李莉，李碩

（中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京100050）

0 引言

特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品由于食用人群的特殊性[1]，質(zhì)量安全問(wèn)題一直受到消費(fèi)者的高度關(guān)注。黃曲霉毒素、赭曲霉毒素和雜色曲霉素等真菌毒素，對(duì)人體具有潛在的致癌性[2]，如果產(chǎn)品原料質(zhì)量和生產(chǎn)環(huán)節(jié)把控不嚴(yán)格，就有可能造成終產(chǎn)品被真菌毒素污染。目前食品中真菌毒素的檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法[3-6]、高效液相色譜法[7-10]、液質(zhì)譜聯(lián)用法[11-15]。液質(zhì)聯(lián)用和快速樣品前處理技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用[16-19]，具有高靈敏度和優(yōu)異的選擇性，應(yīng)用優(yōu)勢(shì)日益突出。本文建立了直接通過(guò)式固相萃取結(jié)合UPLC-MS/MS技術(shù)檢測(cè)特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中8種真菌毒素的方法，該方法簡(jiǎn)便快速，可操作性強(qiáng)，可以實(shí)現(xiàn)特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中多種黃曲霉毒素的同時(shí)快速篩查。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LCMS-8060型超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，日本島津公司；AL 204型分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；超聲波清洗器，江蘇昆山市超聲儀器有限公司；渦旋混勻器，美國(guó)Scientific Industries公司；CF 16RXII離心機(jī)，日本日立公司；MG-2200氮吹儀，日本東京理化公司；超純水純化系統(tǒng)，德國(guó)賽多利斯公司。黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)、黃曲霉毒素B2(aflatoxin B2，AFB2)、黃曲霉毒素G1(aflatoxin G1，AFG1)、黃曲霉毒素G2(aflatoxin G2，AFG2)、黃曲霉毒素M1(aflatoxin M1，AFM 1)、黃曲霉毒素M2(aflatoxin M2，AFM 2)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（10μg/mL），青島普瑞邦公司；雜色曲霉素(Sterigmatocystin，ST)標(biāo)準(zhǔn)溶液（50μg/mL），青島普瑞邦公司；赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)標(biāo)準(zhǔn)溶液（10μg/mL），青島普瑞邦公司；乙腈（色譜純），德國(guó)默克公司；甲酸（質(zhì)譜級(jí)），F(xiàn)isher Scientific公司；Captiva EMR-Lipid萃取管（3 mL），Agilent公司；ISOLUTE Myco固相萃取柱（3 mL），Biotage公司；MPFC-QuEChERS超濾型凈化柱（高脂類），北京綠綿科技有限公司；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水；特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品，市售。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確移取AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM 1、AFM 2混合標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL，ST標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 m L，OTA標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM 1、AFM 2質(zhì)量濃度為2μg/mL、OTA和ST質(zhì)量濃度為1μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，-20℃避光保存。臨用時(shí)以空白基質(zhì)提取液將上述標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋為系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品的提取

精密稱取2.5 g（精確至0.001 g）樣品于50 mL具塞離心管中（對(duì)于加標(biāo)樣品，加入所需體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液），加入20 mL乙腈-水(80∶20，v/v)提取溶液，旋渦混勻30 s，室溫下超聲提取30 min，隨后經(jīng)8000 r/min離心5 min，取上清液待凈化。

1.3.2 樣品的凈化

移取上清液2 mL至Captiva EMR-Lipid萃取管，保持每秒1滴的流速，收集全部流出液，氮?dú)獯蹈?。?.5 mL乙腈-水溶液（50∶50，v/v）復(fù)溶，渦旋混合1 min，過(guò)0.22μm聚四氟乙烯微孔濾膜，作為待測(cè)溶液。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Aglient Infinity Poroshell 120 SB-C18（100 mm×2.1 mm，2.7μm）；流動(dòng)相A：A為含有0.1%甲酸的水溶液，B為含有0.1%甲酸的乙腈溶液，梯度洗脫，流速為0.3 mL/min，柱溫：40℃，洗脫程序：0～1 min，10%～20%B；1～9 min，20%～40%B；9～10 min，40%～95%B；10～14 min，95%B；14～16 min，10%B。進(jìn)樣量為5μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描模式：正離子模式；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式；霧化氣流量3 L/min，干燥氣流量10 L/min，加熱氣流量10 L/min，DL管溫度250℃，加熱塊溫度400℃，接口溫度300℃，接口電壓4.0 k V。其他質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1 各化合物質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

使用各化合物質(zhì)量濃度為100 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，在ESI離子源條件下采用直接進(jìn)樣的方式分別進(jìn)行正負(fù)離子掃描。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明8種化合物均在正離子模式下有更好的響應(yīng)，因此選擇ESI+模式。根據(jù)目標(biāo)化合物的[M+H]+母離子，在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件下進(jìn)一步優(yōu)化質(zhì)譜條件，選擇響應(yīng)最強(qiáng)的2個(gè)子離子，得到使子離子響應(yīng)最優(yōu)的三重四級(jí)桿Q 1和Q 2的電壓以及碰撞能。最終確定的質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件參數(shù)如表1所示。

2.2 色譜條件優(yōu)化

由于8種真菌毒素是極性或者弱極性化合物，常用選用C18色譜柱，水與乙腈或甲醇混合作為流動(dòng)相進(jìn)行色譜分離。流動(dòng)相中添加甲酸可提高目標(biāo)化合物的離子化效率，提高質(zhì)譜檢測(cè)的靈敏度。本研究對(duì)比了Aglient Poroshell 120 SB-C18柱(2.1 mm×100 mm，2.7μm)、Waters BEH C18柱(2.1 mm×100 mm，1.7μm)、Waters HSS T 3(2.1 mm×100 mm，1.8μm)柱在以0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈為流動(dòng)相時(shí)的分離效果，發(fā)現(xiàn)Aglient Poroshell 120 SB-C18柱更適合8種真菌毒素的快速分析，該柱填充2.7μm實(shí)心C18填料，其中實(shí)心內(nèi)核為1.7μm，多孔外層為0.5μm，多孔外層和實(shí)心內(nèi)核限制了擴(kuò)散，提高了分離速度，而窄粒徑分布則提高了柱效和分離度，從而得到更好的分離效果和色譜峰峰型。8種真菌毒素總離子流色譜如圖1所示。

圖1 8種真菌毒素總離子流色譜

2.3 提取溶劑的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，黃曲霉毒素、雜色曲霉素和赭曲霉毒素常用的提取溶劑為乙腈或甲醇，在乙腈或甲醇中加入適量的水能夠促進(jìn)溶劑滲透到基質(zhì)內(nèi)部，提高真菌毒素的提取效率。此外，乙腈比甲醇具有較強(qiáng)的蛋白沉淀能力，當(dāng)樣品基質(zhì)中蛋白質(zhì)含量較多時(shí)，選取乙腈-水的混合溶液作為提取溶劑效果更好。因此，本研究以特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品為樣品，通過(guò)空白基質(zhì)加標(biāo)的方式，考察60%乙腈水溶液、70%乙腈水溶液、80%乙腈水溶液和90%乙腈水溶液作為提取溶劑對(duì)于待測(cè)化合物回收率的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，使用80%乙腈水溶液作為提取劑時(shí)8種真菌毒素的加標(biāo)的回收率結(jié)果在64%～89%之間，可以滿足實(shí)驗(yàn)要求。

圖2 不同提取溶液對(duì)8種真菌毒素回收率的影響

2.4 樣品凈化方法的選擇

特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中蛋白質(zhì)、脂類和糖類等物質(zhì)含量較高，是影響質(zhì)譜測(cè)定靈敏度的主要干擾基質(zhì)，因此必須通過(guò)適當(dāng)?shù)膬艋椒右匀コ?。目前常用的?fù)雜樣品中真菌毒素的凈化方法有免疫親和柱法、SPE、QuEChERS技術(shù)等，其中免疫親和柱價(jià)格昂貴，且只適用于單一或特定的化合物類別或樣品類型，不適合多種毒素的同時(shí)測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)對(duì)常規(guī)SPE凈化柱（ISOLUTE Myco）、直接通過(guò)式凈化柱（EMR-Lipid萃取管）和QuEChERS凈化技術(shù)（MPFC-QuEChERS）3種不同凈化方法的凈化效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，QuEChERS方法能夠高效、快速的萃取多類別的化合物，但同時(shí)也會(huì)萃取出大量基質(zhì)（尤其是脂質(zhì)），從而導(dǎo)致雜色曲霉素和赭曲霉毒素A基質(zhì)效應(yīng)明顯、回收率偏低。常規(guī)的SPE凈化方法對(duì)于黃曲霉毒素類化合物的凈化效果要優(yōu)于直接通過(guò)式凈化柱和QuECh-ERS方法，但是操作上需經(jīng)過(guò)活化、上樣洗脫和淋洗等多個(gè)步驟，操作繁瑣，且個(gè)別目標(biāo)物的加標(biāo)回收率過(guò)低，不適用復(fù)雜樣品的快速分析。EMR-Lipid萃取管雖然對(duì)于黃曲霉毒素類物質(zhì)的加標(biāo)回收率不如其他兩種凈化方法，但是對(duì)于雜色曲霉素和赭曲霉毒素A的加標(biāo)回收率要優(yōu)于其他兩種凈化方法，綜合考慮8種目標(biāo)化合物的結(jié)果，EMR-Lipid萃取管凈化方法的加標(biāo)回收率均＞60%，滿足實(shí)驗(yàn)要求[19]。此外直接通過(guò)式凈化柱無(wú)需活化、洗脫和淋洗，可大大縮短凈化時(shí)間，因此選擇EMR-Lipid萃取管作為樣品前處理的凈化方法。

圖3 不同凈化方法對(duì)8種真菌毒素回收率的影響

2.5 方法研究及結(jié)果分析

2.5.1 線性范圍、回歸方程和檢出限

在質(zhì)譜分析中，基質(zhì)效應(yīng)會(huì)嚴(yán)重影響痕量水平目標(biāo)化合物定量分析的準(zhǔn)確性[20]。為了補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果帶來(lái)的影響，本研究采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行目標(biāo)化合物定量分析。將不含待測(cè)物的空白樣品按照1.3步驟進(jìn)行處理得到空白基質(zhì)溶液，用空白基質(zhì)溶液稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液得到系列濃度的基質(zhì)加標(biāo)溶液，上機(jī)測(cè)定。以8種真菌毒素的質(zhì)量濃度(ng/mL)為橫坐標(biāo)，定量離子峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算目標(biāo)化合物信號(hào)響應(yīng)和噪聲的比值S/N，得到方法檢出限(limit of detections，LOD，S/N=3)和定量限(limit of quantifications，LOQ，S/N=10)，結(jié)果如表2所示。6種黃曲霉毒素在0.5～20 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)、雜色曲霉素和赭曲霉素A在0.25～10 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)r＞0.992，8種真菌毒素的檢出限為0.06～2.1μg/kg，定量限為0.2～2.9μg/kg。

表2 8種真菌毒素的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.5.2 方法的回收率及精密度

向空白樣品添加低、中、高3個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，按照方法給出的步驟進(jìn)行樣品提取、凈化及上機(jī)檢測(cè)，計(jì)算目標(biāo)化合物的加標(biāo)回收率。每個(gè)加標(biāo)濃度平行測(cè)定6份，用測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差評(píng)價(jià)精密度（relative standard deviation，RSD）?；厥章屎途芏冉Y(jié)果如表3所示。由表3可以看出，8種真菌毒素的平均回收率為92.2%～108.9%，RSD小于15%。

表3 回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.5.3 實(shí)際樣品檢測(cè)

按照本實(shí)驗(yàn)建立的方法對(duì)購(gòu)自不同產(chǎn)地和廠家的15份特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品進(jìn)行檢測(cè)，15批樣品中均未檢出8種真菌毒素。

3 結(jié) 論

本研究建立了采用新型固相萃取前處理方法結(jié)合液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)技術(shù)同時(shí)測(cè)定特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中多種類真菌毒素的快速篩查方法。直接通過(guò)式EMR-Lipid萃取管省去了常規(guī)萃取柱活化、洗脫和淋洗的步驟，可大大縮短凈化時(shí)間，提高檢測(cè)的效率，可以實(shí)現(xiàn)批量樣品的快速檢測(cè)。該方法簡(jiǎn)化了分析步驟，操作簡(jiǎn)便快捷，同時(shí)具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，能滿足特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中真菌毒素污染水平的監(jiān)測(cè)和產(chǎn)品質(zhì)量控制工作的需要。