熊 璐，苑雪萍，徐 沖，許 琳，韓旭東

北京市中關村醫(yī)院病理科,北京 100190

卵巢癌是嚴重威脅婦女健康的惡性腫瘤。盡管近年來卵巢癌的手術和化學療法取得了較大進步，但是其發(fā)病率和病死率仍呈逐年上升的趨勢。全世界每年新診斷出超過23萬例患者和超過15萬名女性死于卵巢癌[1-3]，卵巢癌患者的5年存活率僅為47%[4]。關于卵巢癌的治療，腫瘤細胞減滅手術和化療藥物鉑類、紫杉醇等治療是晚期卵巢癌患者的一線療法。這種標準治療方案在晚期卵巢癌中的完全反應率可達40%～60%，但是在18個月后復發(fā)的患者超過了90%，并且出現(xiàn)對化療藥物耐藥，最終死于卵巢癌[5]。由此可見，卵巢癌的預后仍有待進一步提高，探索新的治療靶點和手段是十分必要的。

隨著腫瘤免疫治療的進展，腫瘤與免疫的相關性受到越來越多的重視，腫瘤中浸潤的免疫細胞水平與腫瘤生長、進展和患者結局有關，成為近年研究的焦點[6-7]。從免疫學角度看，卵巢癌患者紊亂的免疫功能在腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[8-9]。有學者提出了從復雜組織的基因表達譜中計算免疫細胞組成的方法，該方法在結直腸癌、肺癌、濾泡淋巴瘤中通過流式細胞術得到很好的驗證，能大規(guī)模應用于基因表達譜數(shù)據(jù)的分析[10-11]。本研究利用GEO數(shù)據(jù)庫中卵巢癌的表達譜數(shù)據(jù)，通過R軟件計算了卵巢癌樣本中免疫細胞的組成，并進一步分析了免疫細胞浸潤與卵巢癌預后的關系。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)來源 本研究的卵巢癌芯片數(shù)據(jù)來源于GEO數(shù)據(jù)庫的GSE63885數(shù)據(jù)集，GSE63885數(shù)據(jù)集中包含101例卵巢癌患者的組織RNA-seq測序數(shù)據(jù)(由GPL570平臺注釋)。本課題組下載該數(shù)據(jù)集RNA-seq的Counts矩陣，同時還包括患者臨床分期、病理分級、生存狀態(tài)、生存時間等信息。

1.2方法

1.2.1ssGSEA免疫基因集分析及免疫評分 通過ssGSEA算法計算每個樣本的免疫浸潤程度，下載分析所需要的gmt格式基因集數(shù)據(jù)后，使用R包GSVA對GSE63885中的樣本進行免疫評分，共包含29項免疫相關評分。

1.2.2預后分析 使用survival程序包分析各項免疫評分與生存預后的關系。根據(jù)各項評分的中位數(shù)(作為界值)將患者分為高分組和低分組，然后篩選高分組與低分組預后生存情況差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)的免疫評分項并繪制生存曲線進行展示。

1.2.3采用Cibersort軟件計算免疫細胞構成 采用limma應用程序包的Normalize Between Arrays函數(shù)對GSE63885卵巢癌測序數(shù)據(jù)進行校正，即組間歸一化處理，校正后的數(shù)據(jù)通過Cibersort軟件的“反卷積法”得到22種免疫細胞在腫瘤組織中的占比數(shù)據(jù)，根據(jù)P<0.05篩選預測合格的樣本，繪制免疫細胞占比相關性熱圖，同時根據(jù)與預后相關的免疫評分項進行分組，繪制免疫浸潤細胞小提琴圖。

2 結 果

2.1卵巢癌樣本臨床信息 本研究項目的數(shù)據(jù)共包括101例卵巢癌患者信息。病理分級方面，G3的患者居多(占50.5%)；臨床分期中，Ⅲ期患者較多(占63.4%)。此外，從乳腺癌易感基因1(BRCA1)和TP53基因突變情況可知，TP53基因突變是卵巢癌患者的主要特征，85.1%的患者檢測到突變位點，另有30.7%的患者有BRCA1突變。見表1。

表1 卵巢癌患者臨床信息[ n(%)]

續(xù)表1 卵巢癌患者臨床信息[ n(%)]

2.2卵巢癌樣本免疫評分 101例卵巢癌樣本的免疫評分熱圖見圖1。免疫細胞相關基因集有樹突狀細胞(DCs，分為aDCs、iDCs、pDCs)、抗原呈遞(共抑制)細胞(APC co-inhibition)、抗原呈遞(共刺激)細胞(APC co-stimulation)、B細胞、CD8+T細胞、巨噬細胞、肥大細胞、中性粒細胞、自然殺傷(NK)細胞、共抑制T細胞(T cell co-inhibition)、共刺激T細胞(T cell co-stimulation)、輔助性T細胞(Th細胞，分為Th1細胞和Th2 細胞)、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、濾泡輔助性T細胞(Tfh)、調(diào)節(jié)T細胞(Treg)；免疫分子相關基因集有趨化因子受體(CCR)、檢查點(Check point)、細胞活化因子(Cytolytic activity)、人類白細胞抗原(HLA)、副炎癥(Parainflammation)、促炎性因子(Inflammation promoting)、主要組織相容性復合體1(MHC classⅠ)、Ⅰ性干擾素(TypeⅠ IFN reponse)、Ⅱ性干擾素(Type Ⅱ IFN reponse)。

注：cells表示細胞；Mast cells為肥大細胞；Macrophages為巨噬細胞；Neutrophils為中性粒細胞。

2.3免疫評分預后分析 以各項免疫評分的中位數(shù)為界值，將患者分為高、低分組，結合患者的生存時間和生存狀態(tài)數(shù)據(jù)，采用Kaplan-Meier Log-rank法對各項免疫評分與生存預后的關系進行分析。Tfh評分與患者的生存預后相關(P=0.026 7<0.05)，見圖2，高Tfh評分組患者較低分組生存預后更佳。

圖2 Tfh評分相關生存曲線

2.4卵巢癌免疫細胞浸潤分析 通過Cibersort軟件獲得各樣本的免疫細胞浸潤比例，共66例樣本符合篩選標準(P<0.05)，繪制66例樣本的免疫細胞占比柱狀圖和免疫細胞占比相關性熱圖。卵巢癌組織中浸潤水平較高的細胞是M2型巨噬細胞(0.180±0.085)%、漿細胞(0.114±0.090)%、CD8+T細胞(0.105±0.066)%。在卵巢癌組織中，免疫細胞占比相關系數(shù)(r)較大的包括γδT細胞和嗜酸性粒細胞(r=0.63，P<0.05)，嗜酸性粒細胞和Tfh(r=0.65，P<0.05)，Tfh分別與M1型巨噬細胞、γδT細胞呈較強正相關(r=0.54，P<0.05)，B記憶細胞和未成熟的B細胞呈負相關性(r=-0.51，P<0.05)，見圖3。

注：B cells naive為未成熟的B細胞；B cells memory為記憶B細胞；Plasma cells為漿細胞；T cells CD8為CD8+T細胞；T cells CD4 naive為未成熟的CD4+T細胞；T cells CD4 memory resting為靜息記憶CD4+T細胞；T cells CD4 memory activated為活化記憶CD4+T細胞；T cells follicular helper為Tfh；Tregs為調(diào)節(jié)性T細胞；T cells gamma delta為γδT細胞;NK cells resting為靜息NK細胞；NK cells activated為活化NK細胞；Moncytes為單核細胞；Macrophages為巨噬細胞；Dendritic cells resting為靜息樹突細胞；Dendritic cells activated為活化樹突細胞；Mast cells resting為靜息肥大細胞；Mast cells activated為活化肥大細胞；Eosinophils為嗜酸性粒細胞;Neutrophils為中性粒細胞；**表示P<0.01，*表示P<0.05。

根據(jù)Tfh評分將患者分為Tfh高分組和低分組，比較兩組間的免疫細胞浸潤情況差異，繪制小提琴圖，見圖4。Tfh高分組的漿細胞、活化的NK細胞、M1型巨噬細胞浸潤程度明顯高于低分組(P<0.05)，而M2型細胞的浸潤程度則明顯低于低分組(P<0.05)。

注：B cells naive為未成熟的B細胞；B cells memory為記憶B細胞；Plasma cells為漿細胞；T cells CD8為CD8+T細胞；T cells CD4 naive為未成熟的CD4+T細胞；T cells CD4 memory resting為靜息記憶CD4+T細胞；T cells CD4 memory activated為活化記憶CD4+T細胞；T cells follicular helper為Tfh；Tregs為調(diào)節(jié)性T細胞；T cells gamma delta為γδT細胞;NK cells resting為靜息NK細胞；NK cells activated為活化NK細胞；Moncytes為單核細胞；Macrophages為巨噬細胞；Dendritic cells resting為靜息樹突細胞；Dendritic cells activated為活化樹突細胞；Mast cells resting為靜息肥大細胞；Mast cells activated為活化肥大細胞；Eosinophils為嗜酸性粒細胞;Neutrophils為中性粒細胞；**表示P<0.01，*表示P<0.05。

3 討 論

本研究利用GEO數(shù)據(jù)集中卵巢癌患者的基因表達數(shù)據(jù)進行免疫評分，根據(jù)免疫評分中位數(shù)將卵巢癌患者分為高分組和低分組，發(fā)現(xiàn)Tfh評分與卵巢癌患者的生存預后相關，Tfh高分組患者較低分組預后更佳。Tfh是輔助B細胞功能的主要T細胞亞群，可通過抗原呈遞與新激活的B細胞相互作用，Tfh與自身免疫性疾病、免疫缺陷和腫瘤等疾病密切相關。研究表明，Tfh在乳腺癌的炎性浸潤灶內(nèi)大量存在，Tfh的存在可以改善存活率，同時減弱免疫抑制[12]。在大腸癌中也有浸潤性Tfh的報道，其水平與患者的生存時間呈正相關[13-14]。結合本研究的結果進行分析，Tfh在腫瘤組織中的高水平浸潤可能有利于患者的預后。

本研究通過Cibersort軟件分析了卵巢癌組織中免疫細胞的浸潤比例，結果發(fā)現(xiàn)浸潤水平最高的是M2型巨噬細胞。巨噬細胞是具有可塑性和多能性的免疫細胞，M2型巨噬細胞可分泌抑制性細胞因子白細胞介素(IL)-10和轉化生長因子-β(TGF-β)等，從而下調(diào)免疫應答[15]。在腫瘤免疫微環(huán)境中，M2型巨噬細胞與腫瘤細胞免疫逃逸的發(fā)生密切相關。既往研究顯示，卵巢癌細胞分泌多種細胞因子，使血液中的單核細胞聚集在卵巢癌組織中并分化為巨噬細胞。卵巢癌細胞可以分泌大量的巨噬細胞集落刺激因子-1(CSF-1)，從而誘導巨噬細胞向M2巨噬細胞極化[16]。Tfh高分組中漿細胞、活化的NK細胞、M1型巨噬細胞浸潤程度明顯高于低分組，而M2型巨噬細胞的浸潤程度則明顯低于低分組。通過對M2巨噬細胞的特異性標記分子進行免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn)，M2巨噬細胞的數(shù)量越多，晚期卵巢癌患者的預后就越差[17]。通過對卵巢癌的M1和M2巨噬細胞進行免疫組織化學分析發(fā)現(xiàn)，M1/M2巨噬細胞比例較高的患者預后較好，這表明M2型巨噬細胞在卵巢癌的進展中起重要作用[18]。NK細胞是具有直接殺傷功能的天然免疫效應細胞，在清除腫瘤細胞中起關鍵作用，其潛在的癌癥免疫治療靶點引起人們的廣泛關注[19-20]。本研究也顯示，在Tfh高分組中活化NK細胞的浸潤水平明顯高于低分組，這可能也是Tfh高分組患者預后更好的原因。

本研究通過ssGSEA方法和Cibersort軟件，利用基因表達數(shù)據(jù)分析卵巢癌免疫細胞浸潤情況及其與預后的關系，發(fā)現(xiàn)卵巢癌中存在不同程度的免疫細胞浸潤，Tfh可能為影響卵巢癌患者預后的因素。同時這種方法可以為研究免疫細胞浸潤情況與腫瘤的關系提供新的研究手段。