黃勇，范奇琪，傅君

(寧波市婦女兒童醫(yī)院 婦產科，浙江 寧波 315012)

0 引言

探尋EAOC的發(fā)病機制，明確治療靶向是提高EAOC質量效果的關鍵。微小RNA(miRNA)是一類長22nt的非編碼RNA，通過靶向結合在目的基因的3’UTR區(qū)域，在轉錄后水平抑制其表達，進而調控下游一系列的基因表達，參與了機體內發(fā)育、增殖、分化和凋亡等眾多生物學進程[1]。既往研究表明，作為致癌微小miRNA之一，微小核糖核酸21(miR-21)在胃癌、肺癌、腎癌等多種惡性腫瘤組織中呈高表達。程序性細胞死亡基因(pmgrammed ceu death 4，PDCD4)是miR-21具有重要生物學功能的靶基因之一，與癌細胞的凋亡、轉移有關[2]。本研究探討miR-21/PDCD4調控環(huán)路在EAOC患者中的表達，為EAOC的臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

2015年7月至2019年10月我院手術的EAOC患者共30例，年齡34～65歲，平均(52.1±13.3)歲，均為首次手術，未行放療、化療、激素、生物免疫治療。所有患者標本均經病理學確診并按照WHO標準及國際婦產科聯(lián)盟標準(FIGO，2009年)進行組織學分級和手術-病理分期：低分化9例，中分化11例，高分化10例；Ⅰ-Ⅱ期14例，Ⅲ-Ⅳ期16例。對照采用同期30例因子宮肌瘤行子宮切除術患者的正常卵巢組織。年齡33～67歲，平均年齡(51.1±12.7)歲。

1.2 實驗試劑

Trizon Reagent(CW0580S，CWBIO 康 為 世 紀)；miRNA Purification Kit 提取試劑盒(CW0627S，CWBIO 康為世紀)。PDCD4引物及探針通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成。

1.3 實驗設備

-80℃冰箱(BDF-86V348，BIOBASE)；移液槍(eppendorf)；低溫高速離心機(5424R，Eppendorf)；旋渦混合器(XH-C，常州越新儀器制造有限公司)；紫外分光光度儀(NP80，NanoPhotometer)；干式電加熱器(GL-150，海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.4 收集組織樣本

30例EAOC組織樣本由寧波寧波市婦女兒童醫(yī)院提供。同時選取同期30例因子宮肌瘤行子宮切除術患者的正常卵巢組織，病理分析為正常卵巢組織。所有標本均置于液氮內保存。

圖3 miR-21mRNA溶解曲線圖

1.5 提取總RNA

將凍存于-80的gEAOC組織拿出，取50-100mg于液氮低溫條件下研磨，加入至盛有1mL Trizol的1.5mL EP管中。超聲破碎，充分溶解，震蕩30s，室溫放置 5min 12000×g 低溫離心10min，棄沉淀。加0.2mL氯仿，上下?lián)u動30s，室溫孵育5-10min。12000×g，4℃離心，15min。吸上層無色水相，移入另一EP管中。加等體積異丙醇沉淀RNA，顛倒混勻2～3次后室溫放置10min。12000×g，4℃離心，10min。棄上清，加冰預冷75%乙醇1mL，溫和振蕩，懸浮沉淀。7500×g，4℃離心，5min。棄上清，重復洗滌后，室溫干燥5-10min。溶沉淀于20μlDEPC水中，測定濃度與純度。

1.6 進行逆轉錄反應

(1)將離心管插入干式電加熱器中，先在25℃條件下保持5min，然后轉到50℃條件下保持15min，最后在85℃條件下保持5min(如果模板具有復雜二級結構或高GC區(qū)域，可將反應溫度提高至55℃，有助于提高產量)。(2)產物可立即用于QPCR反應，或在20℃保存，并在半年內使用；長期存放建議分裝后在-80℃保存。cDNA應避免反復凍融。實驗獲得采用比較CT值法(2-△△Ct 法)。分別計算EAOC組織與正常卵巢組織的△Ct值計算公式：改變的倍數(shù)=2-△△Ct；△Ct試驗=Ct目的-Ct內參；△Ct對照=Ct目的-Ct內參。

1.7 引物合成公司

通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司，見表1。

表1 miR-21-5p/U6引物序列

1.8 統(tǒng)計學方法

采用 SPSS 19.0進行檢驗，計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，兩均數(shù)的比較用t檢驗。P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 EAOC組織與正常卵巢組織miR-21/PDCD4表達水平比較

RT-PCR檢測結果顯示，EAOC組織中miR-21表達水平明顯高于正常卵巢組織，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與正常卵巢組織比較，EAOC組織中PDCD4表達水平明顯下調，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 EAOC組織與正常卵巢組織miR-21/PDCD4表達水平比較

2.2 PCR結果圖片

擴增曲線顯示對數(shù)期階段模版拷貝數(shù)與熒光累計值之間存在線性關系。溶解曲線辨明miR-21均為單峰，擴增產物單一，引物具有特異性和可信性。見圖2-3。

圖2 miR-21mRNA擴增曲線圖

2.3 EAOC組織中miR-21/PDCD4 表達與臨床病理特征的關系

EAOC組織中miR-21mRNA、PDCD4 mRNA表達與患者年齡、是否絕經、病理類型無關(P>0.05)。miR-21mRNA表達與EAOC組織患者FIGO分期、是否轉移有關(P<0.05)。PDCD4 mRNA表達與EAOC組織患者FIGO分期、分化程度否轉移有關(P<0.05)。見表2。

表2 EAOC組織中miR-21/PDCD4 表達與臨床病理特征的關系

3 討論

miR-21是microRNA家族中的一個亞型，其具有自主轉錄單位的miR-NA，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)，在多種癌組織活檢樣本中miR-21過度表達[3-4]，且預示乳腺癌、結腸癌患者的進展與預后[5-6]。miR-21可能作為腫瘤診斷、預后的重要標志物。qRT-PCR檢測結果顯示，EAOC組織中miR-21表達水平明顯高于正常卵巢組織，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，miR-21隨著腫瘤分期的增高呈上調趨勢。擴增曲線顯示對數(shù)期階段模版拷貝數(shù)與熒光累計值之間存在線性關系。溶解曲線辨明miR-21均為單峰，擴增產物單一，引物具有特異性和可信性。

PDCD4 是一種新的抑癌基因，在多種惡性腫瘤組織中PDCD4 呈下降或缺失表達。Ma等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在消化道腫瘤中低分化的PDCD4表達水平明顯低于高分化組。還有研究發(fā)現(xiàn)，PDCD4的表達下降或缺失與腫瘤的不良預后相關[8]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，PDCD4在EAOC組織和正常卵巢組織中表存在顯著差異。本研究還顯示PDCD4 mRNA與EAOCFIGO分期、分化程度、轉移有關。FIGO分期越高PDCD4的表達越低；分化程度越低PDCD4的表達越低；有淋巴結轉移的PDCD4表達低于無淋巴結轉移。表明PDCD4的表達減少或缺失與EAOC的分期分化、轉移有明顯的關系[9-11]。

本研究EAOC組織中miR-21表達水平明顯高正常卵巢組織，PDCD4表達水平明顯下調，與EAOC的發(fā)生、轉移密切相關，miR-21mRNA與PDCD4 mRNA是EAOC發(fā)生、發(fā)展中的一對具有重要意義的癌基因和抑癌基因，有助于EAOC的診斷及分期。