最好，最終選擇這些濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

A-C.NaCl處理：A.根系形態(tài)；B.根長(zhǎng)；C.萌發(fā)率；D-E.褪黑素處理：D.根系形態(tài); E.萌發(fā)率; F-I. 鹽(150 mmol/L的NaCl)和不同濃度褪黑素復(fù)合處理：F.生長(zhǎng)狀況；G.萌發(fā)率；H.根系形態(tài)；I.根長(zhǎng)；不同的小寫字母表示在處理之間在0.05水平存在顯著性差異，下同圖1 苜蓿種子在不同濃度NaCl、褪黑素及鹽與褪黑素復(fù)合處理5 d 后的萌發(fā)狀態(tài)A-C. NaCl treatment: A. root morphology; B. Root length; C. Germination rate; D-E. Melatonin treatment: D. Root morphology; E. Germination rate; F-I. Salt and melatonin combined treatment: F. Growth status; G. Germination rate; H. Root morphology; 1. Root length; Different normal letters showed significant differences at the level of 0.05; the same as belowFig.1 Germination state of alfalfa seeds under different concentrations of NaCl, melatonin and salt stress combined with melatonin for 5 days

2.2 褪黑素對(duì)鹽脅迫下紫花苜蓿幼苗生長(zhǎng)的影響

表1顯示，紫花苜蓿幼苗所有生長(zhǎng)指標(biāo)(根長(zhǎng)、株高、葉面積、根鮮重和根干重)在單獨(dú)鹽脅迫(150 mmol/L NaCl)下分別比對(duì)照(CK)顯著下降了42.15%、12.4%、38.68%、45.45%和44.61%，而在單獨(dú)褪黑素處理(MT1、MT2、MT3)下均無(wú)顯著變化。與單獨(dú)鹽脅迫處理相比，各鹽與褪黑素復(fù)合處理(NaCl+MT1、NaCl+MT2、NaCl+MT3)紫花苜蓿幼苗的根長(zhǎng)、根鮮重和根干重均顯著增加，并以NaCl+MT2處理增幅最大，分別達(dá)到34.52%、41.93%和19.61%，同時(shí)它們的株高和葉面積也有所提高，且仍以NaCl+MT2處理增幅最大，但增幅均未達(dá)到顯著水平?？梢?jiàn)，紫花苜蓿幼苗生長(zhǎng)受到鹽脅迫(150 mmol/L NaCl)的顯著抑制，卻未受到各濃度褪黑素的影響；各濃度褪黑素有效緩解了鹽脅迫對(duì)紫花苜蓿生長(zhǎng)造成的傷害,并以NaCl+MT2處理效果最佳。

表1 不同濃度外源褪黑素對(duì)鹽脅迫下紫花苜蓿幼苗生長(zhǎng)相關(guān)參數(shù)的變化

2.3 褪黑素對(duì)鹽脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片膜透性的影響

電導(dǎo)率代表植物細(xì)胞的通透性，是衡量植物耐鹽性的重要指標(biāo)，而丙二醛(MDA)是脂質(zhì)氧化的終產(chǎn)物，反映了膜脂過(guò)氧化的程度，這兩指標(biāo)可以間接反映植物膜系統(tǒng)的損傷程度和抗逆性[16]。由圖2可知，與對(duì)照相比，紫花苜蓿幼苗葉片MDA和相對(duì)電導(dǎo)率在各濃度外源褪黑素單獨(dú)處理下大多無(wú)顯著變化，而在單獨(dú)鹽脅迫(150 mmol/L NaCl)下均大幅顯著增加；與單獨(dú)鹽脅迫處理相比，鹽和褪黑素復(fù)合處理紫花苜蓿葉片MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率均顯著降低，并以NaCl+MT3處理的相對(duì)電導(dǎo)率和NaCl+MT2處理的MDA含量最低，它們分別比單獨(dú)鹽脅迫處理顯著降低了31.84%和30.24%，但各復(fù)合處理間均無(wú)顯著差異(圖2，Ⅰ、Ⅱ)。以上結(jié)果表明，鹽脅迫顯著增加了紫花苜蓿細(xì)胞膜系統(tǒng)的透性和膜脂過(guò)氧化程度，而施加外源褪黑素可以有效緩解鹽脅迫下細(xì)胞膜損傷的程度。

圖2 外源褪黑素對(duì)鹽脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛含量(MDA)的變化Fig.2 Effect of exogenous melatonin on relative electrolyte leakage and MDA content in leaves of alfalfa seedling under salt stress condition

2.4 褪黑素對(duì)鹽脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片相對(duì)含水量和脯氨酸的影響

葉片相對(duì)含水量反映了植物在脅迫條件下的葉片水分狀況和存活能力。與對(duì)照相比，紫花苜蓿幼苗葉片相對(duì)含水量在單獨(dú)鹽脅迫處理下顯著降低，而在單獨(dú)褪黑素處理下均無(wú)顯著變化；與單獨(dú)鹽脅迫處理相比，鹽和褪黑素復(fù)合處理(NaCl+MT1、NaCl+MT2、NaCl+MT3)幼苗葉片的相對(duì)含水量均顯著增加，增幅分別為17.05%、15.27%、11.85%，但仍顯著低于對(duì)照(圖3，Ⅰ)；同時(shí)，紫花苜蓿幼苗葉片的脯氨酸含量在單獨(dú)鹽脅迫后比對(duì)照大幅度顯著增加，而在單獨(dú)褪黑素處理后較對(duì)照有一定程度的提高，但未達(dá)到顯著水平；與單獨(dú)鹽脅迫處理相比，紫花苜蓿幼苗葉片的脯氨酸含量在鹽和褪黑素復(fù)合處理下均顯著大幅降低，NaCl+MT1、NaCl+MT2、NaCl+MT3處理分別顯著降低了43.99%、48.35%、37.72%，但各復(fù)合處理間無(wú)顯著差異(圖3，Ⅱ)?？梢?jiàn)，鹽脅迫顯著降低了紫花苜蓿幼苗葉片相對(duì)含水量，卻顯著提高了其脯氨酸含量；單獨(dú)褪黑素處理對(duì)幼苗葉片相對(duì)含水量和脯氨酸含量均無(wú)顯著影響；外源褪黑素處理可顯著提高鹽脅迫幼苗葉片的相對(duì)含水量，卻顯著降低其脯氨酸含量，表明褪黑素不僅可以有效緩解鹽脅迫下細(xì)胞失水危害，也可緩解鹽脅迫下細(xì)胞膜的過(guò)氧化程度。

圖3 外源褪黑素對(duì)鹽脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片相對(duì)含水量和脯氨酸含量的變化Fig.3 Effect of exogenous melatonin on relative water content and proline content in leaves of alfalfa seedling under salt stress condition

2.5 褪黑素對(duì)鹽脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片抗氧化物酶活性的影響

許多研究發(fā)現(xiàn)，與O2相比，部分還原或活化的氧衍生物具有高度的活性和毒性，并能導(dǎo)致細(xì)胞的氧化傷害，這是好氧生物發(fā)展出高效的活性氧(ROS)清除機(jī)制的必然結(jié)果[17-19]，ROS的清除機(jī)制是植物耐鹽機(jī)制的重要組成部分。圖4顯示，在單獨(dú)鹽脅迫處理(NaCl)和褪黑素處理(MT1、MT2、MT3)下，紫花苜蓿幼苗葉片過(guò)氧化物酶(POD)、抗氧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)的活性大多顯著高于對(duì)照；與單獨(dú)鹽脅迫處理相比，鹽和褪黑素復(fù)合處理(NaCl+MT1、NaCl+MT2、NaCl+MT3)幼苗葉片的POD活性分別顯著提高25.66%、31.45%、30.47%，SOD活性分別顯著提高38.04%、41.41%、39.74%，而它們的CAT活性也有增加的趨勢(shì)，但均未達(dá)到顯著水平。以上結(jié)果說(shuō)明，在鹽脅迫條件下，外源褪黑素可誘導(dǎo)紫花苜蓿幼苗葉片POD、SOD活性顯著增強(qiáng)，提高其活性氧的清除能力，減輕鹽脅迫誘導(dǎo)的過(guò)氧化傷害。

圖4 外源褪黑素對(duì)鹽脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片抗氧化物酶活性的變化Fig.4 Effect of exogenous melatonin on antioxidant enzyme activities in leaves of alfalfa seedling under salt stress condition

2.6 褪黑素對(duì)鹽脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片光合作用指標(biāo)的影響

與其他細(xì)胞器相比，葉綠體對(duì)鹽脅迫更敏感[20]，鹽分對(duì)光合作用的影響主要表現(xiàn)在抑制CO2向葉綠體的擴(kuò)散和葉片光化學(xué)的改變[21]。圖5顯示，在單獨(dú)鹽脅迫條件下，紫花苜蓿幼苗葉片凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率較對(duì)照分別顯著下降了25.62%、36.25%和32.91%；MT2和MT3處理的凈光合速率、MT2處理的氣孔導(dǎo)度均顯著高于對(duì)照，而MT1處理的蒸騰速率顯著低于對(duì)照，其余單獨(dú)褪黑素處理光合參數(shù)均與對(duì)照無(wú)顯著差異；與單獨(dú)鹽脅迫處理相比較，鹽和褪黑素復(fù)合處理葉片的各光合參數(shù)均顯著提高，并均以NaCl+MT2處理增幅最高，增幅分別為30.27%、45.1%、42.15%，但各復(fù)合處理之間多無(wú)顯著差異。以上結(jié)果表明，鹽脅迫顯著抑制了紫花苜蓿幼苗光合作用，施加外源褪黑素可有效緩解鹽脅迫造成的危害，對(duì)提高鹽脅迫環(huán)境下植株的光合作用起著至關(guān)重要的作用。

圖5 外源褪黑素對(duì)鹽脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率的變化Fig.5 Effect of exogenous melatonin on net photosynthetic rate, stomatal conductance and transpiration rate of alfalfa seedling under salt stress condition

3 討論與結(jié)論

紫花苜蓿作為天然的優(yōu)質(zhì)牧草，鹽分是限制其正常生長(zhǎng)的非生物脅迫因子之一。王曉春等[22]研究表明，低濃度(0.2%)鹽對(duì)多數(shù)苜蓿種子的萌發(fā)有一定的促進(jìn)作用，但當(dāng)鹽濃度為 0.8% 時(shí)，畸形苗開(kāi)始出現(xiàn)，且根長(zhǎng)明顯縮短，1.2%的鹽濃度是紫花苜蓿耐鹽的極限濃度；‘中苜1號(hào)’在150 mmol/L(約0.88%)鹽處理后，根長(zhǎng)迅速下降，且萌發(fā)率也大幅降低[23]。本研究也表明150 mmol/L NaCl可作為‘中苜1號(hào)’鹽脅迫實(shí)驗(yàn)的最佳濃度。褪黑素是一種在植物進(jìn)化過(guò)程中高度保守的胺類激素，其在植物中既是一種多效性的信號(hào)分子，又是一種有效的抗氧化分子[24]，褪黑素具有劑量依賴性，最佳濃度的褪黑素具有抗環(huán)境脅迫的作用，但不同植物的最適濃度不同。Shakeel的研究發(fā)現(xiàn)，60 μmol/L的外源褪黑素顯著提高了鹽脅迫下玉米的生長(zhǎng)、葉綠素含量、光合效率和抗氧化酶活性，降低了體內(nèi)活性氧(ROS)水平[25]。施用外源褪黑素能有效促進(jìn)金盞菊幼苗對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)性，以 100 μmol/L 褪黑素處理效果最好[26]。本研究發(fā)現(xiàn)緩解紫花苜蓿幼苗鹽脅迫危害的外源褪黑素最佳濃度為50 μmol/L。

已有研究表明，外源褪黑素能提高某些植物的耐鹽性。本試驗(yàn)表明，褪黑素通過(guò)改善鹽脅迫對(duì)幼苗生長(zhǎng)特性的抑制作用，有效地提高了幼苗對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)性。Ahmad[25]和Cen[11]研究發(fā)現(xiàn)，外源褪黑素都顯著減弱了鹽脅迫對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)的抑制作用，本研究進(jìn)一步證實(shí)了前人的研究結(jié)果。已有研究表明，褪黑素誘導(dǎo)根系生長(zhǎng)受生長(zhǎng)素調(diào)節(jié)生理過(guò)程的調(diào)控，影響根系對(duì)水分的吸收，啟動(dòng)細(xì)胞壁不可修復(fù)的延伸[27]。本研究結(jié)果與前人在鹽脅迫條件下施用褪黑素增加油菜種子根長(zhǎng)的研究結(jié)果一致[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫下施加外源褪黑素處理與單獨(dú)鹽脅迫處理相比，紫花苜蓿幼苗的根長(zhǎng)和根鮮重分別顯著增加了34.52%和41.93%，增加幅度明顯比其他生長(zhǎng)指標(biāo)更大，這可能與本研究通過(guò)水培根灌法將褪黑素直接作用于紫花苜蓿幼苗根部相關(guān)。光合作用是植物一項(xiàng)重要的生理功能[29]，在鹽脅迫下植物的一個(gè)重要反應(yīng)是關(guān)閉氣孔以減少水分的損失，從而限制了光合作用，已有眾多研究表明褪黑素可緩解鹽脅迫對(duì)光合作用的抑制作用[25,30]。本研究結(jié)果也表明外源褪黑素使得紫花苜蓿幼苗葉片凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率較鹽脅迫處理都顯著增加，有效緩解了鹽脅迫對(duì)光合作用的抑制程度。因此，適量施用外源褪黑素可以有效改善氣孔的功能，使植物在鹽脅迫下重新打開(kāi)氣孔，對(duì)氣孔限制的緩解有助于鹽脅迫下光合作用的增強(qiáng)。

本研究發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫處理下，紫花苜蓿幼苗葉片丙二醛和相對(duì)電導(dǎo)率都顯著增加，而施加外源褪黑素可以顯著降低這兩個(gè)指標(biāo)的增幅，有效緩解鹽脅迫下膜損傷的程度，維持植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。同樣，外源褪黑素處理可顯著降低鹽脅迫下月季葉片的相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛含量[31]。前人研究表明，外源褪黑素也可以減輕鹽脅迫條件下小麥幼苗的水分損失[32]；本研究結(jié)果表明，鹽脅迫下施加褪黑素提高了紫花苜蓿幼苗葉片相對(duì)含水量，減輕水分損失；并有效改善了鹽脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片脯氨酸含量，這與李紅杰的研究結(jié)果相似[30]。有研究表明，褪黑素具有兩親性，能進(jìn)入亞細(xì)胞部分，使其具有更強(qiáng)的抗氧化作用；除此之外，與褪黑素相關(guān)的代謝產(chǎn)物也具有抗氧化作用，能夠減輕由非生物脅迫引起的活性氧的產(chǎn)生以及增加抗氧化物酶活性[33]。在本研究中，施加外源褪黑素顯著增強(qiáng)了鹽脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片POD和SOD活性，而其CAT活性雖有增加趨勢(shì)，但增幅未達(dá)到顯著水平。在眾多研究中，外源褪黑素處理都顯著提高了以上3個(gè)抗氧化酶的活性，從而增強(qiáng)了植株活性氧的清除能力[11,25,30-31]。因此，應(yīng)用褪黑素可以降低鹽介導(dǎo)的活性氧對(duì)紫花苜蓿幼苗的有害影響，提高植物對(duì)逆境的抗性。

綜上所述，在鹽脅迫條件下，紫花苜蓿幼苗葉片抗氧化物酶活性顯著降低，活性氧的積累增加，細(xì)胞膜質(zhì)結(jié)構(gòu)受到破壞，膜透性增加，植株光合作用效率以及生長(zhǎng)受到顯著抑制。外源褪黑素處理可顯著提高鹽脅迫下紫花苜蓿幼苗體內(nèi)POD和SOD活性，從而減少ROS的積累，顯著降低MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率，增強(qiáng)抗氧化防御系統(tǒng)活性，最終顯著提高了紫花苜蓿幼苗的光合作用效率，促進(jìn)植株生長(zhǎng)，從而表現(xiàn)出一定的耐鹽脅迫能力。在本研究的150 mmol/L NaCl脅迫條件下，施用50 μmol/L外源褪黑素最有利于緩解紫花苜蓿幼苗受到的鹽脅迫傷害，顯著增強(qiáng)其耐鹽性，對(duì)植株生長(zhǎng)產(chǎn)生積極影響。