謝騰，劉華明，李斌，張純偉，羅寶昌，袁紅剛，喻小平，劉文，黃志軍

(湖北省漢川市人民醫(yī)院/武漢大學(xué)人民醫(yī)院漢川醫(yī)院神經(jīng)外科，湖北 漢川 431600)

0 引言

高血壓腦出血是一種常見的，危害極大的腦血管疾病。作為腦卒中高發(fā)國家，我國高血壓腦出血年發(fā)病率高達(dá)50.6/10萬～80.7/10萬。位居我國老年人三大死亡原因之首[1]。然而，到目前為止高血壓腦出血缺乏根本有效的治療方法。血腫周圍腦水腫的形成與發(fā)展是腦出血患者病情惡化、致殘、致死的主要原因，也是評(píng)估腦出血患者神經(jīng)功能預(yù)后的可靠指標(biāo)[2]。研究表明，腦出血后紅細(xì)胞崩解所釋放的血紅蛋白(Hb)可能是導(dǎo)致血腦屏障損傷的重要病理介質(zhì)之一，能夠誘導(dǎo)、加重腦水腫形成，但是其潛在的分子機(jī)制仍不明確。一氧化氮(NO)是一種具有雙重作用的調(diào)節(jié)分子，由一氧化氮合酶 (主要包括神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS))以L-精氨酸為底物合成。在氧化應(yīng)激情況下，NO與超氧陰離子(O2-)所形成的代謝產(chǎn)物過氧化亞硝酸鹽(peroxynitrite)是一種毒性大、破壞性極強(qiáng)的氧化硝化產(chǎn)物。在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如腦缺血、腦栓塞、創(chuàng)傷性腦損傷及急性細(xì)菌性腦膜炎中，大量產(chǎn)生的peroxynitrite可導(dǎo)致明顯的血腦屏障破壞、腦水腫形成及神經(jīng)功能缺損。然而，高血壓腦出血后Hb對(duì)NO/ peroxynitrite的影響仍不明確。本研究擬探討高血壓腦出血后Hb對(duì)NO、Peroxynitrite的影響及臨床意義，為今后高血壓腦出血的治療提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑、儀器和動(dòng)物

血紅蛋白(美國sigmal公司，批號(hào)：H7379)，一氧化氮檢測試盒(硝酸還原酶法，南京建成生物工程研究所)，鼠抗3-硝基酪氨酸抗體(美國Abcam公司)，兔抗claudin-5(美國Novus公司)，驢抗鼠熒光二抗-594(美國Invitrogen公司)，3-硝基酪氨酸Elisa檢測試劑盒(美國Abcam公司)，GAPDH(美國CST公司)(大鼠多功能腦立體定向儀(美國Stoelting公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，石蠟切片機(jī)(德國Leica公司)，多功能酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)，激光共聚焦熒光顯微鏡及成像系統(tǒng)(日本OLYMPUS公司)。SPF級(jí)健康成年雄性SD大鼠140只，體質(zhì)量280～300 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及模型制作

按隨機(jī)數(shù)字表法將SD大鼠分為假手術(shù)(Sham)組和高血壓腦出血(HICH)組，每組按觀察時(shí)間不同再分為6h、12h、1d、2d、3d和7d 共6個(gè)亞組。動(dòng)物模型建立：參照Zeng等[3]方法制備大鼠高血壓腦出血模型。用內(nèi)徑0.2 mm的銀夾狹窄雙側(cè)腎動(dòng)脈造成大鼠腎血管性高血壓，術(shù)后60d形成穩(wěn)定的高血壓后，在立體定位下向腎血管性高血壓大鼠右側(cè)尾狀核(前囟前0.2 mm，矢狀縫右3.0 mm，深6mm) 緩慢勻速注入20uL血紅蛋白(濃度：150g/L)，誘導(dǎo)腎血管性高血壓腦出血大鼠模型。造模后大鼠左側(cè)前肢回收屈曲，右側(cè)前肢伸展；向左側(cè)推大鼠時(shí)阻力較右側(cè)降低；有向左側(cè)旋轉(zhuǎn)的行為。判斷為造模成功，否則為失敗。假手術(shù)組大鼠按同法造成腎血管性高血壓后，向右側(cè)尾狀核內(nèi)注入等量生理鹽水。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 ELisa法檢測腦組織及血清中3-硝基酪氨酸變化

麻醉大鼠后，打開胸腔，心臟穿刺抽取2mL全血，室溫下靜置2h，離心(4000轉(zhuǎn)，10min)取上清，儲(chǔ)存于-80℃冰箱備用。同時(shí)，斷頭取腦，取Hb損傷處周圍腦組織約100mg，加入等量生理鹽水搗碎、勻漿，3000 轉(zhuǎn)離心30min取上清，同法儲(chǔ)存?zhèn)溆?。Elisa檢測方法如下：往預(yù)先包被3-NT抗體的微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌，然后底物TMB顯色。用多功能酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度(OD)值，計(jì)算樣品濃度。

1.3.2 硝酸還原酶法檢測腦組織及血清中NO含量

血清及腦組織制備方法同Elisa檢測。按照硝酸還原酶法測定血清和腦組織中NO水平。采用BCA法測定腦組織中的蛋白濃度。血清中NO含量表示為μmol/L，腦組織中NO含量表示為μmol/gprot。

1.3.3 免疫熒光檢測3-硝基酪氨酸的表達(dá)、細(xì)胞定位及其與緊密連接蛋白claudin-5的位置關(guān)系

石蠟切片制作：麻醉大鼠后并固定，先后用生理鹽水和4%多聚甲醛溶液行心臟灌注。切取損傷處腦組織，于4%多聚甲醛溶液中浸泡24h后，按照常規(guī)石蠟包埋法制成石蠟標(biāo)本并切片，切片厚度為3-5μm，撈片、風(fēng)干后備用。免疫熒光檢測：石蠟切片脫蠟至水，在檸檬酸緩沖液(0.01 mol/L)中給予微波熱修復(fù)25-30min，血清封閉后滴加一抗，4℃孵育12-24h，PBS溶液沖洗后滴加相應(yīng)熒光二抗，37℃孵育1h。熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡下觀察、拍照、分析。熒光雙染(3-Nitrotyrosine與CD68；3-Nitrotyrosine與Claudin-5)時(shí)，兩種一抗混勻后再孵育，相應(yīng)的熒光二抗也需混勻孵育。

1.3.4 Westernblot法檢測腦組織中緊密連接蛋白claudin-5的表達(dá)變化

大鼠深度麻醉后，斷頭取腦，取Hb損傷處及周圍腦組織約100mg，-80℃冰箱或液氮中保存?zhèn)溆?。組織標(biāo)本經(jīng)勻漿、裂解、超聲破碎、離心后，采用Bradford法蛋白定量。蛋白裂解液依次經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育一抗(claudin-5：1:800)及二抗、顯影及定影。GAPDH(1:1000)作為內(nèi)參。凝膠成像系統(tǒng)掃描并分析claudin-5蛋白表達(dá)變化。

1.3.5 腦組織水含量測定

在不同時(shí)間點(diǎn)深度麻醉大鼠、斷頭取腦，沿中線切開左右兩側(cè)大腦半球，去除小腦和腦干后，用電子分析天平稱量造模側(cè)鼠腦半球濕重。將腦組織放入烤箱中烘烤(100℃，持續(xù)24h)，再次用電子天平稱其干重。腦組織含水量(%)=[(濕重—干重)/濕重]×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用ONE-WAY方差分析，多重比較用LSD-t檢驗(yàn)或Dunnett’s T3檢驗(yàn)。3-NT水平與腦水含量和神經(jīng)功能缺損之間的相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)分析，以*P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同時(shí)間點(diǎn)腦組織中腦水含量的變化

與Sham相比，HICH組高血壓大鼠腦水含量從6h開始逐漸升高，24h達(dá)到最大值，維持在較高水平直至3d，后逐漸下降。HICH組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)腦水含量均明顯高于Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，如表1所示。(不同時(shí)間點(diǎn)的Sham組中，腦水含量變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05)。

表1 術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)兩組大鼠腦水含量變化 (mean ± SD)

2.2 不同時(shí)間點(diǎn)血清及腦組織中NO水平變化

Sham 6h組和HICH組各時(shí)間點(diǎn)血清及腦組織中NO水平變化見表2。HICH組血清中NO在6h開始下降，12h明顯降低，隨后24h至48h又相對(duì)增加但仍低于假手術(shù)組；在3d時(shí)降至最低，而7天時(shí)又有所回升。與Sham 6h相比，HICH組12h、24h、48h、3d和7d時(shí)血清中NO含量均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而腦組織中NO在6h也開始下降，但12h時(shí)開始升高，3d時(shí)達(dá)到最高值，而在7d時(shí)又明顯下降但仍高于Sham 6h組。與Sham 6h組相比，HICH組12h、24h、48h和3d腦組織中NO含量均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 不同時(shí)間點(diǎn)血清及腦組織中peroxynitrite水平變化

由于過氧化亞硝酸鹽(peroxynitrite)具有不穩(wěn)定性，3-nitrotyrosine(3-NT)可作為peroxynitrite產(chǎn)生可靠的生物學(xué)標(biāo)志[4]。如表2所示，Elisa檢測結(jié)果提示HICH注入后6h高血壓大鼠血清中的3-NT水平開始增加，后逐漸上升，在第48h達(dá)到峰值，然后逐漸下降；而腦組織中的3-NT水平呈現(xiàn)相同的趨勢，不同的是其在第3d達(dá)到峰值。不同HICH組血清和腦組織中的3-NT水平與Sham 6h組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此外，免疫熒光觀察顯示腦組織中3-NT也呈現(xiàn)相似的表達(dá)趨勢(如圖1所示)；熒光雙染顯示3-NT主要表達(dá)在CD68陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中，如圖2所示。

圖1 高血壓腦出血(HICH)后不同時(shí)間點(diǎn)3-NT的表達(dá)

圖2 3-硝基酪氨酸(3-NT)的細(xì)胞定位

表2 各組高血壓腦出血大鼠中腦組織和血清中NO、3-NT水平比較(mean±SD)

2.4 緊密連接蛋白claudin-5的表達(dá)、分布變化及其與3-NT的位置關(guān)系

Claudin-5與3-NT熒光雙標(biāo)顯示(圖3A)，在Sham 3d組中，表達(dá)完整、連續(xù)的claudin-5血管周圍無明顯的3-NT表達(dá)；而在HICH 3d組中，血腫周圍腦組織血管壁上claudin-5表達(dá)、分布明顯減少，而其毗鄰部位卻發(fā)現(xiàn)大量密集的3-NT產(chǎn)生。此外，WesternBlot結(jié)果也提示，在HICH 3d，血腫周圍組織中緊密連接蛋白claudin-5表達(dá)也明顯減少(圖3B)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示3-NT的形成與血腦屏障破壞之間可能存在緊密聯(lián)系。

圖3 A Sham 3d組和HICH 3d組中3-NT與Claudin-5的熒光雙標(biāo)(標(biāo)尺=30um)

圖3 B Westernblot檢測Sham 3d組和HICH 3d組中Claudin-5的表達(dá)水平

2.5 相關(guān)性分析

不同時(shí)間點(diǎn)HICH大鼠腦水含量變化與腦組織中3-NT含 量 變 化(r=0.771，P=0.001，4A)和 血 清 中3-NT水 平 變化(r=0.824，P=0.001，4B)之間均有顯著正相關(guān)性。不同時(shí)間點(diǎn)HICH大鼠腦水含量變化與腦組織中NO含量變化之間也存在顯著正相關(guān)性(r=0.592，P=0.001，4D)，而與血清中NO水平變化之間則存在一定的負(fù)相關(guān)性(r=-0.327，P=0.034，4E)。不同時(shí)間點(diǎn)HICH大鼠血清中3-NT含量變化與腦組織中的3-NT水平有顯著的正相關(guān)性(r=0.922，P=0.001，圖4C)。

圖4 不同指標(biāo)間相關(guān)性分析

3 討論

高血壓腦出血(HICH)是最常見的腦血管病之一，也是神經(jīng)外科最常見的急危癥之一[5]。在我國，高血壓腦出血約占急性腦血管病的20%—30%，其致死率和致殘率均占腦血管病患者的首位[6]。腦水腫的形成是腦出血后最嚴(yán)重的并發(fā)癥，而且相對(duì)增加的水腫程度被認(rèn)為是可靠的預(yù)測神經(jīng)功能缺損指標(biāo)[7]。報(bào)道顯示，紅細(xì)胞崩解所產(chǎn)生的Hb能夠誘導(dǎo)、加重腦水腫形成[8]，但是其潛在的分子機(jī)制仍不明確。

一氧化氮(NO)是一種具有雙重作用的調(diào)節(jié)分子，既有神經(jīng)血管保護(hù)功能，也可發(fā)揮神經(jīng)毒性作用，主要取決于其來源、濃度以及周圍微環(huán)境中的氧化還原狀態(tài)。據(jù)Chiang報(bào)道，在腦出血患者腦脊液中NO含量明顯升高且與臨床預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[9]。而Rashid等證實(shí)在急性中風(fēng)患者中，血漿NO水平是降低的，且其降低的程度與中風(fēng)的嚴(yán)重程度和預(yù)后密切相關(guān)[10]。我們的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，高血壓腦出血大鼠腦組織中的NO含量在多數(shù)時(shí)間點(diǎn)呈現(xiàn)升高趨勢，而血清中NO水平在不同時(shí)間點(diǎn)卻大部分是降低的。其主要原因可能是：(1)高血壓本身可導(dǎo)致內(nèi)皮功能不良及內(nèi)皮來源的NO合成減少[10]； (2)NO與血液中的氧合血紅蛋白結(jié)合而被清除或被血管中的中性粒細(xì)胞消耗所致[11]；(3)在氧化應(yīng)激情況下，激增的活性氧和活性氮類代謝產(chǎn)物Peroxynitrite不僅可消耗大量NO(本實(shí)驗(yàn)中大鼠腦組織和血清中的Peroxynitrite水平均明顯增加)而且可明顯抑制eNOS或iNOS表達(dá)與活化[12-14]；(4)異常的或脫偶聯(lián)eNOS直接產(chǎn)生O2-與血液中的NO反應(yīng)產(chǎn)生Peroxynitrite所致[12]。此外我們也發(fā)現(xiàn)，高血壓腦出血大鼠腦組織中的NO產(chǎn)生水平與大鼠腦出血后腦水含量之間有明顯的正相關(guān)性；而血清中的NO產(chǎn)生水平與大鼠腦水含量之間則存在一定的負(fù)相關(guān)性，與前人研究結(jié)果基本一致[9,10]。由此我們可知，高血壓腦出血后血清中NO水平不一定與腦組織的NO水平一致。

在氧化應(yīng)激情況下，NO與超氧陰離子(O2-)結(jié)合可迅速產(chǎn)生過氧化亞硝酸鹽(peroxynitrite)。近年來，越來越多的證據(jù)顯示：NO的細(xì)胞毒性作用主要取決于Peroxynitrite的形成[4]；此外也有研究提示：peroxynitrite可能是真正介導(dǎo)腦出血后持續(xù)性腦損傷的原因[15,16]。其主要理由是：Peroxynitrite具有很強(qiáng)的特異性的反應(yīng)性以及具有強(qiáng)大的侵襲能力(主要表現(xiàn)為高的擴(kuò)散率和高的細(xì)胞膜穿透率)[17,18]。據(jù)報(bào)道，Peroxynitrite滲透系數(shù)比超氧化物快約400倍，在其被質(zhì)子化或者清除前，它可以對(duì)其周圍6個(gè)細(xì)胞直徑范圍內(nèi)的微環(huán)境產(chǎn)生損傷性影響[17]。腦出血后腦水腫的形成主要包括細(xì)胞毒性水腫和血管源性水腫。相似地是，Peroxynitrite也涉及上述兩種類型的水腫形成，主要解釋如下：(1) Peroxynitrite可直接激活MMP-9或通過硝化修飾MMP-2的半胱氨酸殘基導(dǎo)致其活化，從而間接破壞BBB，導(dǎo)致血管源性腦水腫[19,20]； (2) Peroxynitrite能夠硝化細(xì)胞色素C還原酶(復(fù)合體Ⅲ)和ATP合酶(復(fù)合體Ⅴ)等，從而損傷細(xì)胞的能量代謝；此外，Peroxynitrite能夠修飾Na-K-ATP酶的半胱氨酸殘基，抑制Na-K-ATP酶的活性，從而導(dǎo)致胞漿離子失衡及伴隨的細(xì)胞毒性腦水腫[4]。在我們的研究中，Hb注入高血壓大鼠腦內(nèi)后，腦水含量從6h開始增加，24h達(dá)到最大值，維持在較高水平直至3-7d，后逐漸下降。有趣地是，高血壓大鼠腦出血后，腦組織中3-NT水平變化與腦水含量之間具有明顯的相關(guān)性。此外，熒光雙標(biāo)分析顯示，HICH后3d，3-NT表達(dá)明顯的部位，毗鄰血管表達(dá)的claudin-5則明顯減少，這表明peroxynitrite的產(chǎn)生可能是導(dǎo)致BBB破壞的主要原因之一，而BBB的破壞則可加重腦水腫的形成。研究證實(shí)，通過peroxynitrite清除劑FeTPPS清除腦出血后產(chǎn)生的過多peroxynitrite，可明顯抑制血腫周圍MMP-9的活化，改善腦出血后神經(jīng)血管損傷[21]。因此，我們推測Peroxynitrite很可能是高血壓腦出血后Hb介導(dǎo)腦水腫形成的主要原因。

大量的證據(jù)顯示，在多種繼發(fā)性中樞神經(jīng)損傷中，Peroxynitrite可導(dǎo)致BBB破壞、內(nèi)皮功能失調(diào)、神經(jīng)元及膠質(zhì)毒性等。通過抑制或清除Peroxynitrite，可以逆轉(zhuǎn)或減輕其損害作用，如改善BBB通透性增加，減輕腦水腫形成及改善神經(jīng)功能缺損等[12,21,22]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，高血壓腦出血大鼠血清中3-NT在不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)水平與腦組織中的3-NT水平有明顯的相關(guān)性。更有意義地是，血清中的3-NT水平與腦水含量的變化之間也具有顯著的相關(guān)性。因此，我們推測Peroxynitrite可能是一個(gè)可靠的判斷HICH后腦水腫嚴(yán)重程度的生物學(xué)指標(biāo)。