張建新，田 珍

1.荊門市第二人民醫(yī)院消化內(nèi)一科，湖北荊門 448000；2.荊門市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北荊門 448000

胃癌是全世界與癌癥相關(guān)的死亡的第二大最常見原因[1]。腹膜是胃癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的最常見部位，由腹膜癌細(xì)胞擴(kuò)散引起的惡性腹水與不良預(yù)后有關(guān)[2]。目前，尚無可靠的預(yù)測因素可預(yù)測胃癌患者發(fā)生腹膜惡性腹水。微小RNA(miRNA)是長度為19～23個核苷酸的非編碼RNA，可作為基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)子，并在許多生物學(xué)過程的控制中發(fā)揮重要作用，包括細(xì)胞分化、增殖和凋亡[3]。外泌體是小膜狀囊泡，與細(xì)胞免疫反應(yīng)有關(guān)，包含大量的RNA，并且可能參與免疫非依賴性調(diào)節(jié)機(jī)制[4]。含有miRNA的外泌體代表了一種新的細(xì)胞間信號傳導(dǎo)機(jī)制，對其進(jìn)行研究有助于更加深入地了解癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移至腹膜的機(jī)制[5]。TOKUHISA等[6]發(fā)現(xiàn)，胃癌腹膜轉(zhuǎn)移患者腹腔灌洗液外泌體中miR-21、miR-320c、miR-1225-5p的相對表達(dá)水平異常。然而，對腹腔灌洗液外泌體中miR-21、miR-320c、miR-1225-5p的診斷價值仍然所知甚少?；诖?，本研究旨在探討腹腔灌洗液外泌體中miR-21、miR-320c、miR-1225-5p檢測對胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的診斷價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2017年5月至2020年6月荊門市第二人民醫(yī)院收治的胃癌患者298例納入研究。其中胃癌腹膜轉(zhuǎn)移患者87例作為轉(zhuǎn)移組，男57例、女30例，平均年齡(57.32±21.45)歲；胃癌非腹膜轉(zhuǎn)移患者132例作為無轉(zhuǎn)移組，男94例、女38例，平均年齡(58.43±19.60)歲，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移71例、血行轉(zhuǎn)移61例。胃癌預(yù)后良好患者79例作為對照組，男59例、女20例，平均年齡(57.04±20.85)歲。所有納入研究的患者均已通過對從原發(fā)灶獲取的組織活檢樣品的病理學(xué)檢查診斷為胃癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有嚴(yán)重心、肝、腎功能損害者；(2)服用過內(nèi)分泌藥物者；(3)患有其他腫瘤者；(4)患有精神疾病者。各組一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批，受試者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1腹膜灌洗液外泌體的獲取 患者行開腹手術(shù)后，將100 mL生理鹽水倒入道格拉斯氣袋中，并在手術(shù)切除腫瘤之前收集腹膜灌洗水。為了去除大的細(xì)胞顆粒和細(xì)胞碎片，將腹膜灌洗液在4 ℃下以2 000×g離心15 min，然后通過0.22 μm直徑的過濾器(Millipore)過濾。為了沉淀外泌體，將樣品在4 ℃條件下，以110 000×g離心70 min。將外泌體沉淀物用11 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，然后再次離心，棄上清后獲得腹膜灌洗液外泌體。

1.3RNA抽取與實時熒光定量PCR 根據(jù)制造商的說明，使用miRNeasy mini試劑盒(Qiagen)從外泌體中提取總RNA，然后將其儲存在-80 ℃直至需要進(jìn)一步分析。使用Agilent Bioanalyzer 2100(安捷倫科技公司)評估總外泌體RNA的質(zhì)量、濃度和大小。在分析之前，使用RNA 6000 Pico試劑盒(安捷倫科技公司)提取總RNA。使用TaqMan miRNA RT試劑盒進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。使用TaqMan microRNA試劑盒和ABI 7500儀器定量分析(Life科技公司)miR-21、miR-320c、miR-1225-5p、miR-16。所有反應(yīng)均重復(fù)3次。將目標(biāo)miRNA的表達(dá)水平用于miR-16的表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，將miR-16用作穩(wěn)定表達(dá)的對照。

2 結(jié) 果

2.13組患者腹腔灌洗液外泌體中miR-21、miR-320c、miR-1225-5p的相對表達(dá)水平 轉(zhuǎn)移組腹腔灌洗液外泌體中miR-21、miR-320c、miR-1225-5p的相對表達(dá)水平均高于無轉(zhuǎn)移組和對照組(P<0.05)，無轉(zhuǎn)移組與對照組腹腔灌洗液外泌體中miR-21、miR-320c、miR-1225-5p的相對表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 3組患者腹腔灌洗液外泌體中miR-21、miR-320c、 miR-1225-5p的相對水平比較

2.2患者腹腔灌洗液外泌體中miR-21、miR-320c、miR-1225-5p檢測的診斷價值 為了評估腹腔灌洗液外泌體中miR-21、miR-320c、miR-1225-5p檢測用于胃癌腹膜轉(zhuǎn)移與未轉(zhuǎn)移的鑒別診斷價值，繪制受試者工作特征(ROC)曲線。當(dāng)miR-21的cut-off值為1.116時診斷的靈敏度為93%，特異度為93%；miR-320c的cut-off值為0.690時診斷靈敏度為91%，特異度92%；miR-1225-5p的cut-off值為0.854時的診斷靈敏度為92%，特異度為91%。見表2。

表2 胃癌腹膜轉(zhuǎn)移患者與無轉(zhuǎn)移患者腹腔灌洗液外泌體中miR-21、miR-320c、miR-1225-5p檢測的診斷價值

2.3腹腔灌洗液外泌體中miR-21、miR-320c、miR-1225-5p對胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的聯(lián)合診斷 確診為胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的患者為真陽性，未患有胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的為真陰性。以miR-21的陽性臨界值為1.116、miR-320c的陽性臨界值為0.690、miR-1225-5p的陽性臨界值為0.854為診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行聯(lián)合診斷，三者滿足其一者為聯(lián)合診斷陽性，反之則為聯(lián)合診斷陰性。腹腔灌洗液外泌體中miR-21、miR-320c、miR-1225-5p聯(lián)合對胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的診斷的靈敏度為94.25%(82/87)，特異度為90.99%(192/211)，準(zhǔn)確性為91.95%(274/298)，見表3。

表3 腹腔灌洗液外泌體中miR-21、miR-320c、miR- 1225-5p對胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的聯(lián)合診斷(n)

3 討 論

即使有R0切除，伴有漿膜浸潤的胃癌的預(yù)后仍然很差，原因在于其復(fù)發(fā)率很高，尤其是腹膜轉(zhuǎn)移[7]。胃癌并發(fā)腹膜轉(zhuǎn)移是最復(fù)雜的胃癌復(fù)發(fā)類型，因為它既難以預(yù)測也難以診斷。盡管腹水是最常見的胃癌并發(fā)腹膜轉(zhuǎn)移癥狀，但許多患有腹膜轉(zhuǎn)移的胃癌患者并未出現(xiàn)腹水[8]。在基于影像的診斷方法中，高速螺旋CT被廣泛用于評估胃癌的術(shù)前分期和治療后的隨訪[9]。然而，在腹膜轉(zhuǎn)移的情況下，其診斷準(zhǔn)確性不足，主要是因為靈敏度低[10]。使用PET-CT在胃癌中進(jìn)行腹膜轉(zhuǎn)移診斷也存在爭議，因為據(jù)報道FDG-PET對胃癌中腹膜轉(zhuǎn)移的檢測靈敏度較差[11-12]。腹腔灌洗液已成為診斷和預(yù)測胃癌中腹膜轉(zhuǎn)移的下一個目標(biāo)。術(shù)中收集的腹腔灌洗液的細(xì)胞學(xué)檢查可用于預(yù)測腹膜復(fù)發(fā)，且在日本曾用于胃癌分期[13]。但是，有研究報道，腹腔灌洗液細(xì)胞學(xué)不能顯示出預(yù)測和檢測腹膜轉(zhuǎn)移所需的敏感性，并建議使用分子診斷方法(例如實時熒光定量PCR)來檢測腹膜轉(zhuǎn)移中的微轉(zhuǎn)移[14]。在一項多中心的前瞻性研究中，通過實時熒光定量PCR評估了編碼癌胚抗原(CEA)和細(xì)胞角蛋白20(CK-20)的基因的mRNA表達(dá)，可用于預(yù)測胃癌的總體存活率和腹膜轉(zhuǎn)移[15]。然而，基于mRNA的診斷方法的缺點是在外科手術(shù)過程中mRNA的高度可降解性。相反，包裹在外泌體中的miRNA保持穩(wěn)定并可以在體液中循環(huán)很長時間，這些體液包括血清、血漿、唾液、尿液、母乳和眼淚。因此，腹腔灌洗液外泌體中的miRNA具有較高的診斷價值。

本研究發(fā)現(xiàn)胃癌腹膜轉(zhuǎn)移患者腹腔灌洗液外泌體中miR-21、miR-320c、miR-1225-5p的相對表達(dá)水平均高于胃癌非腹膜轉(zhuǎn)移患者和胃癌預(yù)后良好患者(P<0.05)，胃癌非腹膜轉(zhuǎn)移患者與胃癌預(yù)后良好患者腹腔灌洗液外泌體中miR-21、miR-320c、miR-1225-5p的相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。因此，腹膜轉(zhuǎn)移特異性的miRNA，這種特異性可讓其成為潛在的生物標(biāo)志物。FABBRI等[16]報道，癌癥釋放外泌體中的miR-21和miR-29a通過與周圍免疫細(xì)胞中的TLRs結(jié)合并激活以及誘導(dǎo)促轉(zhuǎn)移性炎性反應(yīng)，影響腫瘤的生長和擴(kuò)散。這支持了腫瘤來源的外泌體有助于轉(zhuǎn)移前微環(huán)境形成的觀點。這表明癌細(xì)胞來源的外泌體有助于在腹膜中形成轉(zhuǎn)移前小生境，從而支持胃癌根治性切除術(shù)后腹膜浸潤。miR-1225-5p靶向作用于多囊腎病基因PKD1，該基因在常染色體顯性多囊腎病中經(jīng)常突變[17]。因此，miR-1225-5p可能影響該病的進(jìn)展。然而，miR-1225-5p與癌癥的關(guān)系尚不清楚。miR-21和miR-1225-5p有助于在腹膜中為轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞的擴(kuò)散和沉降構(gòu)建一個轉(zhuǎn)移前小龕，因此可能造成治療性胃癌切除術(shù)后腹膜轉(zhuǎn)移的易發(fā)性。

綜上所述，腹腔灌洗液外泌體中miR-21、miR-320c、miR-1225-5p的表達(dá)水平檢測可作為診斷胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的潛在方法，有助于采取更有效的預(yù)防和治療措施。